3.2 基因工程的基本操作程序-2023-2024學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

1.2基因工程的基本操作程序課程導(dǎo)入：基因工程培育抗蟲棉的簡要過程提取棉花細胞(含抗蟲基因)蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因與運載體DNA拼接導(dǎo)入普通棉花(無抗蟲特性)棉花植株(有抗蟲特性)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育程序：將重組DNA導(dǎo)入選育棉花細胞內(nèi)

從具有抗蟲性狀的細菌DNA分子中獲取抗蟲基因?qū)⒖瓜x基因與運載體拼接成為重組DNA檢測和鑒定抗蟲基因在該棉花細胞中表達1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定基因工程基本操作的四個步驟有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用

載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。前提核心關(guān)鍵保證一、目的基因的獲取1、目的基因：主要是指______________________，也可以是一些___________________。編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因具有調(diào)控作用的因子（1）什么是基因？（2）基因的作用是什么？請思考：基因是指具有遺傳效應(yīng)的DNA片段。表達遺傳信息，控制生物性狀。

反義基因是指一段與mRNA或DNA特異性結(jié)合并阻斷其基因表達的人工合成的DNA分子。英國科學(xué)家將西紅柿DNA的反義鏈用基因工程技術(shù)插入西紅柿的細胞中，培育出的西紅柿品種成熟后，細胞中多聚半乳酸糖醛酶的生成受到了干預(yù)，因而這種酶的含量比原來的普通西紅柿的含量低了99%。從而使西紅柿成熟后不軟化，便于運輸和貯存。2、獲取目的基因的常用方法①從基因文庫中獲取目的基因②利用PCR技術(shù)擴增目的基因觀察左圖，思考：提取目的基因的方法有哪些？（1）從自然界已有的生物材料中分離（2）人工合成方法1：從基因文庫中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。1.基因文庫（genelibrary）概念2.基因文庫類型基因組文庫部分基因文庫（包含一種生物的所有基因）（包含一種生物的一部分基因）（cDNA文庫）提取某種生物的全部DNA用適當?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲存基因組文庫基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫(Genomiclibrary)

是指將某種生物體的全部DNA提取出來，用限制酶切成一定范圍大小的DNA片段，分別與載體連接起來，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，每個受體菌都含一段不同的DNA片段，這個群體包含了這種生物的所有基因，叫做這種生物的基因組文庫。其目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因。某種生物的單鏈mRNA單鏈互補DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲存與載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶cDNA文庫的構(gòu)建cDNAcDNA(互補DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的互補DNA片段；cDNA文庫(cDNA

library)

與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群就叫做這種生物的cDNA文庫。基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較啟動子具有種屬特異性DNA基因1

基因2

基因3放大基因的結(jié)構(gòu)每個DNA分子含有許多基因，基因在染色體上呈線性排列。（1）原核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼蛋白質(zhì)，連續(xù)①調(diào)控遺傳信息的表達，上游有啟動子，下游有終止子②不編碼蛋白質(zhì)啟動子終止子…………TACACGTGCATCAAT……………………ATGTGCACGTAGTTA…………編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子ATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATRNA聚合酶AUGUGCACGUAGUUA

啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。

RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì)。

終止子：位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)（能編碼蛋白質(zhì)）啟動子終止子外顯子內(nèi)含子編碼蛋白質(zhì)，不連續(xù)（不能編碼蛋白質(zhì)）（2）真核細胞的基因結(jié)構(gòu)（3）原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_________的編碼區(qū)是間隔的、_________的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的__________和具有調(diào)控作用的__________區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼相應(yīng)酶原核細胞中有沒有？思考：如果把一個真核生物的基因?qū)朐思毎斜磉_，從基因組文庫中獲取目的基因，還是從cDNA文庫中？（4）真核細胞cDNA的獲取不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子cDNA是mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的互補DNA（1）為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？

構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，不一定要構(gòu)建基因文庫。但如果：所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個體發(fā)育的不同階段表達的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫。請思考：依據(jù)目的基因的有關(guān)信息，如根據(jù)：基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。（2）如何從基因文庫中得到所需要的基因？（1）概念：PCR全稱為_________________

，是一項在生物_______復(fù)制________________的核酸合成技術(shù)。（3）條件：___________________、____________________________、

