(高清版)GB∕T 38502-2020 消毒劑實(shí)驗(yàn)室殺菌效果檢驗(yàn)方法

C50中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)消毒劑實(shí)驗(yàn)室殺菌效果檢驗(yàn)方法T2020-03-06發(fā)布2020-10-01實(shí)施國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)ⅠGB／T38502—2020前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4基本要求 4.1實(shí)驗(yàn)室及人員要求 4.2消毒試驗(yàn)要求 5消毒與滅菌效果試驗(yàn)方法 5.1細(xì)菌懸液與菌片的制備 5.2活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)技術(shù) 5.3殘留消毒劑（化學(xué)因子）的去除方法 5.4中和劑鑒定試驗(yàn) 5.5過濾沖洗法去除殘留消毒劑試驗(yàn) 5.6細(xì)菌殺滅試驗(yàn) 5.7分枝桿菌殺滅試驗(yàn) 5.8真菌殺滅試驗(yàn) 5.9消毒劑殺菌作用影響因素試驗(yàn) 附錄A（規(guī)范性附錄）實(shí)驗(yàn)室及人員要求 附錄B（規(guī)范性附錄）試劑 GB／T38502—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所、解放軍疾病預(yù)防控制所、江蘇省疾病預(yù)防控制中心、湖南省疾病預(yù)防控制中心、山東省疾病預(yù)防控制中心、黑龍江省疾病預(yù)防控制中心、福建省疾病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張流波、李新武、姚楚水、張文福、吳曉松、陳貴秋、楊彬、林玲、林立旺、李濤、Ⅲ1GB／T38502—2020消毒劑實(shí)驗(yàn)室殺菌效果檢驗(yàn)方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了消毒劑實(shí)驗(yàn)室殺菌效果檢驗(yàn)的術(shù)語和定義、基本要求以及消毒與滅菌效果試驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各種消毒劑實(shí)驗(yàn)室殺菌效果的檢驗(yàn)和評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1消毒劑用于殺滅傳播媒介上的微生物使其達(dá)到消毒或滅菌要求的制劑。3.2中和劑在微生物殺滅試驗(yàn)中，用以消除試驗(yàn)微生物與消毒劑的混懸液中和微生物表面上殘留的消毒劑，使其失去對(duì)微生物抑制和殺滅作用的試劑。3.3中和產(chǎn)物中和劑與消毒劑作用后的產(chǎn)物。3.4菌落形成單位在活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)，由單個(gè)菌體或聚集成團(tuán)的多個(gè)菌體在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖所形成的集落，以其表達(dá)活菌的數(shù)量。在活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)，由單個(gè)菌體或聚集成團(tuán)的多個(gè)菌體在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖所形成的集落，以3.5殺滅對(duì)數(shù)值消毒前后微生物減少的對(duì)數(shù)值。3.6載體試驗(yàn)微生物的支持物。4基本要求4.1實(shí)驗(yàn)室及人員要求實(shí)驗(yàn)室及人員要求見附錄A。2GB／T38502—20204.2消毒試驗(yàn)要求檢測(cè)要求包括以下幾點(diǎn)：a)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)以懸液定量試驗(yàn)為主，試驗(yàn)應(yīng)重復(fù)3次。對(duì)不適宜用懸液定量試驗(yàn)評(píng)價(jià)的消毒劑，如黏稠的消毒劑、沖洗用消毒劑和原液使用的消毒劑等的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)可用載體定量試驗(yàn)，試驗(yàn)應(yīng)重復(fù)3次。無特殊要求的情況下，載體定量試驗(yàn)以布片為載體，用途單一、明確的可以選用對(duì)應(yīng)的玻璃片、不銹鋼片、濾紙片等。b)評(píng)價(jià)消毒劑的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，消毒劑試驗(yàn)濃度應(yīng)用產(chǎn)品說明書規(guī)定的該消毒劑對(duì)某一有代表性消毒對(duì)象的最低使用濃度。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)不同作用時(shí)間，原則上第一時(shí)間為說明書規(guī)定的最短作用時(shí)間的0.5倍，第二時(shí)間為最短作用時(shí)間，第三時(shí)間為最短作用時(shí)間的1.5倍。c)對(duì)多用途的消毒劑，消毒對(duì)象所涉及的微生物相同時(shí)，若使用濃度相同，選擇各種用途中最短的作用時(shí)間。若作用時(shí)間相同，選擇各種用途中最低的使用濃度。使用濃度低、作用時(shí)間短者與使用濃度高、作用時(shí)間長(zhǎng)者同時(shí)存在時(shí)，以前者為準(zhǔn)。使用濃度高、作用時(shí)間短者與使用濃度低，作用時(shí)間長(zhǎng)者同時(shí)存在時(shí)，每個(gè)劑量均應(yīng)進(jìn)行試驗(yàn)。d)滅菌試驗(yàn)應(yīng)用載體定性試驗(yàn)，普通醫(yī)療器械的滅菌以不銹鋼片為載體，特殊用途的可以選用玻璃片、聚四氟乙烯片等。滅菌試驗(yàn)按產(chǎn)品說明書規(guī)定的最低使用濃度（強(qiáng)度）和0.5倍的最短作用時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)。載體定性試驗(yàn)應(yīng)重復(fù)5次，樣本總量應(yīng)不少于30個(gè)，每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)立規(guī)定數(shù)量的陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。e)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)時(shí)，對(duì)用于不經(jīng)過清洗或較臟的消毒對(duì)象的消毒劑，有機(jī)干擾物牛血清白蛋白0%;對(duì)用于經(jīng)過清洗或較清潔的消毒對(duì)象的消毒劑，有機(jī)干擾物牛血清白蛋白的3%;對(duì)用于經(jīng)過嚴(yán)格清洗或極清潔的消毒對(duì)象的消毒劑，可不使用有機(jī)干擾物。4.2.2重復(fù)試驗(yàn)的要求重復(fù)性試驗(yàn)不是只在同次試驗(yàn)中增加菌片數(shù)，或多作幾份樣本，而是應(yīng)分期分批進(jìn)行。必要的器材和試劑應(yīng)重新制備或滅菌，以防產(chǎn)生系統(tǒng)性誤差。符合下列所有相應(yīng)條件的消毒產(chǎn)品判為消毒效果試驗(yàn)結(jié)果合格：a)去除殘留消毒劑效果的鑒定試驗(yàn)合格。b)消毒產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果符合下列指標(biāo)要求：1)懸液定量殺菌試驗(yàn)時(shí)，每次試驗(yàn)對(duì)細(xì)菌繁殖體和細(xì)菌芽胞如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和枯草桿菌黑色變種芽胞的殺滅對(duì)數(shù)值大于或等于5.00,對(duì)龜分枝桿菌膿腫亞種、白色念珠菌和黑曲霉菌的殺滅對(duì)數(shù)值大于或等于4.00。