單克隆抗體技術及其應用

單克隆抗體技術及其應用

單克隆抗體技術簡介一二三四五單克隆抗體的制備過程

基因工程抗體制備技術鼠源抗體人源化六七抗人CD3抗體基本來源基因工程抗體的廣泛應用已批準上市的治療性單抗

培訓大綱1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴細胞雜交瘤技術，兩人由此杰出貢獻而榮獲1984年度諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。單克隆抗體（monoclonalantibody）：針對預定抗原的同一抗原決定簇的，高度同質的，且能保證無限量供應的抗體。單克隆抗體技術的理論依據(jù)：抗體的多樣性、克隆選擇學說、抗體基因的重排理論、抗體結構與生物合成機制。一.單克隆抗體技術簡介骨髓瘤細胞（SP2/O-Ag14

）：1.1單克隆技術的原理喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（hypoxanthineguanosinephosphoribosyltransferase，HGPRT－）無法在HAT選擇培養(yǎng)劑中生長能無限地快速增殖既不合成輕鏈又不合成重鏈小鼠脾細胞（B-Cell

）：合成和分泌特異性抗體無法進行體外長期培養(yǎng)脾細胞－SP2/O融合細胞：HGPRT＋，能在HAT選擇培養(yǎng)劑中生長能無限地快速增殖合成和分泌特異性抗體HAT次黃嘌呤，甲氨喋呤，胸腺嘧啶核苷二.單克隆抗體的制備過程

2.1單克隆抗體制備過程的注意事項嚴格進行無菌操作，防止污染（細菌、霉菌、支原體、細胞）根據(jù)實驗的目標及時進行細胞的檢測與篩選，（ELISA、(酶聯(lián)免疫吸附實驗)IFA（時間分辨免疫熒光）、凝集、中和…）對篩選得到的陽性細胞克隆進行早期單克?。ㄓ邢尴♂尫ǎ┰趩慰寺〖毎ㄖ赀^程中不定期驗證檢測防止單克隆細胞過度生長——老化死亡

細胞融合的方法：1、仙臺病毒，2、PEG/DMSO，3、電融合2、治療試劑病毒等微生物的中和抗體抗毒素—蛇毒、破傷風毒素，等被動免疫治療制劑“生物導彈”，腫瘤治療等

3、分子生物學研究工具蛋白質等生物活性分子的純化；細胞生物學——組織定位；分子病毒學——結構分析；特定生物分子的功能研究；1、免疫學快速診斷試劑（抗體）細菌病毒腫瘤因子特定蛋白農殘檢測等

診斷技術方法：ELISA（間接法、夾心法、競爭法）免疫熒光法膠體金放射免疫法???

???2.2.單克隆抗體技術的應用BDAC污染：培養(yǎng)環(huán)境、操作抗體分泌不足：支原體污染、細胞突變、

培養(yǎng)體系有問題融合細胞不生長：PEG、血清、HAT培養(yǎng)基雜交瘤細胞難以克隆化：血清質量、細胞活性2.3單抗制備常見問題三.基因工程抗體制備技術鼠源抗體人源化0102小分子抗體

03抗體融合蛋白3.1.單抗人源組分的分類01020304鼠源單抗就是指鼠分泌的抗體，其所有序列都是鼠的，注射人體易產生人抗鼠反應(即HAMA反應)。嵌合單抗重點解釋人源化單抗就是通過測定鼠源抗體的序列，截取其決定簇互補區(qū)的序列移植到人抗體的編碼框中表達，并經過一定的親和力測試和篩選，最終選出仍然具有特異性識別能力的單抗。全人源單抗目前主要是通過轉基因小鼠以及噬菌體展示文庫制備的抗體，其重鏈和輕鏈都是來源于人，因此副作用更小，免疫親和力基本保持不變，是未來的主流技術。目錄抗體制備特異性高質量穩(wěn)定成本低廉工藝簡單異源性低穿透性好功能豐富原核表達抗體人源化小分子抗體雙功能抗體易于改造親和力成熟產業(yè)化3.2基因工程抗體優(yōu)點抗體名稱抗體種類 靶向抗原