________________________、_________、_______________________。（2）原理：____________多聚酶鏈式反應(yīng)體外特定DNA片段模板（目的基因）四種脫氧核苷酸（dNTP）引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）DNA復(fù)制緩沖液（其中需要Mg2+）方法2：利用PCR技術(shù)擴增目的基因（4）PCR技術(shù)的操作過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________b、退火（55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加_____倍變性退火延伸一Taq酶（thermusaquaticus)/熱穩(wěn)定DNA聚合酶

最初由Saiki等從溫泉中分離的一株水生噬熱桿菌（thermusaquaticus）中提取獲得。此酶能耐高溫，在70℃反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%，因此不必每輪循環(huán)時重新加入新酶。（6）方式：以________方式擴增，即_______（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）（7）結(jié)果：__________________________________________。使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增指數(shù)2n（5）前提：__________________________________,以便根據(jù)這一序列合成引物。有一段已知目的基因的核苷酸序列（8）儀器：_______________。PCR擴增儀PCR技術(shù)擴增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)原則場所條件解旋方式酶特點結(jié)果堿基互補配對原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATPdNTP、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制主要在細胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶等請思考？1、四種脫氧核苷酸就是dNTP嗎？dNTP是脫氧核糖核苷三磷酸的縮寫，是包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP等在內(nèi)的統(tǒng)稱，N是指含氮堿基，代表變量指代A、T、G、C等中的一種，在PCR中起原料作用。不是請思考？4、1個DNA分子進行PCR擴增,循環(huán)4次，理論上至少需要幾個引物？2×（2n-1）(n為循環(huán)次數(shù))（24-1）×2=302、PCR擴增消耗的能量來源于哪？3、細胞內(nèi)DNA復(fù)制時需要引物么？高溫和dNTP需要蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成（1）適用條件：在基因較小，核苷酸序列已知。方法3：人工合成（2）方法：通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因。（3）過程：DNA合成儀

不具有，缺少非編碼區(qū)(啟動子、終止子）和非編碼序列（如內(nèi)含子），要人工構(gòu)建。人工合成的目的基因是否具有完整基因結(jié)構(gòu)的基因？請思考？獲取目的基因的方法總結(jié)方法基因文庫的構(gòu)建PCR技術(shù)擴增人工合成基因組文庫部分基因文庫(如cDNA文庫)優(yōu)點操作簡單專一性可在短時間內(nèi)大量擴增目的基因?qū)Ｒ恍詮?，可產(chǎn)生自然界中不存在的新基因缺點工作量大、盲目性大、專一性差操作過程較麻煩，技術(shù)要求過高需要嚴格控制溫度、技術(shù)要求高適用范圍小1、若未知目的基因的核苷酸序列，可采用_________________2、若已知目的基因兩端的核苷酸序列，且基因比較大，可采用____________

3、若已知目的基因序列，且基因比較小，可采用________________PCR技術(shù)擴增化學(xué)方法人工合成從基因文庫獲取的方法選擇不同獲取目的基因的方法的依據(jù)連一連：獲取目的基因的方法及適用范圍？1.已知核苷酸序列，基因較小a.從基因文庫中獲取條件方法2.已知核苷酸序列,或部分序列,基因較大3.核苷酸序列未知，無mRNA4.已知相關(guān)基因?qū)?yīng)的mRNAb.從基因文庫中獲取或PCRc.從cDNA文庫中獲取或逆轉(zhuǎn)錄后PCRd.人工直接合成尋根問底：

將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，結(jié)果會怎樣？

有人采用總DNA注射法進行遺傳轉(zhuǎn)化：即將一個生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體細胞，沒有進行表達載體的構(gòu)建。這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定什么基因?qū)肓耸荏w細胞。此法目前爭議頗多，嚴格來說不算基因工程。（1）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代（2）使目的基因能表達和發(fā)揮作用思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？二、基因表達載體的構(gòu)建—基因工程的核心1、構(gòu)建基因表達載體的目的：資料:

科學(xué)家在培育抗蟲棉時，起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達。

然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因啟動子，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因終止子，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。