對(duì)照組微生物數(shù)在規(guī)定的范圍內(nèi)。2)載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)時(shí)，每次試驗(yàn)對(duì)各類微生物的殺滅對(duì)數(shù)值或滅活對(duì)數(shù)值大于或等于3.00,對(duì)照組微生物數(shù)在規(guī)定的范圍內(nèi)。載體浸泡定性滅菌試驗(yàn)時(shí)，各次試驗(yàn)所有載體均無試驗(yàn)菌生長(zhǎng)，對(duì)照組微生物數(shù)在規(guī)定的范圍內(nèi)。3GB／T38502—20205消毒與滅菌效果試驗(yàn)方法5.1細(xì)菌懸液與菌片的制備金黃色葡萄球菌ATCC6538、銅綠假單胞菌ATCC15442、大腸桿菌8099、枯草桿菌黑色變種芽胞ATCC9372、白色葡萄球菌8032。在上述規(guī)定的菌株基礎(chǔ)上，根據(jù)消毒劑特定用途或試驗(yàn)特殊需要，還可增選其他菌株。有機(jī)干擾物、磷酸鹽緩沖液、無菌蒸餾水或其他純化水、稀釋液、細(xì)菌培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、革蘭染色液、芽胞染色液（見附錄B)。恒溫水浴箱、離心機(jī)、電動(dòng)混勻器、濁度計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱、玻璃漏斗、刻度吸管(1.0mL、5.0mL、毛細(xì)吸管移液器(及配套的塑料吸頭。5.1.2細(xì)菌懸液制備程序5.1.2.1.1以無菌操作方式開啟菌種管，用毛細(xì)吸管加入適量營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含5.0mL~10.0mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置36℃±1℃培養(yǎng)1用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h?；驈木N保存管中取出一粒菌珠接種于平皿上，置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,即為第3代培養(yǎng)物。取3.0mL~5.0mL稀釋液（一般用TPS,酸化水用生理鹽水）加入試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用5.0mL吸管將洗液移至另一無菌試管中，用電動(dòng)混勻器混合20s,或在手掌上振打80次，以使細(xì)菌懸浮均勻。5.1.2.1.3初步制成的菌懸液，先用細(xì)菌濃度比濁測(cè)定法粗測(cè)其含菌濃度，然后以稀釋液稀釋至所需濃度。5.1.2.1.4細(xì)菌繁殖體懸液應(yīng)保存在4℃冰箱內(nèi)備用。應(yīng)當(dāng)天使用，不得過夜。5.1.2.1.5懷疑有污染時(shí)，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗(yàn)等法進(jìn)行鑒定。5.1.2.2.1以無菌操作方式開啟菌種管，用毛細(xì)吸管加入適量營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含5.0mL~10.0mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置36℃±1℃培養(yǎng)1用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,即為第3代培養(yǎng)物。用吸管吸取第代第代的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物接4GB／T38502—2020種于羅氏瓶中營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，將其搖動(dòng)使菌液布滿營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的表面，再將多余肉湯培養(yǎng)物吸出，將羅氏瓶置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5d~7d。5.1.2.2.3用接種環(huán)取菌苔少許涂于玻片上，以改良芽胞染色法染色。改良芽胞染色法步驟如下：a)用接種環(huán)取菌苔涂布于玻片上，待自然干燥，而后通過火焰加熱將菌固定于玻片上。b)將涂片放入平皿內(nèi)，片上放兩層濾紙，滴加足量的5.00%孔雀綠水溶液。將平皿蓋好，放54℃~56℃條件下，加熱30min。取出，去濾紙，用自來水沖去殘留液。c)加0.5%沙黃水溶液，染1min。水洗，待干后鏡檢。芽胞呈綠色，菌體呈紅色。并在顯微鏡（油鏡）下進(jìn)行鏡檢。當(dāng)芽胞形成率達(dá)90%以上時(shí)，即可進(jìn)行后續(xù)處理。否則，應(yīng)繼續(xù)在室溫下放置一定時(shí)間，直至達(dá)到上述芽胞形成率后再進(jìn)行以下處理。5.1.2.2.4加10.0mL無菌蒸餾水于羅氏瓶中，以L棒輕輕推刮下菌苔，吸出，再加入5.0mL無菌蒸餾水沖洗培養(yǎng)基表面，吸出。將兩次吸出的菌懸液集中于含玻璃珠的無菌錐形燒瓶中，振搖5min。5.1.2.2.5將燒瓶置45℃水浴中24h,使菌自溶斷鏈，分散成單個(gè)芽胞。5.1.2.2.6用無菌棉花或紗布過濾芽胞懸液，清除瓊脂凝塊。5.1.2.2.7將芽胞懸液置無菌離心管內(nèi)，以30芽胞重新懸浮，本步驟重復(fù)3遍。以殺滅殘余的細(xì)菌繁殖體。待冷至室溫后，搖勻分裝保存于4℃冰箱中備用。有效使用期半年。5.1.2.2.9芽胞懸液在使用時(shí)，應(yīng)先進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。5.1.2.2.10懷疑有雜菌污染時(shí)，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗(yàn)等方法進(jìn)行鑒定。5.1.3.1菌片用載體應(yīng)根據(jù)消毒對(duì)象選擇相應(yīng)的材料，如手術(shù)器械選擇不銹鋼片，物體表面選擇棉布片，非金屬管腔選擇聚四氟乙烯片（管光滑表面可選擇玻璃片等。常用的材料有金屬、玻璃、濾紙、棉布、聚四氟乙烯等，金屬載體一般用12mm直徑圓形金屬片（厚0.5mm),其他材質(zhì)載體一般為方形，大小10mm×10mm,特定用途的消毒產(chǎn)品可使用其他材質(zhì)、形狀的載體。5.1.3.2所用載體（除濾紙片外）于染菌前，應(yīng)進(jìn)行脫脂處理。脫脂過程應(yīng)嚴(yán)格按照如下步驟進(jìn)行：a)將載體放在含洗滌劑的水中煮沸30min;b)以自來水洗凈；c)用蒸餾水煮沸10min;d)用蒸餾水漂洗至pH呈中性；e)晾干、熨平備用。5.1.3.3布片用40織紗的白平紋棉布制作。將脫脂后的布?jí)K按載體規(guī)定的大小抽去邊緣一周的經(jīng)緯紗各一根，按抽紗痕剪開。金屬片以不銹鋼制作，紙片以濾紙制作。5.1.3.4載體經(jīng)壓力蒸汽滅菌后，使用滴染法染菌。染菌用菌懸液：菌懸液和芽胞懸液的制備按5.1.2進(jìn)行，試驗(yàn)用菌懸液的含菌量約為109CFU/mL,可使用濁度計(jì)調(diào)整菌液濃度。然后加入等量3.0%或0.3%的牛血清白蛋白，使菌液的濃度約為5×108CFU/mL。滴染法染菌時(shí)，將經(jīng)滅菌的載體片平鋪于無菌平皿內(nèi)，用移液器逐片滴加菌液，必要時(shí)用接種環(huán)涂勻整個(gè)載體表面。置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱或室溫干燥備用。每個(gè)菌片載體片片5.1.4.1用濁度計(jì)測(cè)定的菌懸液濃度，只用于在滴染菌片時(shí)對(duì)菌懸液稀釋度的估計(jì)。