適應癥

批準日期

OKT3

鼠單抗 CD3

移植排斥1986

Panorex

鼠單抗 17-1A

大腸癌

1995

ReoPro

人-鼠嵌合Fab血小板受體

冠心病

1994Rituxan人-鼠嵌合抗體CD20

淋巴瘤

1997

Simulect

人-鼠嵌合抗體CD25

移植排斥

1998

Remicade

人-鼠嵌合抗體TNF-α

炎癥性腸病、

1998

類風濕關節(jié)炎

1999Zanapax

人源化抗體CD25

移植排斥

1997

Herceptin

人源化抗體HER-2

乳腺癌

1998

Synagis

人源化抗體RSVF蛋白

RSV感染1998

Mylotarg

人源化抗體-CD33

淋巴瘤

2000

Campath

人源化抗體CD52

淋巴瘤

2001

四.已批準上市的治療性單抗就是利用DNA重組技術把鼠單抗的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體的恒定區(qū)域的表達載體中，并轉入合適的宿主表達出來的抗體。這樣抗體即具有識別抗原的特異性，又減少了抗體的人抗鼠反應。

嵌合抗體一.

改型抗體二.指利用基因工程技術，將人抗體可變區(qū)（V）中互補性決定區(qū)（CDR）AA序列改換成鼠源單抗CDR序列，重構成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。五.鼠源抗體人源化可變區(qū)基因的克隆表達載體的構建嵌合抗體的表達5.1嵌合抗體5.2嵌合抗體抗體制備簡易圖

六.抗人CD3抗體基本來源關系圖譜1.CD3分子是T細胞的重要標志，由γ、δ、ε、ζ和η五種多肽鏈組成，它們的胞漿區(qū)均含有ITAM，具有傳導TCR信號的功能，使T細胞活化。2.從外周血、骨髓或臍血中分離出的單個核細胞在CD3單克隆抗體和多種細胞因子存在的條件下，經過一定時間培養(yǎng)可以獲得具有腫瘤細胞殺傷活性的CIK（Cytokine-inducedKiller）細胞6.1抗人CD3抗體與免疫細胞1.在腫瘤治療方面的應用:單抗藥物抗腫瘤能有效地降低傳統(tǒng)腫瘤藥物治療的不良反應。如2005年我國開發(fā)出癌癥治療藥——重組人源化抗人表皮生長因子受體單克隆抗體(商品名：泰欣生)。泰欣生聯(lián)合放療治療鼻咽癌的完全緩解率比單純放療的患者提高30%以上。2.在器官移植中的應用:近年來,利用抗體藥物作為實體器官移植的誘導治療逐漸增加。如1986年批準進入美國市場的治療性抗體類藥物抗CD3單抗即被用于腎、心臟、肝臟移植排斥的逆轉。3.在心血管疾病方面的應用：美國FDA于1994年批準了第一個人-鼠嵌合Fab抗體的上市，該抗體現(xiàn)已被廣泛應用于多種心血管疾病治療,主要用于預防冠狀動脈成形術后的再狹窄4.在自身免疫性疾病方面的應用:現(xiàn)有的研究表明,抗體對類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、牛皮癬、多發(fā)性硬化、硬皮病、潰瘍性結腸炎等療效較好。。。。。七.基因工程抗體的廣泛應用所以可行的方法就是在完善人抗體技術的同時，推進治療性小分子抗體衍生物的研究，根據(jù)臨床的實際設計靈活有效的治療方案，使人源化抗體和小分子抗體互為補充。7.1單抗未來發(fā)展的方向0102抗體人源化以及完全人源化抗體的制備已經成為當今治療性抗體的發(fā)展趨勢，同時，各種抗體衍生物免疫原性低、更易通過血管壁到達病源，通過PEG化等方法可以延長其半衰期；03人抗體是否可以解決鼠抗體運用中出現(xiàn)的所有問題，還有待大量臨床試驗的檢驗。01減少降低了機體的免疫