資料說明：目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子等。標記基因2、基因表達載體的組成：鑒別受體細胞中是否含有目的基因;將有目的基因的細胞篩選出來ori，是DNA復(fù)制的起點，作用是帶動DNA復(fù)制問題：為什么要進行篩選？把什么篩選出來？怎樣篩選？能夠控制特定性狀質(zhì)粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA3、基因表達載體的構(gòu)建過程：質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個切口兩個黏性末端限制酶的選擇：

在切割目的基因和載體時，要求用同一種限制酶，目的是

，如

。產(chǎn)生相同的黏性末端PstI

也可使用兩種不同的限制酶分別切割目的基因和載體，目的是

，如

。避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接PstI和

EcoRI限制酶的選擇標準：（1）選擇的限制酶在目的基因和載體上都有其切點（一般不同的限制酶切割形成的黏性末端不同）。（2）應(yīng)選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，切點位于目的基因內(nèi)部的限制酶不能選。（3）目的基因插入載體的位置必須位于啟動子和終止子的中間。（4）為確保調(diào)控序列的功能，選擇的限制酶不能破壞標記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點等結(jié)構(gòu)。（5）如果所選限制酶的切點不是一個，則切割重組后可能丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制原點區(qū)，則重組DNA進入受體細胞后不能自主復(fù)制。①質(zhì)粒自身環(huán)化②目的基因自身環(huán)化③目的基因與質(zhì)粒連接形成重組質(zhì)粒①自身環(huán)化的質(zhì)粒②自身環(huán)化的目的基因③目的基因與質(zhì)粒連接形成重組質(zhì)粒④什么都沒導(dǎo)入DNA連接酶連接后的結(jié)果可能是：導(dǎo)入受體細胞后的結(jié)果可能是：空質(zhì)粒問題：怎樣區(qū)別自身環(huán)化質(zhì)粒和重組質(zhì)粒？抗四環(huán)素基因抗氨芐青霉素基因外源基因AmpTetAmpAmpTetTet重組DNA空載體沒有導(dǎo)入或目的基因環(huán)化氨芐青霉素抗性基因（amp）四環(huán)素抗性基因（tet）√其他標記基因：

有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識目的基因表達的產(chǎn)物存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。基因工程載體的構(gòu)建需要考慮哪些因素（1）基因的特點：①如果一個來自動物的目的基因含有內(nèi)含子，就不能用于轉(zhuǎn)基因植物，因為動物中內(nèi)含子的剪接系統(tǒng)與植物的不同，植物不能將動物基因的內(nèi)含子剪切掉，只能用該基因的cDNA。②基因的產(chǎn)物如果是一個糖蛋白，那么該基因在原核生物細菌中表達出來的蛋白就可能不具備天然狀態(tài)下的活性，因為糖蛋白上的糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加上的，而細菌無這些細胞器。（2）要選擇強啟動子或組織特異性啟動子。啟動子有強有弱，選擇強啟動子可以增加轉(zhuǎn)錄活性，使基因產(chǎn)物量增多。如果希望基因在生物的某個組織表達，如只在植物種子中表達，就要選擇種子中特異表達的啟動子。

既用到限制酶切割載體和目的基因，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵。關(guān)于構(gòu)建基因表達載體的易錯點分析（1）載體≠表達載體

二者都有標記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。（2）用到的工具酶：（5）目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。（3）啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少。（4）啟動子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子起始（終止）密碼子啟動子（終止子）本質(zhì)位置作用三個相鄰堿基DNA片段位于mRNA上位于DNA上啟動（終止）翻譯啟動（終止）轉(zhuǎn)錄（一）轉(zhuǎn)化：（三）方法將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細胞穩(wěn)定表達三、將目的基因?qū)胧荏w細胞（二）原理：借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。1、將目的基因?qū)胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌的特點:①能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力；③農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到其染色體上。②當植物受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細胞；將目的基因?qū)胫参锛毎捎米疃嗟姆椒ㄞD(zhuǎn)化過程:基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。（2）基因槍法常用的金屬顆粒有鎢粉粒子和金粉粒子。特點：①常用于單子葉植物的轉(zhuǎn)化；②成本較高。（3）花粉管通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆螅ǚ坌纬傻幕ǚ酃苓€未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。

我國的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用此種方法獲得的。2、將目的基因?qū)雱游锛毎椒?顯