血清蛋白電泳醋纖電泳圓盤電泳

關(guān)于血清蛋白電泳醋纖電泳圓盤電泳帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。電泳技術(shù)即是利用樣品中各種帶電粒子的帶電性質(zhì)、分子大小、形狀等的差異，在電場(chǎng)中的遷移速度不同，從而對(duì)樣品分子進(jìn)行分離、鑒定、純化和制備。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)多用于分離，純化、鑒定蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)。

一、電泳技術(shù)第2頁,共31頁，星期六，2024年，5月電泳的分類

(1)按支持物的裝置形式不同分為：1．平板式電泳：支持物水平放置；2．垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳第3頁,共31頁，星期六，2024年，5月掌握電泳法分離血清蛋白質(zhì)的原理掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的操作方法及臨床意義二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?頁,共31頁，星期六，2024年，5月本實(shí)驗(yàn)是以醋酸纖維素薄膜作為支持體的區(qū)帶電泳。

方法是將少量新鮮血清用點(diǎn)樣器點(diǎn)在浸有緩沖液的乙酸纖維素薄膜上，薄膜兩端經(jīng)過濾紙與電泳槽中緩沖液相連，所用緩沖液pH值為8.6，血清蛋白質(zhì)在此緩沖液中均帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。

三、實(shí)驗(yàn)原理第5頁,共31頁，星期六，2024年，5月醋酸纖維素膜：該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120μm，有很強(qiáng)的通透性，對(duì)分子移動(dòng)阻力很小。該薄膜電泳具有微量、快速、簡(jiǎn)便、分辨力高，對(duì)樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)第6頁,共31頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)名稱等電點(diǎn)相對(duì)分子質(zhì)量清蛋白4.8869000α1-球蛋白5.06200000α2-球蛋白5.06300000β-球蛋白5.1290000~150000γ-球蛋白6.85~7.50156000~300000人血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)及分子量第7頁,共31頁，星期六，2024年，5月經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶，從正極端依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，經(jīng)染色可計(jì)算出各蛋白質(zhì)的百分含量。γβα2α1清蛋白第8頁,共31頁，星期六，2024年，5月1.實(shí)驗(yàn)材料：未溶血的人血清2.實(shí)驗(yàn)試劑：巴比妥緩沖液氨基黑10B0.5％染色液漂洗液透明液3.實(shí)驗(yàn)器材：醋酸纖維薄膜（2×8cm）常壓電泳儀鑷子點(diǎn)樣器玻棒粗濾紙培養(yǎng)皿吸量管直尺及鉛筆四、試劑及器材第9頁,共31頁，星期六，2024年，5月1.準(zhǔn)備醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理：將薄膜小心放入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿內(nèi)，使其漂浮在液面；用鑷子輕壓，使其全部浸入緩沖液內(nèi)。待膜完全浸透（約半小時(shí)）后取出，夾在清潔的濾紙中間，輕輕吸去多余的緩沖液，同時(shí)分辨出光滑面和粗糙面。標(biāo)記：在粗糙面上用鉛筆距薄膜條一端1.5cm處劃線即為點(diǎn)樣線并作好標(biāo)記。五、試驗(yàn)方法第10頁,共31頁，星期六，2024年，5月電泳槽的準(zhǔn)備

電泳槽有兩個(gè)互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑色為負(fù)極。每個(gè)槽上都有一根可移動(dòng)的橫桿，紗布的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，形成了紗布橋。第11頁,共31頁，星期六，2024年，5月2.點(diǎn)樣（關(guān)鍵）

取出浸透的薄膜，平放在濾紙上(無光澤面向上)，用濾紙輕輕吸去多余的緩沖液，薄膜的粗糙面向上平放在點(diǎn)樣模版上，底邊對(duì)齊，點(diǎn)樣區(qū)距負(fù)極1.5cm。點(diǎn)樣時(shí)，用磨光的玻片蘸取血清后，均勻的涂抹在點(diǎn)樣區(qū)，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗細(xì)均勻的直線。（見圖）注意：點(diǎn)樣時(shí)動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果

