(高清版)GB∕T 38164-2019 常見畜禽動物源性成分檢測方法 實時熒光PCR法

常見畜禽動物源性成分檢測方法實時熒光PCR法國家市場監(jiān)督管理總局中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會I1ATP8:ATP合成酶亞基8(ATPsynthasesubunit8)cytb:細胞色素b(Cytochromeb)2Na?-EDTA:乙二胺四乙酸二鈉(EthylenediaminetetraacND1:煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化還原酶亞基1(NicotinamideadeninedinucleotideoxidoreductaseTris:三羥甲基氨基甲烷(Trishydroxym通過物種特異性引物及探針進行畜禽動物源性成分的實時熒光PCR擴增，根據(jù)PCR擴增反應(yīng)中內(nèi)參照引物探針序列和常見畜禽動物特異性引物探針序列見表1。目標(biāo)物種內(nèi)參基因F:TCTGCCCTATCAACTTTCGR:AATTTGCGCGCCTGCTGP:5'FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-318SrRNA基因F:TGGAGTAATCCTTCTGCTP:5'FAM-AGCATTTATAGGATACGTCC-3'cytb基因R:CTCCTAGGAGGGAGCCGAP:5'FAM-CAACGCATTCATTGACCTTCCAGCTCCAT-3cytb基因水牛P:5'FAM-ACTTTGGCTCTCTCC-3'ATP8基因駱駝P:5'FAM-CCTACACGAAACAGGCTCTAATAACCCGAC-3cytb基因梅花鹿R:GGTGCACTCTCAATAACP:5'FAM-CACTGTAGCTACTCAAGAAGC-3COI基因馬鹿P:5'FAM-AGGACTTGGCGGTGCTTTAT-312SrRNA基因馴鹿P:5'FAM-CCAACTTTAATCAAGCGCCT-316SrRNA基因3表1(續(xù))目標(biāo)物種山羊P:5'FAM-CATAGGCTATGTTTTACCATGAG-3cytb基因綿羊P:5'FAM-TATTACCAACCTCCTTT-3'cytb基因P:5'FAM-CCCCTCAACGTACTAACAGTAACCAGAC-316SrRNA基因鴨P:5'FAM-CCTACTGGCTATGCACTACACCGCAGAC-3'Ecytb基因鵝R:TCTTGTTTTTGGAGGATP:5'FAM-CCATCGCAGAGCCTGGTCGATATTTTT-3'E16SrRNA基因鵪鶉P:5'FAM-ATGGCCCTGAGGCAC-3'E12SrRNA基因水貂P:5'FAM-CCTCCTAGTCTTCATGCCAATCGT-3'cytb基因貓P:5'FAM-CACTTCCAGTCTTAGCAGCGG-3'ECOI基因兔P:5'FAM-ACAAGCCAGTTCCCGAAGCCTCCA-3'ECOI基因豬F:ATCTACATGATTCATTACP:5'FAM-ATCTCAAACTACTCATACCCA-3ATP8基因狗P:5'FAM-ATCACTTAGTCCAATAAGG-3'D-loop基因F:TGGAGCATCAGTAGACCTTAR:GGCGGGAGGTTTTATATTP:5'FAM-CCCTGCACCTGGCCGGAGTC-3COI基因貉P:5'FAM-CATACTACTCCGGGAAAA-3'COI基因表1(續(xù))目標(biāo)物種雞P:5'FAM-CTATGAATCCGGGCCTC-3火雞F:GCCCTAACCCCTTAAGAAR:AGTTGCTATGGCTAAGTCAAP:5'FAM-CTTGCTTGAGCCACACC-3'12SrRNA基因鼠P:5'FAM-TACTGAATYCTAGTAGCCAACCT-3'cytb基因注：F代表上游引物；R代表下游引物；P代表探針。4依次用70%乙醇和雙蒸水沖洗2次～3次，收集到干凈50mL離心管或干凈密封袋中，-20℃以混勻后直接分裝到干凈50mL離心管或干凈密封袋中，-20℃以下凍存。8.4實時熒光PCR擴增樣品和對照設(shè)置2個平行的反應(yīng)體系，分別進行靶向基因和內(nèi)參基因擴增，以Ct平均結(jié)果。反應(yīng)體系的體積為25μL,體系組成見表2,反應(yīng)參數(shù)見表3。終濃度DNA模板(5ng/μL～50ng/μL)—56內(nèi)參照馬鹿山羊豬狗貉雞鼠鴨鵝兔水貂貓78ataggatacgtcctaccatgaggacaaatatcattacaacgcattcattgaccttccagctccatcaaacatttcatcatggtgaaaaactttggctctctcctaggcatctgcctaattctgcaaacctagtagccgtacacctacaattaaagacatcctaggagcactgctactatattaattctccttattctcgtactgttctcaccagacttattagtaaccccctcaatacaccaccacacatcaatagcttaaaactcaaaggacttggcggtgctttatacccttctagaggagcctgttctataatcgataaccccaatcaagcgccttaaattaactaatgatttcatcttaattagataggctatgttttaccatgaggacaaatatcattttgaggggcaacagtcatcactaatctaggctacgtcttaccatgaggacaaatatcattctgaggagcaacagttattaccaacctcctttcagcaattccatagagcctggtcgatatttttcggttggggcgaccttggaggagaacatcgtcagyattattgaaaataatctattaaatgaagagtctttgtagtatatcaattacyttggtcttgtaaaccaaaatgtatagtcatgcctattataattggaggcttcgggaactggcttgtccccctgataattggtattttattccaactaaaaatctcaaactactcatacccagcaagcccagaatcaaccgaact9atggtttgccccatgcatatagcatgtacataatattatattcttacataggacatatcaactcaatctcacaattccatatcacttagtccaataagggcttaatcaccatgcctcgagaaaccggagtctcttcaattttaggagctattaatttcatcactactattaactccgggaaaaaaga