化妝品舒緩功效測試方法-基于 Poly-C和LPS誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥因子（IL-8）體外檢測方法

ICS71.100.70Y42T/ZHCAxxx-2023化妝品舒緩功效測試方法——基于PolyI:C+LPS誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥因子(IL-8)體外測試方法Invitrotestmethodofinflammatorycytokines(IL-8)basedonkeratinocytesinducedbyPolyI:CandLPS（征求意見稿）2023-xx-xx發(fā)布2023-xx-xx實施浙江省健康產(chǎn)品化妝品行業(yè)協(xié)會發(fā)布T/ZHCAxxx—xxxx前??言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由浙江省食品藥品檢驗研究院提出。本文件由浙江省健康產(chǎn)品化妝品行業(yè)協(xié)會（ZHCA）歸口。本文件起草單位：浙江省食品藥品檢驗研究院、廣東博溪生物科技有限公司、上海微譜檢測科技集團(tuán)股份有限公司、珀萊雅化妝品股份有限公司。本文件主要起草人：桑晶，匡榮，李樂，馮俊，楊鑫化妝品舒緩功效測試方法——基于PolyI:C+LPS誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥因子(IL-8)體外測試方法1范圍本文件規(guī)定了一種化妝品舒緩功效的體外測試方法。本文件適用于采用人源角質(zhì)細(xì)胞炎癥因子IL-8檢測的試驗評價化妝品及原料的舒緩功效。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語及定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1角質(zhì)形成細(xì)胞keratinocyte存在于皮膚、毛發(fā)、指甲等中的一種可合成角蛋白的細(xì)胞。3.2炎癥因子IL-8IL-8屬于白介素家族的一種促炎因子，是濕疹發(fā)生過程中角質(zhì)形成細(xì)胞釋放的特異性促炎因子，角質(zhì)形成細(xì)胞釋放IL-8后進(jìn)一步會激活T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)紅斑瘙癢等不適癥狀的出現(xiàn)。3.3酶聯(lián)免疫吸附測定enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA 一種將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的高靈敏度分析技術(shù)。原理是用酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）標(biāo)記抗體，該酶標(biāo)抗體可與待測的抗原或抗體免疫吸附結(jié)合，酶所催化的呈色反應(yīng)可以間接反映抗原的量。4試驗原理本方法采用PolyI:C和LPS聯(lián)合誘導(dǎo)體外角質(zhì)形成細(xì)胞，使其釋放濕疹（一種典型的炎性皮膚病）特異性的炎癥因子IL-8，IL-8釋放后會進(jìn)一步激活特異性免疫反應(yīng)，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥的級聯(lián)放大，最終出現(xiàn)紅斑瘙癢等不適癥狀，而抑制IL-8釋放的化妝品可以達(dá)到舒緩瘙癢紅斑等不適癥狀的作用。通過采用IL-8酶標(biāo)抗體的酶標(biāo)板進(jìn)行測定，通過測定酶標(biāo)儀450nm波長下測定吸光度（OD值）得到IL-8含量，受試物組與陰性對照組比較來計算IL-8抑制率。通過測試受試物對IL-8抑制率情況，來評價樣品的舒緩功效。5試劑和材料5.1DMEM培養(yǎng)液：低糖，葡萄糖含量1g/L。5.2胰蛋白酶-EDTA溶液：胰蛋白酶濃度0.25%。5.3新生牛血清（NBS）。5.4細(xì)胞培養(yǎng)液：含10%新生牛血清（5.3）的DMEM培養(yǎng)液（5.1）。5.5磷酸鹽緩沖液（PBS）：pH7.2~pH7.4。5.6IL-8ELISA檢測試劑盒。5.7細(xì)胞：原代人源角質(zhì)形成細(xì)胞（10代以內(nèi)）或人永生化表皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT。如果培養(yǎng)條件能滿足細(xì)胞的特殊需要，其他表皮細(xì)胞或表皮細(xì)胞系也可用于本試驗，但必須證明其等同性。6儀器6.1分析天平：分度值為0.0001g。6.2二氧化碳培養(yǎng)箱。6.3可調(diào)節(jié)移液器：1000μL、200μL、300μL多道移液器。6.4超凈工作臺。6.5離心機(jī)。6.6倒置顯微鏡。6.7細(xì)胞板振蕩器。6.8酶標(biāo)儀。6.9CO2培養(yǎng)箱。6.8恒溫培養(yǎng)箱。6.9倒置顯微鏡。7試驗步驟7.1實驗前準(zhǔn)備7.1.1受試物準(zhǔn)備水溶受試物直接采用培養(yǎng)液作為溶劑。水難溶的受試物使用二甲基亞砜（DMSO）作為溶劑。其余溶劑需在使用溶劑前。必須仔細(xì)評估受試物的特殊性質(zhì)，是否與受試物發(fā)生反應(yīng)。使用渦旋混合/或超聲處理和/或加熱到適當(dāng)溫度等方法輔助溶解，除非這些操作會影響到受試物的穩(wěn)定性。除有穩(wěn)定性數(shù)據(jù)證明儲備液可接受，受試物均使用前新鮮配置直接使用。受試物毒性有毒，則根據(jù)毒性預(yù)試驗選擇的無毒劑量（即活性大于90%）濃度進(jìn)行表面給藥。7.1.2刺激物準(zhǔn)備采用PolyI:C和LPS聯(lián)合刺激，其中PolyI:C的推薦使用濃度為60μg/mL，LPS的推薦使用濃度為100μg/mL，二者混合后添加到模型培養(yǎng)液中配置成誘導(dǎo)工作液，具體誘導(dǎo)劑量可根據(jù)試驗室培養(yǎng)細(xì)胞特性進(jìn)行調(diào)整。試驗可接受標(biāo)準(zhǔn)為：與陰性對照組相比，刺激物作用下陰性對照組的IL-8含量顯著性增加（具有統(tǒng)計學(xué)差異P<0.05）。