。另外操作過程要防止指紋污染。第12頁,共31頁，星期六，2024年，5月3.電泳將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂，使膜平衡10min。連接好電泳儀。在室溫下電泳，打開電源開關(guān)，電壓160v，60min。點(diǎn)樣端1.濾紙橋2.電泳槽3.醋酸纖維素薄膜4.電泳槽膜支架5.電極室中央隔板

第13頁,共31頁，星期六，2024年，5月4.染色電泳完畢立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。5.漂洗

用漂洗液漂洗，不停擺動(dòng)薄膜條，每10min左右換一次液，連續(xù)更換數(shù)次，直至背景顏色脫去。將膜夾在干凈濾紙中，吸去多余溶液。操作中，注意控制染色和漂洗的時(shí)間，防止背景過深或某些區(qū)帶太淺。第14頁,共31頁，星期六，2024年，5月6.記錄和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

漂洗完畢后將薄膜取出,放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對(duì)位置進(jìn)行描述、記錄在實(shí)驗(yàn)本上，并判斷分析其結(jié)果。

第15頁,共31頁，星期六，2024年，5月血漿蛋白是血漿最主要的固體成分，含量60～80g/L

絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細(xì)胞合成

正常值：白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％

α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％

γ球蛋白12％—20％血漿蛋白的主要功能:維持血漿膠體滲透壓調(diào)節(jié)血漿pH值,維持酸堿平衡運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),代謝物,激素,藥物及金屬離子等免疫作用七、臨床意義第16頁,共31頁，星期六，2024年，5月注意事項(xiàng)1、醋酸纖維素薄膜一定要充分浸透后才能點(diǎn)樣。點(diǎn)樣后電泳槽一定要密閉。電流不宜過大，以防止薄膜干燥，電泳圖譜出現(xiàn)條痕。

2、點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。3、點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的毛面上，點(diǎn)樣量要適量，不宜過多或過少。4、電泳時(shí)應(yīng)將薄膜的點(diǎn)樣端置于電泳槽的負(fù)極端，且點(diǎn)樣面向下。

5、通電過程中，不準(zhǔn)取出或放入薄膜。通電完畢后，應(yīng)先斷開電源后再取薄膜，以免觸電。6、應(yīng)控制染色時(shí)間。時(shí)間長(zhǎng)，薄膜底色不易脫去；時(shí)間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時(shí)可進(jìn)行復(fù)染。

第17頁,共31頁，星期六，2024年，5月血清蛋白質(zhì)聚丙酰胺凝膠圓盤電泳第18頁,共31頁，星期六，2024年，5月1.學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理

2.掌握聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳的操作技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?9頁,共31頁，星期六，2024年，5月二、實(shí)驗(yàn)原理聚丙烯酰胺凝膠：由丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱Acr）單體少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺通過化學(xué)催化劑（過硫酸銨），四甲基乙二胺（TEMED）作為加速劑或光催化聚合作用形成的三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。第20頁,共31頁，星期六，2024年，5月第21頁,共31頁，星期六，2024年，5月三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑1.實(shí)驗(yàn)材料：正常人血清2.實(shí)驗(yàn)器材：圓盤電泳槽、電泳儀、玻璃管（10cm×0.6cm）、洗耳球、培養(yǎng)皿、微量加樣器、注射器、小燒杯第22頁,共31頁，星期六，2024年，5月試劑號(hào)配方PH1單體交聯(lián)劑丙烯酰胺（Acr）30g甲叉丙烯酰胺（Bis）0.8g加蒸餾水到100ml2過硫酸銨1g+10ml蒸餾水3四甲基乙二胺（TEMED）4電泳緩沖液硼砂30.512g硼酸4.948g蒸餾水定容至1000ml工作液：90ml貯儲(chǔ)液+1440ml水9.05固定液三氯乙酸12.5g蒸餾水定容至1000ml6染色液CBBG-2500.1g溶于95%乙醇后，加蒸餾水到100ml3.實(shí)驗(yàn)試劑第23頁,共31頁，星期六，2024年，5月7分離膠緩沖液Tris6.06gEDTA1.17g定容至100ml8.88上樣緩沖液電泳緩沖液25ml蔗糖10g

