TGXAS-家蠶核型多角體病毒(BmNPV)制備技術(shù)規(guī)程編制說明

團體標準《家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備技術(shù)規(guī)程》（征求意見稿）編制說明項目來源根據(jù)《廣西標準化協(xié)會關(guān)于下達2023年第十批團體標準制修定項目計劃的通知》（桂標協(xié)〔2023〕50號）精神，由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站提出，廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站、河池市蠶業(yè)技術(shù)推廣站，廣西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院共同起草的團體標準《家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備技術(shù)規(guī)程》獲批立項（項目編號：2023-1006）。項目背景及目的意義蠶桑業(yè)是我國的傳統(tǒng)優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，在國際繭絲業(yè)中處主導(dǎo)地位，我國的原料繭和生絲產(chǎn)量占世界總量的70%以上，絲織品產(chǎn)量占世界三分之二以上，在世界繭絲業(yè)中處主導(dǎo)地位?！笆濉币詠?，我區(qū)蠶業(yè)取得了令人矚目的成就，蠶桑產(chǎn)業(yè)被廣西自治區(qū)黨委、政府列為11大新興優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)之一，是重要的扶貧產(chǎn)業(yè)，為廣西農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效做出了重要的貢獻。但是我國的養(yǎng)蠶業(yè)一直面臨嚴重的病害威脅，其中家蠶血液型膿病是危害最為嚴重的一種，給蠶桑產(chǎn)業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。廣西蠶區(qū)位于南亞熱帶，氣候悶熱多濕，利于病原的繁殖傳播，是此病的高發(fā)地區(qū)，嚴重影響了廣西蠶業(yè)的經(jīng)濟效益。家蠶血液型膿病是由家蠶核型多角體病毒（BmNPV）侵染蠶體引起的傳染性和致病性很強的一類病，能通過食下感染和創(chuàng)傷感染2種途徑感染蠶體。此病傳染性極強，病程快，難控制。選育對血液型膿病具有抗性的家蠶品種，從根本上解決養(yǎng)蠶生產(chǎn)有效控制血液型膿病的難題，是從遺傳上控制血液型膿病的有效措施。家蠶抗血液型膿病品種選育過程需要大量使用家蠶核型多角體病毒（BmNPV）。一對抗血液型膿病家蠶新品種的育成，需要添食病毒進行資源篩選、然后選配、固定成純種。其中抗性資源的篩選需要經(jīng)過育種工作者多年累代通過添食接種家蠶核型多角體病毒（BmNPV）進行蛾區(qū)或個體篩選；抗血液型膿病家蠶品種投入使用后，其母種也要再進行添食接種病毒從而維持品種的抗血液型膿病性能。目前廣西已育成多對抗BmNPV家蠶品種并推廣應(yīng)用，但尚未有相關(guān)標準對該病原（BmNPV）的擴繁、提取方法、保存方法等方面作出相關(guān)規(guī)定。為了確?？寡盒湍摬〖倚Q品種選育的正常進行，需要規(guī)范病原的制備技術(shù)，因此需制定《家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備技術(shù)規(guī)程》。本項目研究團隊長期從事家蠶育種和技術(shù)推廣，取得了相當(dāng)?shù)倪M展。2012年已育成并通過廣西農(nóng)作物審定對血液型膿病具有高抗性的桑蠶新品種“桂蠶N2”、桂蠶8號、桂蠶9號、桂蠶10號等。經(jīng)過前期研究，積累了豐富的經(jīng)驗，總結(jié)出2套方便高效規(guī)范的家蠶膿病病原(BmNPV)擴繁方法（活蛹注射、經(jīng)口添食5齡起蠶）。擴繁得到的病蠶、病蛹經(jīng)破碎、過濾，差速離心提取、即可收集保存?zhèn)溆谩Ｖ苽涞牟《镜幕钚院蜐舛染軡M足抗家蠶血液型膿病品種選育需要。