浙大生物化學課件15：DNA的生物合成

生物化學浙江大學生命科學學院江輝第十五章DNA的生物合成第一節(jié)半保留復制第二節(jié)DNA復制的酶學第三節(jié)DNA生物合成過程第四節(jié)DNA的損傷修復第五節(jié)逆轉錄現(xiàn)象和逆轉錄酶有關DNA的兩個問題為什么大腸桿菌20分鐘就可以繁殖一代，而生長最快的動物小母家鼠生長40天才成熟？為什么可通過DNA測序進行親子鑒定？中心法則基因：是為生物活性產(chǎn)物編碼的DNA功能片段，這些產(chǎn)物主要是蛋白質或是各種RNA。DNA的生物合成（復制）復制的要點半保留復制有起始點、終止點和方向

半不連續(xù)復制第一節(jié)半保留復制當細胞分裂，DNA進行復制時，雙螺旋結構解開而成為單鏈，用于合成新的互補鏈。子代細胞出現(xiàn)新的DNA雙鏈，其中一股單鏈是從親代完整地接受過來的舊鏈；另一股單鏈是完全重新合成的新鏈，且按堿基配對原則與舊鏈互補。1、Watson和Crick的半保留復制模型DNA雙螺旋的兩條鏈堿基通過A-T、G-C之間的氫鍵聯(lián)結，并且兩條鏈互補。因此，Watson和Crick提出DNA的半保留復制模型。雙螺旋揭開，每條鏈作為模板，以四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）為底物，在依賴于DNA的DNA聚合酶催化下，按照A-T、G-C配對方式，合成與兩條模板鏈脫氧核苷酸對應的兩條新鏈，然后以一新一舊脫氧多核苷酸組成的雙鏈分別進入子細胞。2、模型的試驗證明1958年Meselson和Stahl用密度梯度離心法結合同位素標記法進行證明試驗：1）將大腸桿菌在含標記的15NH4Cl的培養(yǎng)基內(nèi)，繁殖12代，保證DNA上的N都是15N；2）將上述培養(yǎng)好的細菌轉入到含14NH4Cl的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，并在細菌剛轉入14NH4Cl中（0代）以及在此培養(yǎng)基中分裂1、2、3、4代時分別取樣分析；3）DNA用密度梯度平衡離心法進行高速長時間離心，由于15N-DNA的比重大于14N-DNA，在氯化銫溶液中離心時分別處在不同密度的層次中（重在下，輕在上）。DNA半保留復制的實驗證據(jù)0代：兩條單鏈全為重的（處于下層）；1代：全部為一輕一重的雜合分子（處于上層和下層之間）；2代：一種是15N-14N，與第1代的一樣；另一種是全部輕的14N-14N。兩者比為1∶1；3代：仍有兩種分子，但14N-14N增多，兩者比為1∶3；4代：兩者比為1∶7。3、半保留復制意義DNA在代謝上的穩(wěn)定保證了遺傳信息的穩(wěn)定性。

第二節(jié)DNA復制的酶學底物：dNTP（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）聚合酶：DNA依賴的DNA聚合酶（DNA-polymerase）模板：單鏈的DNA母鏈引物：寡核苷酸引物（RNA）其他酶和蛋白質因子：拓撲異構酶、解螺旋酶、單鏈結合蛋白、DNA連接酶DNA聚合酶的活性5′至3′的聚合活性5′→3′方向核酸外切酶活性5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性一、復制的化學反應5′至3′的聚合活性（5′→3′）核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性聚合反應在DNA聚合酶催化下，四種脫氧核糖核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）被加到DNA鏈的3′末端，同時釋放出無機焦磷酸。1、DNA鏈的游離3′-羥基對進入的dNTP磷原子發(fā)生親核攻擊，形成3′,5′-磷酸二酯鍵，并脫下焦磷酸。2、形成磷酸二酯鍵的能量來自α-與β-磷酸基之間高能鍵的裂解。3、聚合反應可逆，但隨焦磷酸的水解可推動反應的完成。4、DNA鏈由5′向3′方向延長。5、需要有游離的3′-羥基，即需要引物鏈。DNA聚合反應特點DNA聚合酶模板鏈合成的新鏈模板鏈二、DNA聚合酶1、原核生物：DNA聚合酶I（polI）：與校對、修復有關A、DNA聚合酶活力：通過核苷酸聚合反應使DNA鏈沿5′→3′方向延長；B、3′→5′核酸外切酶活力：由3′端水解DNA鏈。在正常情況下該活力受抑制，一旦出現(xiàn)錯配堿基時，聚合反應停止，該活力會切去錯配堿基，起校對作用；C、5′→3′核酸外切酶活力：由5′端水解DNA鏈。切除嘧啶二聚體和RNA引物。polI切除岡崎片段5′端RNA引物5′→3′核酸外切酶活力DNA聚合酶活力polI的結構單鏈多肽，用枯草桿菌蛋白酶進行有限水解，可得兩個大小不同的片段。小片段：5′→3′核酸外切酶活性；