0.05％溴酚藍(lán)5ml加蒸餾水至100ml9洗脫液、保存液冰乙酸38ml甲醇125ml蒸餾水338ml第24頁,共31頁，星期六，2024年，5月四、實(shí)驗(yàn)方法1.凝膠柱的準(zhǔn)備（1）取一只10cm×0.6cm潔凈﹑干燥的玻璃管，在7cm和8cm兩處做一個(gè)記號(hào)，一端用封口膜嚴(yán)實(shí)，垂直放好。（2）.按下表配制分離膠溶液試劑分離膠（ml）分離膠緩沖液?jiǎn)误w交聯(lián)劑雙蒸水10％過硫酸銨TEMED12.16.80.10.01把分離膠溶液混勻后，用自動(dòng)取液器吸取上述配好的分離凝膠貯液沿著小玻管內(nèi)壁小心準(zhǔn)確加入7cm高。第25頁,共31頁，星期六，2024年，5月（3）凝膠溶液加畢后，隨即吸取蒸餾水，加至管中的凝膠表面，使其表面覆蓋一水層（水封，1.0cm高）。在灌膠和封水的過程中，操作要輕，以避免產(chǎn)生氣泡。（4）將加注好的凝膠管于室溫下靜置，以進(jìn)行聚合反應(yīng)，在正常情況下大約30-60分鐘后，待界面出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象時(shí)，表明膠已聚合完畢，先用習(xí)慣吸去上面的水層，在用濾紙將殘留的水分吸干。2.樣品液制備取正常人血清0.1ml，與1.9ml的上樣緩沖液混合3.裝柱

將凝膠管插入電泳槽槽底橡膠塞孔中，加入電極緩沖液與下電泳槽，隨后放入凝膠管及上槽，除氣泡(上電極槽以電極和凝膠管完全浸入為宜，下電極槽以凝膠管浸入3/5為宜)。用微量注射器吸去混合后的樣品液30μl加到分離膠面上（加樣槍不可插入過深，以免刺破凝膠，同時(shí)要緩慢、均勻，以免攪動(dòng)緩沖液引起樣品擴(kuò)散），最后加入電泳緩沖液。第26頁,共31頁，星期六，2024年，5月4.電泳接通電源，上負(fù)下正，調(diào)節(jié)電流3mA/管，電壓260V-280V，待示蹤染料離管下口0.5cm時(shí)切斷電源。第27頁,共31頁，星期六，2024年，5月5.剝膠注入蒸餾水做潤(rùn)滑劑，針頭螺旋式前進(jìn)，緩緩剝離，最后用洗耳球在管的一端輕輕擠壓，另一端對(duì)著一干凈大小適宜的培養(yǎng)皿內(nèi)，此時(shí)可以將凝膠柱壓出玻管。第28頁,共31頁，星期六，2024年，5月6.固定和染色用固定液浸泡凝膠條，此過程用來固定蛋白質(zhì)，10min后倒去固定液，再加入染色液，在90℃水浴染色15min，倒去染色液。7.脫色將染色完畢的膠條用脫色液浸泡，中間更換1~2次脫色液并浸泡過夜，將浮色脫去進(jìn)行觀察染好色的蛋白帶第29頁,共31頁，星期六，2024年，5月丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑，可經(jīng)皮膚、呼吸道等吸收，對(duì)皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸，故操作時(shí)要注意保護(hù)沒有聚