項目編制過程（一）成立標準編制工作組團體標準《家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備技術(shù)規(guī)程》項目任務(wù)下達后，廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站成立了標準編制工作組，起草單位制定了起草編寫方案與進度安排，明確任務(wù)職責(zé)，確定工作技術(shù)路線，開展標準編制工作。編制工作組下設(shè)三個組，分別是資料收集組、草案編寫組、標準實施組。資料收集組負責(zé)國內(nèi)外有關(guān)家蠶核型多角體病毒制備文獻資料的查詢、收集和整理工作，查閱前人對家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備技術(shù)的研究情況。草案編寫組負責(zé)起草標準草案、征求意見稿和標準編制說明、送審稿及編制說明的編寫工作，包括后期召開征求意見會、網(wǎng)上征求意見，以及標準的不斷修改和完善。標準實施組負責(zé)《家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備技術(shù)規(guī)程》團體標準發(fā)布后，對標準進行詳細解讀，讓相關(guān)從業(yè)技術(shù)人員了解標準，并根據(jù)標準要求規(guī)范工作，并對標準實施情況進行總結(jié)分析，不斷對團體標準提出修正意見。（二）收集整理文獻資料標準編制工作組收集了國內(nèi)有關(guān)核型多角體病毒制備的文獻資料。主要有：DB44∕T1239-2013油桐尺蛾核型多角體病毒殺蟲劑生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程，DB51/T1207-2011桑蠶血液型膿病診斷技術(shù)規(guī)程DB42/T675-2010茶尺蠖核型多角體病毒制劑生產(chǎn)及應(yīng)用技術(shù)規(guī)程NY∕T3279-2018苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒NY/T3280-2018病毒微生物農(nóng)藥棉鈴蟲核型多角體病毒（三）研討確定標準主體內(nèi)容標準編制工作組在對收集的資料進行整理研究之后，召開了標準編制會議，對標準的整體框架結(jié)構(gòu)進行了研究，并對標準的關(guān)鍵性內(nèi)容進行了初步探討。經(jīng)過研討，標準的主體內(nèi)容確定家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備技術(shù)的術(shù)語定義、設(shè)施設(shè)備、復(fù)壯、擴繁、提取技術(shù)及保存。（四）調(diào)研及形成草案、征求意見稿工作小組在實地調(diào)研及實驗基礎(chǔ)上查閱了大量的國內(nèi)外文獻資料，并對本項目組多年來的家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備方法進行系統(tǒng)總結(jié)，形成了標準的基本構(gòu)架。2023年3-4月，在前期工作的基礎(chǔ)之上，整合已有的參考資料中有關(guān)家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備技術(shù)要求，并結(jié)合廣西在品種選育過程中制備家蠶核型多角體病毒（BmNPV）的實際要求的基礎(chǔ)上，按照簡化、統(tǒng)一等原則編制完成團體標準《家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備技術(shù)規(guī)程》（草案）。2023年5月，標準起草工作組以草案為基礎(chǔ)，提煉核心技術(shù)細節(jié)，并實際征求意見，通過收集的意見，標準編制工作組多次召開會議，對標準草案進行了反復(fù)修改和研究討論。進一步討論完善標準草案，形成團體標準《家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備技術(shù)規(guī)程》（征求意見稿）和（征求意見稿）編制說明。標準制定原則（一）實用性原則本文件是在充分收集相關(guān)資料和文獻，調(diào)研行業(yè)病毒制備技術(shù)情況，在現(xiàn)有國家、行業(yè)標準相關(guān)昆蟲多角體病毒的制備技術(shù)要求的基礎(chǔ)上，分析其它昆蟲核型多角體病毒制備現(xiàn)狀，結(jié)合廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站多年的病毒制備經(jīng)驗而總結(jié)起草的。具有較強的實用性和可操作性，便于理解掌握。