作為菌懸液含菌5GB／T38502—2020濃度或菌片染菌量的正式報(bào)告（如殺菌試驗(yàn)中陽性對(duì)照組菌懸液或菌片所含菌量應(yīng)以活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)的實(shí)測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，不宜使用根據(jù)比濁法判定的估計(jì)值。5.1.4.2菌液滴加不宜過快，避免流散影響染菌的準(zhǔn)確性。5.1.4.3細(xì)菌繁殖體在載體上干燥的過程中，可引起部分死亡。宜提高初始菌濃度，以便達(dá)到所需的回收菌量。5.1.4.4配制菌懸液和制備菌片時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，以防污染雜菌，影響殺菌試驗(yàn)的結(jié)果。5.1.4.5保存菌液的容器使用橡皮塞時(shí)，應(yīng)將其預(yù)先煮沸10min進(jìn)行脫硫處理。5.1.4.6菌懸液和菌片應(yīng)隨時(shí)放入冰箱內(nèi)，盡量縮短室溫放置時(shí)間，以減少細(xì)菌的自然死亡。5.2活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)技術(shù)稀釋液、細(xì)菌培養(yǎng)基、胰蛋白陳大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白陳大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)等（見附錄B)?？潭任?移液器(及配套的塑料吸頭、電動(dòng)混勻器、濁度計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱。活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)一般使用傾注法（有特殊規(guī)定者除外）。傾注法操作程序如下：a)菌懸液可直接進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。將菌片和小型固體樣本直接投入含5.0mL稀釋液的無菌試管中，將棉拭采樣端剪入管內(nèi)。用電動(dòng)混勻器混合20s,或在手掌上用力振打80次，將菌洗下形成菌懸液。b)將試管按需要數(shù)量分組排列于試管架上，每管加入4.5mL稀釋液。各組由左向右，逐管標(biāo)上c)將菌懸液樣本用電動(dòng)混勻器混合20s,或在手掌上用力振打80次，隨即吸取0.5mL加至10-1管內(nèi)。d)將10-1管用電動(dòng)混勻器混合20s,或在手掌上用力振打80次，混勻，再吸取出0.5mL加入e)選擇適宜稀釋度試管（以預(yù)計(jì)生長(zhǎng)菌落數(shù)每平板為15CFU~300CFU者為宜吸取其中混合均勻的懸液1.0mL加于無菌平皿內(nèi)。每一稀釋度接種2個(gè)平皿。一般應(yīng)接種2個(gè)~3個(gè)不同稀釋度。f)將40℃~45℃熔化的培養(yǎng)基，傾注于已加入樣液的平皿中，每平皿15mL~20mL。g)將平皿蓋好，即刻輕輕搖動(dòng)混勻，平放。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板使底向上，置36℃±1℃（嗜熱脂肪桿菌芽胞的培養(yǎng)溫度為56℃±2℃,黑曲霉菌的培養(yǎng)溫度為30℃±1℃)恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。h)培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)樣本，應(yīng)每日觀察并記錄菌落數(shù)。i)計(jì)數(shù)菌落時(shí)，一般以肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查。以每平板菌落數(shù)在15CFU~300CFU的稀釋度為準(zhǔn)記錄結(jié)果。對(duì)黑曲霉菌活菌計(jì)數(shù)時(shí)，以每平板菌落數(shù)在15CFU~100CFU的稀釋度為準(zhǔn)記錄結(jié)果。對(duì)菌量極少的樣本，按實(shí)際菌落數(shù)計(jì)算最終結(jié)果。j)根據(jù)稀釋倍數(shù)和接種量計(jì)算每毫升菌液中或每一菌片（染菌載體）上的平均菌落數(shù)。6GB／T38502—20205.2.3活菌計(jì)數(shù)中技術(shù)操作誤差的測(cè)定式中：P—平板間誤差率，%；N—平板間菌落平均數(shù)；Ni—各平板菌落數(shù)，單位為菌落形成單位（CFU）。式中：Px—稀釋度間菌落數(shù)誤差率，%；A—稀釋度間菌落平均數(shù)；Ai—各稀釋度菌落數(shù)，單位為菌落形成單位（CFU）。5.2.4.2認(rèn)真檢查實(shí)驗(yàn)器材有無破損，以防丟失樣本和污染環(huán)境。5.2.4.3注意菌液的均勻分散。5.2.4.5每吸取一個(gè)稀釋度樣液，應(yīng)更換一支吸管或吸頭。5.2.4.6樣液加入平皿后應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基，避免樣液干燥。5.2.4.7傾注時(shí)培養(yǎng)基溫度不得超過45℃，以防損傷細(xì)菌或真菌。5.2.4.8傾注和搖動(dòng)應(yīng)盡量平穩(wěn)，勿使培養(yǎng)基外溢，確保細(xì)菌分散均勻，便于計(jì)數(shù)菌落。5.3殘留消毒劑（化學(xué)因子）的去除方法5.3.1.1應(yīng)有效去除殘留的消毒劑或消毒劑的影響。5.3.1.2對(duì)試驗(yàn)微生物無害，不減少其回收菌量。5.3.1.3不破壞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分，不影響其透明度。在消毒劑與微生物作用到達(dá)設(shè)定時(shí)間時(shí)，取樣加于適宜種類和濃度的中和劑中，將殘留消毒劑迅速中和，使其不再持續(xù)殺滅和抑制微生物的方法。其操作要點(diǎn)如下：a）將經(jīng)消毒劑作用過的微生物樣本，在達(dá)到規(guī)定作用時(shí)間，即刻取樣移入鑒定合格的中和劑溶液中；b）所用中和劑的濃度與用量應(yīng)與鑒定試驗(yàn)結(jié)果規(guī)定的相同；c）即刻混勻，并按規(guī)定時(shí)間吸取樣液進(jìn)行隨后的培養(yǎng)檢測(cè)；d）應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行樣本接種培養(yǎng)基以前的操作，以免微生物與中和劑或中和產(chǎn)物接觸過久。7GB／T38502—2020將經(jīng)消毒劑作用過的微生物樣本，立即加入適量稀釋液中混勻（通過適量稀釋，可減輕消毒劑的持續(xù)作用并傾入裝有微孔濾膜的濾器內(nèi)，接真空泵抽吸過濾（或加壓過濾）后，再加適量稀釋液沖洗，同時(shí)過濾，可去除殘留的消毒劑。多用于難以找到適宜中和劑的消毒效果試驗(yàn)。其操作要點(diǎn)如下：a)微孔濾膜、濾器滅菌后備用；b)初次過濾后，應(yīng)使用對(duì)微生物無害的稀釋液進(jìn)行沖洗，以洗凈消毒劑為準(zhǔn)；c)沖洗、濾凈后，以無菌操作方法取出微孔濾膜，進(jìn)行隨后的培養(yǎng)檢測(cè)。5.3.3.1每次吸液，均應(yīng)更換無菌吸管，以防交叉污染。5.3.3.2所用吸管的容量宜盡量與擬吸取的液體量相近，不要用大吸管吸取少量液體。5.3.3.3試驗(yàn)條件可影響殘留消毒劑的去除效果，故每進(jìn)行一種消毒效果試驗(yàn)，均應(yīng)按規(guī)定對(duì)所選方法進(jìn)行去除效果的鑒定試驗(yàn)。5.4中和劑鑒定試驗(yàn)5.4.2.1通過所設(shè)各組試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，應(yīng)可確定所用中和劑是否具有良好的中和作用，對(duì)試驗(yàn)用微生物恢復(fù)和培養(yǎng)無不良影響。