7.1.3陽性對照每一次試驗都應(yīng)同時使用陽性對照進(jìn)行試驗。例如地塞米松，給藥濃度為100μg/mL。具體給藥濃度也可根據(jù)各試驗室培養(yǎng)細(xì)胞特性進(jìn)行調(diào)整。試驗可接受標(biāo)準(zhǔn)為：與陰性對照組相比，陽性對照組IL-8的分泌量顯著性降低（具有統(tǒng)計學(xué)差異P<0.05）。7.2預(yù)試驗（細(xì)胞毒性試驗）7.2.1細(xì)胞接種選用生長良好的角質(zhì)形成細(xì)胞，消化后用細(xì)胞培養(yǎng)液制備成約1~2104個/mL的細(xì)胞懸液，接種到96孔板中，每孔200μL，邊緣孔加入200μL的無菌PBS。放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h，24h±2h后細(xì)胞融合度應(yīng)達(dá)到20%~30%，若不在20%~30%范圍內(nèi)，需調(diào)整細(xì)胞接種密度。每一次試驗都應(yīng)同時設(shè)置空白對照組，空白對照組不接種細(xì)胞，只加相同體積的細(xì)胞培養(yǎng)液。7.2.2加樣吸取培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，加樣。預(yù)試驗設(shè)空白對照組、溶劑對照組和受試物組，空白對照組和溶劑對照組加入含2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，受試物組加入一定濃度的受試物培養(yǎng)液。每孔加液量均為200μL。加樣完畢后將96孔板放回二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.2.3半換液孵育24h和48h后取出96孔板進(jìn)行半換液操作，空白對照組和溶劑對照組換含2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，受試物組換含有受試物的培養(yǎng)液。7.2.4MTT檢測孵育72h后，吸掉培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔加入200μL0.5mg/mL的MTT溶液，于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)4h±15min。孵育結(jié)束后，吸棄MTT溶液，每孔加入150μLDMSO，將96孔板放置于振蕩器上，避光震搖10min。震搖結(jié)束后，置于酶標(biāo)儀，490nm處讀取吸光度值（OD值）。7.2.5計算細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率7.3正式試驗7.3.1試驗濃度選擇選擇細(xì)胞存活率達(dá)到90%左右的濃度作為起始濃度，下設(shè)1~3個濃度，作為正式試驗的濃度。具體濃度選擇可根據(jù)試驗情況做出適當(dāng)調(diào)整。7.3.2細(xì)胞接種接種4塊24孔板，培養(yǎng)24小時。其余同7.2.1。7.3.3給藥棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，給藥。受試物給藥組加入誘導(dǎo)液和一定濃度的受試物培養(yǎng)液的混合液，陰性對照組加入誘導(dǎo)液，空白對照組和裸細(xì)胞組加入細(xì)胞培養(yǎng)液，陽性對照組先只加誘導(dǎo)液，四小時后加入相應(yīng)濃度的含有陽性對照的培養(yǎng)液。每孔加液量為1mL。給藥完畢后將孔板放置在培養(yǎng)箱中（37℃、5%CO2、95%RH）培養(yǎng)（24±2）h。7.3.3細(xì)胞上清收集孵育培養(yǎng)結(jié)束后，收集全部細(xì)胞培養(yǎng)上清液于1.5mL無菌離心管中，離心后去上清液于1.5ml無菌離心管終，置于-80℃超低溫冰箱冷凍保存。7.3.4ELISA檢測ELISA檢測需根據(jù)IL-8ELISA檢測試劑盒的操作說明書進(jìn)行檢測。7.3.5IL-8含量計算：標(biāo)準(zhǔn)品及受試物測定的OD450值減去空白孔OD450值后，3個復(fù)孔取其平均值計算。采用專業(yè)制作曲線軟件CurveExpert，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，OD450值為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程式，將受試物組測定的OD450值代入方程式，計算出受試物的IL-8含量。7.4IL-8抑制率計算：抑制率(1)式中：T—實驗組IL-8含量平均值；C—陰性對照組IL-8含量平均值。7.5數(shù)據(jù)計算計算溶劑對照組、陽性對照組與受試物組相對細(xì)胞活力（%）的平均值（Mean）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）、變異系數(shù)（CoefficientofVariation，CV），CV=（SD/Mean）×100%。相對細(xì)胞活力以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。7.6統(tǒng)計分析采用t檢驗法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，比較各時間點受試物組、陽性對照組與溶劑對照組相對細(xì)胞活力的差異，P<0.05表明統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異。8結(jié)果判定8.1試驗成立的條件8.1.1試驗系統(tǒng)有效每批次實驗均須設(shè)置陰性對照組及陽性對照組，要求每批次測試陰性對照組相較空白對照組，IL-8的分泌量顯著性增加（具有統(tǒng)計學(xué)差異P<0.05），陽性對照相較陰性對照組檢出IL-8含量顯著性降低（具有統(tǒng)計學(xué)差異P<0.05），則認(rèn)為試驗系統(tǒng)有效。8.1.2試驗平行性有效各平行孔相對細(xì)胞活力的CV值≤30%。8.2結(jié)果判定評價受試物的舒緩功效，需要受試物組與陰性對照組相比，IL-8的含量下降，且檢測值具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），說明受試物具有抑制IL-8含量的作用。在