（二）協(xié)調(diào)性原則本文件編寫過程中注意了與家蠶病毒制備的相關(guān)法律法規(guī)的協(xié)調(diào)問題，在內(nèi)容上與現(xiàn)行法律法規(guī)、標準協(xié)調(diào)一致。（三）規(guī)范性原則標準在試驗驗證和生產(chǎn)實踐的基礎(chǔ)上制定，以滿足行業(yè)需求為目的，實現(xiàn)病毒制備的規(guī)范性。標準起草工作組嚴格參照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的要求和規(guī)定編寫本標準的內(nèi)容，保證標準的編寫質(zhì)量。標準主要內(nèi)容及依據(jù)來源本標準確立了家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備技術(shù)的程序，界定了家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備技術(shù)涉及的術(shù)語和定義，規(guī)定了設(shè)施設(shè)備、制備原則的要求，以及病毒復(fù)壯、擴繁、提取保存等操作指示。（一）術(shù)語和定義明確了“復(fù)壯”“擴繁”的術(shù)語和定義，主要依據(jù)相關(guān)著作、論文、期刊等文獻資料結(jié)合家蠶核型多角體病毒制備的實際操作給出。（二）設(shè)施設(shè)備設(shè)復(fù)壯擴繁房間、病毒提取房間。復(fù)壯擴繁房間應(yīng)配備配置蠶架、蠶匾等附屬蠶具，溫濕度調(diào)控設(shè)備、消毒機具。病毒提取房間配備光學(xué)顯微鏡、低速離心機、純水機、冰箱、血球計數(shù)器、移液槍等。（三）制備原則這是由于家蠶核型多角體病毒能經(jīng)食下、創(chuàng)傷2種途徑感染家蠶，為了養(yǎng)蠶生產(chǎn)的安全，就必須做到病毒制備過程中病毒制備過程中產(chǎn)生的含病毒的廢渣廢液在病毒滅活后作無害化處理，嚴防病毒擴散到養(yǎng)蠶環(huán)境中。（四）制備技術(shù)參考文獻并結(jié)合起草單位多年的研究經(jīng)驗得出，具體見技術(shù)流程圖。病原復(fù)壯病原復(fù)壯擴繁活體蛹注射組織破碎收集病蛹/蠶經(jīng)口添食5齡蠶加超純水保存清洗過濾離心去底部大顆粒沉淀離心收集沉淀圖1家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備技術(shù)流程病原復(fù)壯病毒在保存過程中，保存時間越久，病毒的活性會降低。保存溫度越高，活性喪失越快。為了保證病毒擴繁增殖的成功率，必須保證接種擴繁時使用的病毒的活力。所以，在擴繁增殖前，需要將保存的病毒接種到活體寄主中使其恢復(fù)活力。方法如下：將保存的需要復(fù)壯的家蠶核型多角體病原配制成高濃度（1×108PIBs/ml以上）的病毒懸液，取桑葉在病毒懸液中浸泡，撈起晾干表面水分后添食BmNPV敏感品系的5齡起蠶，第2餐開始普通桑葉常規(guī)飼養(yǎng)，5-6天后收集出現(xiàn)狂躁爬行、環(huán)節(jié)和節(jié)間膜腫脹、氣門出現(xiàn)油浸斑，血液渾濁等典型病狀但是皮膚還未破裂的活蠶，用75％的酒精消毒蠶體，晾干后剪尾角收集血液備用。取血后的蠶體經(jīng)破碎過濾離心后收集多角體病毒。收集的病蠶血液用于后續(xù)擴繁增殖注射活蛹，取血后的蠶體經(jīng)過破碎過濾離心后收集的多角體病毒則用于后續(xù)的經(jīng)口添食5齡起蠶。家蠶核型多角體病毒（BmNPV）侵染家蠶有兩種方式：創(chuàng)傷感染和食下感染。家蠶核型多角體病毒（BmNPV）以兩種形式存在：包埋型病毒粒子（ODV）和出芽病毒粒子(BV)。其中ODV引起食下感染，BV引起創(chuàng)傷感染。ODV粒子外面包裹多角體蛋白，需要在堿性環(huán)境下才能溶解，釋放出病毒粒子，進行感染。所以如果直接用收集的ODV粒子注射蠶蛹（創(chuàng)傷感染），是不會發(fā)病。病蠶血液含大量的BV，所以需要用病血注射。擴繁增殖擴繁采用注射活蛹和添食5齡起蠶的2種方式進行。1.活蛹注射：選擇化蛹后24h～48h的BmNPV敏感品系健康蠶蛹，用注射器將復(fù)壯后取得的病蠶血液從蛹背部第2或第3環(huán)節(jié)接種到蛹體中。接種后的蠶蛹置于25-29℃的條件下發(fā)育，經(jīng)過72h開始有零星發(fā)病，96～120?h，開始大批量發(fā)病，到發(fā)病中后期，蛹體出現(xiàn)環(huán)節(jié)松弛，蛹體開始發(fā)軟的病狀，即可收集發(fā)病蛹。