5.4.2.2試驗(yàn)中所用消毒劑的濃度應(yīng)為殺菌試驗(yàn)中使用的最高濃度。5.4.2.3同一消毒劑對(duì)多種微生物進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時(shí)，所用中和劑應(yīng)按微生物種類分別進(jìn)行鑒定試驗(yàn)：a)對(duì)細(xì)菌繁殖體，一般在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌中任選其一進(jìn)行試驗(yàn)，特殊情況按試驗(yàn)結(jié)果再行選擇；b)對(duì)細(xì)菌芽胞、白色念珠菌、黑曲霉菌、分枝桿菌應(yīng)分別進(jìn)行鑒定試驗(yàn)；c)當(dāng)用其他特定微生物進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時(shí)，均應(yīng)以該特定微生物進(jìn)行中和劑鑒定試驗(yàn)。5.4.2.4鑒定時(shí)根據(jù)所用殺菌試驗(yàn)方法，相應(yīng)使用懸液或載體進(jìn)行試驗(yàn)。各組試驗(yàn)如下：a)第1組：中和劑＋菌懸液；b)第2組消毒劑＋中和劑菌懸液；c)第3組：稀釋液＋菌懸液；d)第4組：稀釋液＋中和劑＋培養(yǎng)基。5.4.4中和劑懸液定量鑒定試驗(yàn)操作程序根據(jù)試驗(yàn)分組，準(zhǔn)備足量試管和平皿，依次進(jìn)行編號(hào)。將菌懸液用等量適合濃度的有機(jī)干擾物稀釋8GB／T38502—2020菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)；b）第2組：取0.4mL消毒劑于試管內(nèi)，加入4.5mL中和劑（對(duì)于酸性氧化電位水檢測(cè)時(shí)，取0.1mL試驗(yàn)菌懸液，混勻，作用10min，分別吸取1.0mL接種于兩個(gè)平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)；菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)；d）第4組：分別吸取稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)硬水與中和劑各0.5mL于無菌平皿內(nèi)，倒入上述試驗(yàn)同批次的培養(yǎng)基15mL~20mL，培養(yǎng)觀察。5.4.5中和劑載體定量鑒定試驗(yàn)操作程序根據(jù)試驗(yàn)分組，準(zhǔn)備足量試管和平皿，依次進(jìn)行編號(hào)。各組分別用適宜的無菌定量吸管按以下程序吸取或添加試劑和試驗(yàn)樣本。將適宜濃度的菌懸液用等量適合濃度的有機(jī)干擾物稀釋作為試驗(yàn)菌懸夾入1菌片，并使浸透于中和劑內(nèi)，作用10min后，用電動(dòng)混勻器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次，混勻，分別吸取1.0mL接種于兩個(gè)平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)；b）第2組：吸取中和產(chǎn)物溶液（按每片浸有消毒劑的載體加入含5.0mL中和劑的量制備中和產(chǎn)浸透于中和產(chǎn)物溶液中，作用10min后，用電動(dòng)混勻器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次，混勻，分別吸取1.0mL接種于兩個(gè)平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)；夾入1菌片，并使浸透于稀釋液中，作用10min后，用電動(dòng)混勻器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次，混勻，分別吸取1.0mL接種于兩個(gè)平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)；d）第4組：分別吸取稀釋液與中和劑各1.0mL于無菌平皿內(nèi)，倒入上述試驗(yàn)同批次的培養(yǎng)基培養(yǎng)觀察。試驗(yàn)結(jié)果符合以下全部條件，判為合格：a）第1組、第2組和第3組有相似量試驗(yàn)菌生長(zhǎng)，懸液試驗(yàn)作用體系中菌量在50CFU／mL~之間載體試驗(yàn)菌量在片片之間數(shù)誤差率應(yīng)不超過15%。按式（3）計(jì)算第1組、第2組和第3組間菌落數(shù)誤差率：式中：犡—三組間菌落平均數(shù)；—各組菌落平均數(shù)，單位為菌落形成單位（CFU）。b）第4組無菌生長(zhǎng)。否則應(yīng)更換試劑，重新試驗(yàn)。9GB／T38502—2020c)試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)均應(yīng)符合a)、b)的要求。5.4.7.1試驗(yàn)所分各組均有其特定意義，不得任意刪減。5.4.7.2無菌操作，保持試驗(yàn)用液和器材的無菌，注意更換吸管，保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。5.4.7.3實(shí)驗(yàn)組序應(yīng)按本標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。5.5過濾沖洗法去除殘留消毒劑試驗(yàn)5.5.1.2稀釋液和沖洗液：應(yīng)不影響濾膜的性質(zhì)，對(duì)微生物無傷害作用。可用生理鹽水、PBS、稀釋液（見附錄B)、含吐溫80的PBS、可中和部分消毒成分的中和劑。5.5.1.3其他器材隨試驗(yàn)微生物確定。5.5.2.1通過所設(shè)各組試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，應(yīng)可確定所選方法是否對(duì)測(cè)試消毒劑有良好的去除作用，對(duì)試驗(yàn)用微生物恢復(fù)和培養(yǎng)無不良影響。5.5.2.2試驗(yàn)中所用消毒劑的濃度應(yīng)為殺菌試驗(yàn)中使用的最高濃度。5.5.2.3同一消毒劑擬對(duì)多種微生物進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時(shí)，所用中和劑應(yīng)按微生物種類分別進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，具體如下：a)細(xì)菌繁殖體，可在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌中任選其一進(jìn)行試驗(yàn)；b)細(xì)菌芽胞、白色念珠菌、黑曲霉菌、分枝桿菌應(yīng)分別進(jìn)行鑒定試驗(yàn)；c)當(dāng)用其他特定微生物進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時(shí)，均應(yīng)以該特定微生物進(jìn)行中和劑的鑒定試驗(yàn)。5.5.2.4鑒定中應(yīng)根據(jù)殺滅試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，選擇合適的試驗(yàn)方法。一般懸液鑒定試驗(yàn)結(jié)果可用于載體試驗(yàn)。5.5.3過濾沖洗去除方法的鑒定根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，準(zhǔn)備足量試管和平皿，依次進(jìn)行編號(hào)。