大片段（Klenow片段）：聚合活性、3′→5′外切活性（常用工具酶）DNA聚合酶II（polII）：可能在DNA修復中起作用以帶有缺口的雙鏈DNA為模板和引物，從5′→3′方向合成DNA，同時具有3′→5′外切酶活力。多亞基聚合酶含有DNA聚合酶活性和3′→5′核酸外切酶活性不具有5′→3′核酸外切酶活性反應需要NH4+

激活是一種主要起修復作用的酶。DNA聚合酶III（polIII）：真正起復制作用的酶由10種亞基組成的不對稱二聚體，α、ε、θ組成核心酶?；钚裕壕酆匣钚浴?′→5′外切活性。α+ε+θ→polIII（核心酶）polIII+τ→polIII′polIII′+γ+δ→polIII*（全酶）α具有聚合酶活力，ε具有校對功能，θ是組建核心酶因子，τ是二聚化因子，γ和δ是延長因子，β識別引物并引導聚合酶結合，復制起始時被釋放。polIII只作用于有缺口的雙鏈DNA，polIII′可作用于有引物的長單鏈DNA，polIII*是天然的聚合酶。polIII的結構催化亞基3′5′核酸外切酶活性polIII-DNA結合示意圖大腸桿菌三種DNA聚合酶的比較DNA聚合酶IDNA聚合酶IIDNA聚合酶III結構基因polApolBpolC,holE,dnaN,dnaX,dnaZ,dnaQ,holA亞基數(shù)目1≥7≥10分子量103,00088,000830,0005′→3′聚合作用+++3′→5′外切酶+++5′→3′外切酶+--聚合速度（核苷酸/min）1,0002,400≥15,000持續(xù)合成能力3~2001,500≥500,000功能切除引物，修復修復復制2、真核生物DNA聚合酶α：與隨從鏈的合成有關。需要以缺口雙鏈或帶引物的單鏈DNA為模板，引物是DNA或RNA短鏈，RNA引物由引物合成酶合成DNA聚合酶β：核酸外切酶活性，與修復有關DNA聚合酶γ：存在于線粒體。以RNA為模板，以DNA短鏈為引物DNA聚合酶δ：與領頭鏈的合成有關。具有3′→5′外切酶活力DNA聚合酶ε：與校讀、修復和填補缺口有關3、復制的保真性核酸外切酶活性和即時校讀polI，polII，polIII的ε亞基的3′→5′外切酶活性復制的保真性和堿基選擇先形成氫鍵，再生成磷酸二酯鍵依賴三種機理遵守嚴格的堿基互補配對規(guī)律聚合酶在復制延長中對堿基的選擇功能復制中出錯時有即時校讀功能三、DNA拓撲學變化中的酶1、DNA拓撲異構酶類型I拓撲異構酶：催化DNA雙鏈中的一條鏈的斷裂和再連接，反應無需能量；類型II拓撲異構酶：催化DNA雙鏈的斷裂和再連接，反應需消耗ATP；原核生物中拓撲異構酶只能消除負超螺旋，真核生物中能消除正、負超螺旋。2、解螺旋酶領頭鏈：rep蛋白沿模板鏈的3′→5′移動隨從鏈：解螺旋酶Ⅱ、DnaB沿模板鏈的5′→3′移動3、單鏈DNA結合蛋白（SSB）維持模板處于單鏈狀態(tài)保護單鏈的完整四、引物酶和引發(fā)體引物酶：RNA聚合酶（DnaG）引發(fā)體：DnaA辨認復制啟始點，再結合DnaB、DnaC及其他復制因子形成復合體、rep蛋白五、DNA連接酶（ligase）催化兩段DNA之間的連接NAD:煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NMN:煙酰胺單核苷酸聚合酶+AMP連接酶DNA連接酶催化雙鏈DNA切口處的5′-磷酸基和3′-羥基生成磷酸二酯鍵。1）形成酶-AMP復合物