收集的病蛹于-18℃冰箱保存。家蠶核型多角體病毒的穩(wěn)定性與溫度高低有顯著差異。在高溫下，病毒失去活性較快。我們對BmNPV在夏天的室溫條件下（28-32℃，濕度74-85%）放置不同時間，再人工經(jīng)口接種2齡起蠶，統(tǒng)計幼蟲的發(fā)病率率。表一室溫下放置不同時間BmNPV添食2齡起蠶（兩廣二號）的發(fā)病率BmNPV濃度放置1d發(fā)病率%放置15d發(fā)病率%放置30d發(fā)病率%2×10646.671.670.001×10788.3335.000.00放置1d的病蠶體內(nèi)提取的病原的活力仍很強,在BmNPV濃度為1×107PIBs/mL時,感染家蠶發(fā)病率達88.33%，放置15d后,接種發(fā)病率下降至35%。30d后,病原基本失活,感染家蠶發(fā)病率為0。因此收集的病蠶、病蛹要及時低溫保存，以防喪失活性。注射時蛹齡太早，蛹體柔軟，極易受傷，操作容易使蛹受傷死亡；蛹齡晚則注射接種后收集的病毒中有蛾的鱗毛，影響病毒的純度。甚至蛹期還未發(fā)病即化蛾。收集病蛹的時間不能過早，過早則繁殖效率低，病毒量少；收集晚了則蛹體液化，病毒損失大甚至不能收集，而且容易其它病菌侵染，影響病毒純度，致使后面的使用效果不好。2.經(jīng)口添食5齡起蠶：經(jīng)復(fù)壯后的病原加入超純水重懸，利用血球計數(shù)板和光學(xué)顯微鏡對多角體進行計數(shù)，并配置成較高濃度（1×108PIBs/ml以上）的病毒懸液備用。取桑葉在病毒懸液中浸泡，撈起晾干表面水分后喂食BmNPV敏感品系的5齡起蠶，第2餐開始普通桑葉飼養(yǎng)，5-6天后收集出現(xiàn)典型病癥的病蠶，收集的病蠶于-18℃冰箱保存。蠶幼蟲有5個齡期，5齡幼蟲是蠶體最大的發(fā)育階段，是1齡幼蟲體重的10000倍左右，幼蟲階段增殖選擇5齡是基于病毒生產(chǎn)效率及病毒產(chǎn)量考慮，而家蠶對BmNPV的抗性在同一齡期一般起蠶最低，所以選在5齡起蠶時添食病毒來增殖，提高感染率。組織破碎將收集到的病蠶或病蛹，加入適量超純水破碎組織。此操作的目的是為了將病蠶或病蛹的病毒釋放到胞外。過濾破碎后加入超純水?dāng)嚢杈鶆?，?0目濾網(wǎng)過濾，濾渣再加入超純水?dāng)嚢柙龠^濾，重復(fù)2次，收集濾液。濾網(wǎng)目數(shù)過高，則過濾不下去；過小則濾液雜質(zhì)較多。離心收集的濾液500?rpm離心10?min，收集上層懸浮液，反復(fù)多次，直到500rpm離心10min后底部無大顆粒沉淀。將收集的懸浮液3000-4000rpm離心10min，留沉淀。此操作的原理是不同大小和比重的粒子有不同的沉降速度，核型多角體比重為1.26-1.28，利用不同轉(zhuǎn)速可去除雜質(zhì)，收集多角體。先500rpm離心可以去掉宿主組織細胞碎片及其它較大的雜質(zhì)，3000-4000rpm則能使病毒沉淀，收集到核型多角體病毒。清洗在收集的沉淀中加入超純水，重懸成懸浮液，3000-4000rpm離心10min，留沉淀。多次重復(fù)此步驟，直至沉淀呈現(xiàn)出灰白色。保存病毒沉淀等量加入50%甘油，用移液器吹打，將甘油與病毒沉淀混合均勻，封口貼標簽于-18℃冰箱中保存。表二-18℃保存不同時間用6×106添食2齡起蠶發(fā)病率發(fā)病蠶頭數(shù)存活頭數(shù)發(fā)病率%-18℃保存時間1053177.21新鮮提取2025977.404個月922876.635個月431377.507個月611976.259個月822278.8511個月（添食的家蠶品種為芙蓉）可見保存于-18℃的病毒，保存時間在1年內(nèi)，添食芙蓉2齡起蠶，發(fā)病率與新鮮病毒基本一致。另據(jù)《廣西家蠶血液型膿病及生物藥物防治的研究》報道50%甘油4℃保溫13年的家蠶核型多角體樣本，經(jīng)離心后添食5齡幼蟲，仍能使之感染發(fā)病。消毒清洗整個過程使用過的金屬用具經(jīng)煮沸消毒清洗，再75%酒精浸泡消毒；其它用具使用含有效氯1%的漂白精溶液浸泡消毒、清洗，按照DB45/T?83?《種繭育養(yǎng)蠶技術(shù)規(guī)程》的規(guī)定執(zhí)行。表三家蠶核型多角體病毒對物理因素的穩(wěn)定性（引至《蠶病學(xué)》）處理溫度（℃）失活時間日光4020h濕熱1003min干熱10045min國內(nèi)同類標準制修訂情況及與法律法規(guī)、強制性標準關(guān)系經(jīng)查閱，目前沒有與家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備