將菌懸液用等量適合濃度的有機(jī)干擾物稀釋a)第1組：吸取1.0mL試驗(yàn)菌懸液于試管內(nèi)，加入4.0mL標(biāo)準(zhǔn)硬水，混勻，取1.0mL加入到過濾器中，然后加入50mL蒸餾水作沖洗過濾處理，然后直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面，放置在36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h（真菌和芽胞培養(yǎng)72h),計(jì)數(shù)菌落數(shù)；b)第2組：吸取0.2mL試驗(yàn)菌懸液直接加入到過濾器中，然后加入150mL~500mL沖洗液于過濾器中，做第1次沖洗過濾處理，再加入50mL蒸餾水做第2次沖洗過濾處理，最后將濾膜有菌面朝上貼于平板表面，放置在36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h（真菌和芽胞培養(yǎng)72h),計(jì)數(shù)菌落數(shù)；c)第3組：吸取4.0mL消毒劑于試管中，加入0.5mL有機(jī)干擾物，再加入0.5mL稀釋液，混勻，取1.0mL加入到過濾器中，加入150mL~500mL沖洗液做第1次沖洗過濾處理，再加入50mL沖洗液做第2次沖洗過濾處理，沖洗后吸取0.2mL試驗(yàn)菌懸液直接加入到過濾器中，再加入50mL蒸餾水做第3次沖洗過濾處理，然后將濾膜有菌面朝上貼于平板表面，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h（真菌和芽胞培養(yǎng)72h),計(jì)數(shù)菌落數(shù)。GB／T38502—2020試驗(yàn)結(jié)果符合以下全部條件，可判為合格：a)第1組、第2組和第3組測(cè)定的結(jié)果，菌懸液菌數(shù)應(yīng)在20CFU/濾膜~100CFU/濾膜之間，其組間菌落數(shù)誤差率不得超過15%。組間菌落數(shù)誤差率的計(jì)算見式(3)。b)試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)均應(yīng)符合a)的要求。5.6細(xì)菌殺滅試驗(yàn)5.6.1.1實(shí)驗(yàn)菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和枯草桿菌黑色變種芽胞等微生物的懸液或菌片。5.6.1.2消毒劑：作用濃度應(yīng)以實(shí)驗(yàn)菌與消毒劑的混合液中有效成分的最終濃度為準(zhǔn)。5.6.1.3去除殘留消毒劑的中和劑或設(shè)備。5.6.1.4實(shí)驗(yàn)試劑：消毒劑稀釋用標(biāo)準(zhǔn)硬水、有機(jī)干擾物質(zhì)、TSA培養(yǎng)基（見附錄B)、含中和劑的胰蛋白陳大豆肉湯培養(yǎng)基（中和劑TSB),中和劑經(jīng)鑒定合格。試驗(yàn)中應(yīng)分以下各組：a)實(shí)驗(yàn)組按測(cè)試目的有兩種選擇：—第一種適用于消毒產(chǎn)品鑒定。根據(jù)使用說明書，選定試驗(yàn)菌和一個(gè)消毒劑濃度（即產(chǎn)品使用說明書中指定的最低濃度）以及3個(gè)作用時(shí)間（說明書指定最短作用時(shí)間，指定最短作用時(shí)間的0.5倍，指定最短作用時(shí)間的1.5倍。如說明書指定最短作用時(shí)間為20min,則3個(gè)作用時(shí)間應(yīng)分別為10min、20min和30min)進(jìn)行試驗(yàn)?！诙N適用于消毒產(chǎn)品日常監(jiān)測(cè)。根據(jù)所試菌種和消毒劑對(duì)該菌的殺滅能力，選定一種或以上的微生物和一個(gè)消毒劑濃度（即產(chǎn)品使用說明書中指定的最低濃度）以及1個(gè)作用時(shí)間（說明書指定最短作用時(shí)間）進(jìn)行試驗(yàn)。b)陽性對(duì)照組用標(biāo)準(zhǔn)硬水代替消毒劑溶液，按上述同樣的步驟進(jìn)行試驗(yàn)。所得結(jié)果代表試驗(yàn)體系中的菌液濃度，以其作為對(duì)照組活菌濃度。5.6.3懸液定量殺菌試驗(yàn)操作程序按照配制實(shí)驗(yàn)用菌懸液回收菌落數(shù)為5.6.3.2按照產(chǎn)品說明書要求配制消毒液。無特殊說明者，一律使用無菌硬水配制，配制的濃度為待測(cè)濃度的1.25倍（例如要評(píng)價(jià)的消毒液濃度為200mg/L,則應(yīng)配制的濃度為250mg/L),置20℃±1℃水浴備用。5.6.3.3取消毒試驗(yàn)用無菌試管，先加入0.5mL試驗(yàn)用菌懸液，再加入0.5mL有機(jī)干擾物質(zhì)，混勻，置20℃±1℃水浴中5min后，用無菌吸管吸取上述濃度消毒液4.0mL注入其中，迅速混勻并立即計(jì)時(shí)。5.6.3.4待試驗(yàn)菌與消毒劑相互作用至各設(shè)定時(shí)間，分別吸取0.5mL試驗(yàn)菌與消毒劑混合液加于GB／T38502—20205.6.3.5各管試驗(yàn)菌與消毒劑混合液經(jīng)加中和劑作用10min后，分別吸取1.0mL樣液，按5.2進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。5.6.3.6同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)硬水代替消毒液，進(jìn)行平行試驗(yàn)，作為陽性對(duì)照。5.6.3.7所有試驗(yàn)樣本均置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對(duì)細(xì)菌繁殖體培養(yǎng)48h觀察最終結(jié)果；對(duì)細(xì)菌芽胞應(yīng)培養(yǎng)72h觀察最終結(jié)果。5.6.3.8試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各組的活菌濃度(CFU/mL),并換算為對(duì)數(shù)值（N然后按式(4)計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值：式中：KL—?dú)鐚?duì)數(shù)值；No—對(duì)照組平均活菌濃度的對(duì)數(shù)值；Nx—實(shí)驗(yàn)組活菌濃度對(duì)數(shù)值。計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值時(shí)，取小數(shù)點(diǎn)后兩位值，可以進(jìn)行數(shù)字修約。但是，如果消毒實(shí)驗(yàn)組平均生長(zhǎng)菌落數(shù)小于1時(shí)，本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定此時(shí)的殺滅對(duì)數(shù)值，即大于或等于對(duì)照組平均活菌濃度的對(duì)數(shù)值(KL≥No)。載體浸泡殺菌試驗(yàn)操作程序5.6.4.1載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)操作程序按照制備實(shí)驗(yàn)用菌片片片。5.6.4.1.2取無菌平皿，標(biāo)明所注入消毒液的濃度。按每片5.0mL的量，吸取相應(yīng)濃度的消毒劑溶液注入平皿中。5.6.4.1.3將盛有消毒劑平皿置20℃±1℃水浴5min,用無菌鑷子取預(yù)先制備的菌片3片分別放入平皿中，并使之浸沒于消毒液。5.6.4.1.4待菌液與消毒劑相互作用至各設(shè)定時(shí)間，用無菌鑷子將菌片取出分別移入一含5.0mL中和劑試管中。用電動(dòng)混勻器混合20s,或?qū)⒃嚬茉谑终粕险翊?0次，中和作用10min?；靹蚝?，吸取1.0mL直接接種平皿，每管接種2個(gè)平皿，測(cè)定存活菌數(shù)。5.6.4.1.5另取一平皿，加入10.0mL稀釋液代替消毒液，放入2片菌片，作為陽性對(duì)照組。其隨后的試驗(yàn)步驟和活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)與上述實(shí)驗(yàn)組相同。5.6.4.1.6所有試驗(yàn)樣本均在36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中，對(duì)細(xì)菌繁殖體培養(yǎng)48h觀察最終結(jié)果；對(duì)細(xì)菌芽胞培養(yǎng)72h觀察最終結(jié)果。5.6.4.1.7試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各組的活菌量(CFU/片并換算為對(duì)數(shù)值（N然后按式(5)計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值：式中：KL—?dú)鐚?duì)數(shù)值；Nd—對(duì)照組平均活菌量的對(duì)數(shù)值；Ns—實(shí)驗(yàn)組活菌量對(duì)數(shù)值。5.6.4.2載體浸泡定性滅菌試驗(yàn)操作程序按照制備實(shí)驗(yàn)用菌片片片5.6.4.2.2取無菌平皿，標(biāo)明所加入消毒液的濃度。按每片5.0mL的量，吸取相應(yīng)濃度的消毒劑溶液加入平皿中。5.6.4.2.3將盛有消毒劑平皿置20℃±1℃水浴5min,用無菌鑷子取預(yù)先制備的菌片6片分別放入GB／T38502—2020平皿中，并使之浸沒于消毒液。5.6.4.2.4待試驗(yàn)菌與消毒液相互作用至設(shè)定時(shí)間，用無菌鑷子將菌片取出分別移入含5.0mL中和劑肉湯試管中。用電動(dòng)混勻器混合20s,作為實(shí)驗(yàn)組樣本。5.6.4.2.5另取一平皿，加入20.0mL標(biāo)準(zhǔn)硬水代替消毒液，放入4片菌片，作用至設(shè)定時(shí)間，取出2片，分別移入含5mL中和劑試管中，其隨后的試驗(yàn)步驟與上述實(shí)驗(yàn)組相同，作為陽性對(duì)照組樣本。另取出2片，分別移入一含5.0mL中和劑肉湯試管中，按5.2進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，作為菌數(shù)對(duì)照組樣本。5.6.4.2.6所有試驗(yàn)樣本均在36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對(duì)細(xì)菌繁殖體培養(yǎng)48h,觀察最終結(jié)果；對(duì)細(xì)菌芽胞培養(yǎng)7d,觀察最終結(jié)果。5.6.4.2.7試驗(yàn)重復(fù)5次，計(jì)算各組的活菌量(CFU/片）。5.6.5濾膜過濾懸液定量殺滅試驗(yàn)菌懸液的制備和定量殺滅試驗(yàn)同濾膜孔徑5.6.5.2待試驗(yàn)菌與消毒劑（分別預(yù)先置20℃±1℃水浴中5min)相互作用至各設(shè)定時(shí)間，分別吸取1.0mL試驗(yàn)菌與消毒劑混合液加入到過濾器中過濾，然后加入150mL~500mL沖洗液做第1次沖洗過濾處理，再加入50mL蒸餾水做第2次沖洗過濾處理，將濾膜有菌面朝上貼于平板表面，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間。5.6.5.3吸取0.5mL試驗(yàn)菌懸液于試管內(nèi)，加入0.5mL有機(jī)干擾物，再加入4.0mL標(biāo)準(zhǔn)硬水，混勻。做10倍系列稀釋后取適當(dāng)稀釋度1.0mL加入到過濾器中，然后加入50mL蒸餾水作沖洗過濾處理，然后將濾膜有菌面朝上貼于平板表面，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，作為陽性對(duì)照。5.6.5.4分別吸取稀釋液、蒸餾水和硬水各1.0mL于無菌平皿內(nèi)，倒入上述試驗(yàn)同批次的培養(yǎng)基15mL~20mL,置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，作為陰性對(duì)照。5.6.5.5試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各組的活菌量(CFU/mL或CFU/片并換算為對(duì)數(shù)值（N然后按式(4)或式(5)計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值。5.6.6.1評(píng)價(jià)消毒效果時(shí)，要求在產(chǎn)品說明書指定的濃度與3個(gè)作用時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)3次。在產(chǎn)品指定最低濃度與最短作用時(shí)間，以及最短作用時(shí)間的1.5倍時(shí)，要求懸液定量殺滅試驗(yàn)中各次的殺滅對(duì)數(shù)值均大于或等于5.00。載體定量殺滅試驗(yàn)中，各次的殺滅對(duì)數(shù)值均大于或等于3.00,判定為消毒合格。在產(chǎn)品指定濃度與最短作用時(shí)間的0.5倍時(shí)，可允許對(duì)不同細(xì)菌或在部分重復(fù)次數(shù)中，出現(xiàn)不合格結(jié)果。5.6.6.2對(duì)載體浸泡定性滅菌試驗(yàn)，陽性對(duì)照組有菌生長(zhǎng)且菌數(shù)符合要求，陰性對(duì)照組無菌生長(zhǎng)，5次試驗(yàn)均無菌生長(zhǎng)，判定為滅菌合格。5.6.6.3報(bào)告中應(yīng)將各次試驗(yàn)的結(jié)果全部以表格的形式列出。陽性對(duì)照組應(yīng)列出各次實(shí)驗(yàn)菌濃度，以及平均實(shí)驗(yàn)菌濃度。實(shí)驗(yàn)組應(yīng)列出殺滅對(duì)數(shù)值，例如，殺滅對(duì)數(shù)值大于或等于5.00時(shí)，可表示為“≥5.00”而不必列出具體的數(shù)字；殺滅對(duì)數(shù)值小于5.00時(shí)，應(yīng)列出具體的數(shù)字（例如2.58,4.65)。5.6.7.1在殺菌試驗(yàn)中，每次均應(yīng)設(shè)置陽性對(duì)照。5.6.7.2試驗(yàn)中所使用的中和劑、稀釋液和培養(yǎng)基等，各批次均應(yīng)進(jìn)行無菌檢查，發(fā)現(xiàn)有菌生長(zhǎng)，則全部試驗(yàn)重做。5.7分枝桿菌殺滅試驗(yàn)5.7.1.1實(shí)驗(yàn)菌株：龜分枝桿菌膿腫亞種CMCC93326(ATCC19977)。GB／T38502—20205.7.1.2實(shí)驗(yàn)試劑：分枝桿菌培養(yǎng)基、0.1%胰蛋白陳的生理鹽水溶液、消毒劑稀釋用硬水、有機(jī)干擾物質(zhì)（見附錄B)、鑒定合格的中和劑。5.7.1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備與耗材：試驗(yàn)菌及其菌懸液或菌片的制備所需器材、刻度吸管、恒溫水浴箱、電動(dòng)混勻器、計(jì)時(shí)裝置、恒溫培養(yǎng)箱。5.7.2龜分枝桿菌膿腫亞種菌懸液的制備5.7.2.1以無菌操作方式開啟凍干菌種管，用毛細(xì)吸管吸取適量營(yíng)養(yǎng)肉湯于管中，吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含5.0mL~10.0mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管，滴入少許菌種懸液，置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于分枝桿菌培養(yǎng)基平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)72h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于分枝桿菌培養(yǎng)基斜面，置36℃±1℃培養(yǎng)72h,即為第3代培養(yǎng)5.7.2.2試驗(yàn)時(shí)，取第3代斜面培養(yǎng)物在分枝桿菌干燥培養(yǎng)基斜面上按上述方法連續(xù)傳代，培養(yǎng)方法與第3代相同，取第5代～第6代的分枝桿菌培養(yǎng)基斜面72h培養(yǎng)物，用5.0mL吸管吸取3.0mL~5.0mL稀釋液加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。用吸管將洗液移至另一含有6g~7g玻璃珠的無菌圓錐底塑料試管中，在電動(dòng)混勻器混合5min,將菌液吸入到另一試管內(nèi)制成菌懸液。5.7.2.3將制成的菌懸液，進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)（見5.2),按其結(jié)果用稀釋液稀釋至所需濃度。5.7.2.4菌懸液保存在4℃冰箱內(nèi)備用，當(dāng)天使用，不得過夜。試驗(yàn)分為下列各組：a)實(shí)驗(yàn)組：按5.6.3規(guī)定選定消毒劑濃度與作用時(shí)間；b)陽性對(duì)照組：以標(biāo)準(zhǔn)硬水代替消毒劑溶液，按5.6.3規(guī)定程序進(jìn)行試驗(yàn)，所得結(jié)果代表試驗(yàn)體系中所含受試菌的活菌濃度；c)陰性對(duì)照組：觀察同次試驗(yàn)用相關(guān)溶液和培養(yǎng)基有無污染。殺滅試驗(yàn)：懸液定量殺滅試驗(yàn)和載體浸泡定量殺滅試驗(yàn)等。其操作程序按5.6.3、5.6.4進(jìn)行，接種后的平皿應(yīng)放入干凈的塑料袋內(nèi)，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d,觀察最終結(jié)果。懸液試驗(yàn)時(shí)回收菌量為載體試驗(yàn)時(shí)回收菌量為片片。5.7.5.2評(píng)價(jià)消毒效果時(shí)，按產(chǎn)品使用說明書指定的使用濃度和3個(gè)作用時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)3次。具體評(píng)價(jià)規(guī)定如下：a)用懸液定量殺菌試驗(yàn)評(píng)價(jià)殺菌效果時(shí)，在產(chǎn)品規(guī)定使用濃度與最低作用時(shí)間，以及最短作用時(shí)間的1.5倍時(shí)，各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值均應(yīng)大于或等于4.00;在產(chǎn)品規(guī)定使用濃度與最短作用時(shí)間的0.5倍時(shí)，允許殺滅對(duì)數(shù)值小于4.00,判定為實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)該產(chǎn)品對(duì)分枝桿菌污染物消毒的有效劑量；b)用載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)評(píng)價(jià)殺菌效果時(shí)，在產(chǎn)品規(guī)定使用濃度與最短作用時(shí)間和最短作用時(shí)間的1.5倍時(shí)，各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值大于或等于3.00;在產(chǎn)品規(guī)定使用濃度與最短作用時(shí)間的0.5倍時(shí)，允許殺滅對(duì)數(shù)值小于3.00,判為實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)該產(chǎn)品對(duì)分枝桿菌污染物消毒的有效劑量。GB／T38502—20205.8真菌殺滅試驗(yàn)5.8.1.1試驗(yàn)菌及其菌懸液或菌片：白色念珠菌ATCC10231和黑曲霉菌ATCC16404孢子懸液與菌片，按5.8.2.1和5.8.2.2所示方法制備。根據(jù)消毒劑特5.8.1.2實(shí)驗(yàn)試劑：沙堡液體培養(yǎng)基、瓊脂、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基(MEA)、麥芽浸膏營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(MEB)、磷酸鹽緩沖液、消毒劑稀釋用硬水、有機(jī)干擾物質(zhì)（見附錄B)、鑒定合格的中和劑。溫培養(yǎng)箱。5.8.2真菌懸液制備5.8.2.1白色念珠菌懸液按以下步驟制備：a)以無菌操作方式開啟凍干菌種管，用毛細(xì)吸管吸加適量沙堡液體培養(yǎng)基于菌種管中，輕輕吹吸，使菌種沉淀物融化分散。取含5.0mL~10.0mL沙堡液體培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于沙堡瓊脂培養(yǎng)基平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于沙堡瓊脂斜面，置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,即為第3代培養(yǎng)物。b)取第3代～第6代的沙堡瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物(18h~24h),用5.0mL吸管吸取3.0mL~5.0mL稀釋液加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用5.0mL吸管將洗液移至另一無菌試管中，用電動(dòng)混勻器混合20s,或在手掌上振打80次，以使白色念珠菌懸浮均勻。);載體定量殺菌試驗(yàn)時(shí)，菌片制備按要求進(jìn)行。d)菌懸液保存在4℃冰箱內(nèi)備用，當(dāng)天使用不得過夜。e)懷疑有污染時(shí)，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗(yàn)等方法進(jìn)行鑒定。菌落形態(tài)可直接用顯微鏡觀察。菌體形態(tài)可在涂片后直接用高倍顯微鏡觀察，也可用墨水陰地法染色（將菌與黑墨水在玻片上混勻，推成薄膜）后觀察。5.8.2.2黑曲霉菌(ATCC16404)孢子懸液或菌片按以下步驟制備：a)以無菌操作方式開啟凍干菌種管，用毛細(xì)吸管吸取少量麥芽浸膏營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基加到菌種管中，輕輕吹吸，使菌種沉淀物融化分散。取少許沉淀物懸液加到含5.0mL麥芽浸膏營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管中，置30℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42h~48h。用接種環(huán)劃線接種第1代培養(yǎng)物于MEA培養(yǎng)基平板，置30℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42h~48h。取平板培養(yǎng)物中的典型菌落，接種于麥芽浸膏營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，置30℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42h~48h,即為第3代培養(yǎng)物。b)用10.0mL吸管吸取5.0mL~10.0mL第3代培養(yǎng)物，接種羅氏瓶，并搖動(dòng)使菌液布滿MEA培養(yǎng)基表面，將多余肉湯培養(yǎng)物液體吸出，置30℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42h~48h。c)向羅氏瓶培養(yǎng)物中加入5.0mL~10.0mL0.05%（體積分?jǐn)?shù)）吐溫80生理鹽水溶液，刮洗黑曲霉菌分生孢子于溶液中，將孢子懸液移入裝有玻璃珠的錐形瓶中，輕輕振搖1min后，過濾除去菌絲后，顯微鏡下(400倍）觀察是否仍有菌絲存在，若有可經(jīng)5000r/min~6000r/min離心20min。再次在顯微鏡下(400倍）觀察，必要時(shí)重復(fù)上述步驟。d)黑曲霉菌分生孢子懸液在2℃~8℃儲(chǔ)存不能超過2d,使用前，混合均勻，在顯微鏡下(400倍）觀察是否有孢子出芽，若有則不得使用。GB／T38502—2020回收菌量為f)菌片以滴染法制備。染菌后，置二級(jí)生物安全柜內(nèi)干燥備用?；厥站繎?yīng)為1×106CFU/片~。分為下列各組：a)實(shí)驗(yàn)組：按5.6.2規(guī)定，確定消毒劑濃度與作用時(shí)間，對(duì)受試菌種的殺滅能力進(jìn)行測(cè)定；b)陽性對(duì)照組：以標(biāo)準(zhǔn)硬水代替消毒劑溶液，按5.6.2規(guī)定程序進(jìn)行試驗(yàn)，所得結(jié)果代表試驗(yàn)體系中所含試驗(yàn)菌的活菌濃度；c)陰性對(duì)照組：觀察同次試驗(yàn)用相關(guān)溶液和培養(yǎng)基有無污染。懸液定量殺菌試驗(yàn)、載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)的操作程序均見5.6。白色念珠菌使用沙堡瓊脂培養(yǎng)基，黑曲霉菌使用麥芽浸膏瓊脂(MEA)?；罹囵B(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)，白色念珠菌在36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h觀察最終結(jié)果；黑曲霉菌在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h觀察最終結(jié)果。評(píng)價(jià)消毒效果時(shí)，按產(chǎn)品使用說明書指定的使用濃度和3個(gè)作用時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)3次。具體評(píng)價(jià)規(guī)定如下：a)在產(chǎn)品規(guī)定使用濃度與最短作用時(shí)間，以及最短作用時(shí)間的1.5倍時(shí)，各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值均應(yīng)大于或等于4.00,判定為消毒合格；b)用載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)評(píng)價(jià)殺菌效果時(shí)，在產(chǎn)品規(guī)定使用濃度與最短作用時(shí)間，以及最短作用時(shí)間的1.5倍時(shí)，各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值大于或等于3.00,判定為消毒合格。5.9消毒劑殺菌作用影響因素試驗(yàn)水配制有機(jī)物，根據(jù)消毒劑的使用對(duì)象選擇，如酵母粉、血清、蛋白陳、牛血清白蛋白。5.9.1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備與耗材：恒溫水浴箱、冷水浴裝置（可放入試管架的容器，以冰水調(diào)節(jié)水溫）、溫度計(jì)、pH計(jì)。5.9.2試驗(yàn)微生物的選擇根據(jù)所測(cè)消毒劑鑒定需要決定。一般情況下，對(duì)細(xì)菌繁殖體應(yīng)選擇大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，作為革蘭陰性細(xì)菌與陽性細(xì)菌的代表；對(duì)細(xì)菌芽胞應(yīng)選擇枯草桿菌黑色變種芽胞。也可直接選擇特定的微生物進(jìn)行試驗(yàn)。5.9.3消毒劑濃度和作用時(shí)間的設(shè)定試驗(yàn)應(yīng)分為兩組，各組消毒劑濃度和作用時(shí)間的設(shè)定如下：a)實(shí)驗(yàn)組：各種因素影響的測(cè)定，均用殺滅相應(yīng)微生物試驗(yàn)所得最低有效濃度和3個(gè)作用時(shí)間進(jìn)GB／T38502—2020行殺滅試驗(yàn)。以該最低有效濃度所需的最短有效時(shí)間和最短有效時(shí)間的2倍、3倍為3個(gè)作用時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)測(cè)出合格殺滅對(duì)數(shù)值的最低有效劑量。必要時(shí)，可根據(jù)需要調(diào)整消毒劑濃度或作用時(shí)間，若最短有效時(shí)間較長(zhǎng)（大于30min),可根據(jù)情況適當(dāng)縮短作用時(shí)間的組距。對(duì)最短有效時(shí)間較短者（小于5min),可根據(jù)情況適當(dāng)延長(zhǎng)作用時(shí)間的組距。b)陽性對(duì)照組：用標(biāo)準(zhǔn)硬水代替消毒劑溶液，按5.9.3a)進(jìn)行試驗(yàn)。所得結(jié)果代表活菌濃度。5.9.4有機(jī)物對(duì)殺滅微生物效果影響的測(cè)定5.9.4.1以小牛血清為有機(jī)物代表，應(yīng)設(shè)置無小牛血清對(duì)照組，含25%小牛血清組，含50%小牛血清組等3組。各組所用消毒劑濃度和作用時(shí)間，見5.9.3。5.9.4.2菌懸液與無菌小牛血清按1∶1與3∶1比例混合，分別配成含50%與25%小牛血清的菌懸液。此含小牛血清的菌懸液，可用于懸液定量殺菌試驗(yàn)，亦可滴染菌片進(jìn)行載體定量試驗(yàn)。5.9.4.3以懸液定量殺滅試驗(yàn)或載體浸泡定量殺滅試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)程序見5.6。5.9.4.5計(jì)算每次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值和平均殺滅對(duì)數(shù)值。5.9.5溫度對(duì)殺滅微生物效果影響的測(cè)定設(shè)置等為間隔。各組消毒劑濃度和作用時(shí)間5.9.5.2以懸液定量殺滅試驗(yàn)或載體浸泡定量殺滅試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)程序見5.6。5.9.5.4計(jì)算每次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值和平均殺滅對(duì)數(shù)值。對(duì)殺滅微生物效果影響的測(cè)定5.9.6.1以該消毒劑的使用濃度pH和使用濃度的pH加2、pH減2,設(shè)3組進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)消毒液pH的調(diào)節(jié)，先用pH計(jì)測(cè)定原消毒劑的pH,在偏酸時(shí)慢慢滴加氫氧化鈉溶液，偏堿時(shí)慢慢滴加鹽酸溶液以調(diào)整。隨時(shí)用pH計(jì)測(cè)定消毒劑的pH。當(dāng)達(dá)到所要求的pH后，停止調(diào)整，進(jìn)行隨后的試驗(yàn)。必要時(shí)，在pH調(diào)整后可測(cè)定有效成分含量以觀察是否受到pH變化的影響。5.9.6.3以懸液定量殺滅試驗(yàn)或載體浸泡定量殺滅試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)程序見5.6。5.9.6.5計(jì)算每次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值和平均殺滅對(duì)數(shù)值。有機(jī)物影響試驗(yàn)以不含小牛血清組為對(duì)照，溫度影響試驗(yàn)以20℃±1℃組為對(duì)照，pH影響試驗(yàn)以消毒劑使用溶液pH組為對(duì)照。具體評(píng)價(jià)規(guī)定如下：a)任一組中第1個(gè)～第3個(gè)作用時(shí)間殺滅效果均合格，判為該組所試因素?zé)o影響；b)任一組中第1個(gè)作用時(shí)間殺滅效果不合格，第2個(gè)、第3個(gè)作用時(shí)間殺滅效果合格，判為該組所試因素有輕度影響；c)任一組中第1個(gè)、第2個(gè)作用時(shí)間殺滅效果不合格，第3個(gè)作用時(shí)間殺滅效果合格，判為該組所試因素有中度影響；d)任一組中第1個(gè)～第3個(gè)作用時(shí)間殺滅效果均不合格，判為該組所試因素有重度影響。GB／T38502—2020附錄A（規(guī)范性附錄）實(shí)驗(yàn)室及人員要求A.1實(shí)驗(yàn)室