NAD++連接酶→連接酶-AMP+NMN（細菌中）

ATP+連接酶→連接酶-AMP+PPi（動物中）2）形成A-P-P-DNA

連接酶-AMP+5′-P-DNA→A-P-P-DNA+連接酶

形成了焦磷酸鍵3）生成3′,5′-磷酸二酯鍵

DNA-OH-3′+A-P-P-DNA→DNA-O-P-DNA+AMP

相鄰鏈3′-OH對活化的磷原子發(fā)生親核攻擊。第三節(jié)DNA生物合成過程一、復制的起始1、DNA解成單鏈：原核生物從一個固定的起始點開始，同時向兩個方向進行的，稱為雙向復制——θ復制DNA復制叉的結構示意圖真核細胞染色體比較復雜，可能有多個復制起點，同時形成多個復制單位。復制叉：復制開始后由于DNA雙鏈解開，在兩股單鏈上進行復制，形成在顯微鏡下可看到的叉狀結構，稱為復制叉。E.coli復制起始點oriC跨度為245bp，包含有三組串聯(lián)重復序列和兩對反向重復序列。復制的起點單個固定的起點：原核生物的染色體和質粒、真核生物的細胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈分子，具有單個固定的起點；多個起點：真核生物染色體是線性雙鏈分子，含有許多起點多復制子。復制方向直線雙向式：單起點，雙方向，有對稱的和不對稱的；多起點雙向式：真核生物染色體DNA的復制；θ型雙、單向式：環(huán)狀DNA的復制。有雙向和單向（單向的形成一個復制叉，雙向的形成兩個復制叉），有對稱和不對稱（一個叉完成1/5，其余4/5由另一個叉完成）；D-環(huán)式：單向復制。在固定點解開后一條鏈先復制，待復制到一定距離時，露出另一鏈的復制起點，才開始另一鏈的復制；滾動環(huán)式：單向復制。共價閉環(huán)雙鏈分子的正鏈由核酸內(nèi)切酶在一特定位點切開，游離出的5′-磷酸基末端固定在細胞膜上，然后以環(huán)狀負鏈為模板，從正鏈的3′-OH末端延長形成正鏈。滾環(huán)復制低等生物如質粒，復制時采用滾環(huán)復制。環(huán)狀DNA雙鏈一股先開一個缺口，5′端向外伸展。兩股鏈均直接作為模板，不需要另外合成引物。2、引發(fā)體的生成復制過程需要引物——短鏈RNA引物酶：合成RNA引物（十個nt左右），方向為5′→3′DnaA辨認復制啟始點，然后引物酶進入（DnaG蛋白），加上解螺旋酶、DnaB蛋白和DnaC蛋白等，與DNA的起始復制區(qū)域形成引發(fā)體。DNA聚合酶III：由其β亞基辨認引物，新鏈的第一個脫氧核苷酸與引物的3′-OH形成磷酸二酯鍵，開始復制。拓撲異構酶：松弛螺旋。復制過程中各酶和蛋白質因子的作用二、復制的延長原核生物為polIII真核生物為DNA聚合酶α和δ，其中α與隨從鏈的合成有關，δ與領頭鏈的合成有關1、復制延長的生化過程原核生物復制延長的速度很快真核生物復制有多個復制起點2、復制的半不連續(xù)性和岡崎片段領頭鏈是連續(xù)合成的，而隨從鏈則是不連續(xù)合成岡崎片段：岡崎用電子顯微鏡看到了DNA復制過程中出現(xiàn)一些不連續(xù)片段，這些不連續(xù)片段只存在于DNA復制叉上其中的一股。后來就把這些不連續(xù)的片段稱為岡崎片段。前導鏈的延伸DNA聚合酶單鏈結合蛋白解螺旋酶DNA拓撲異構酶三、復制的終止1、原核生物復制終止及不連續(xù)片段連接復制有終止點ter領頭鏈是不間斷延長的，隨從鏈是生成一個個的岡崎片段，最后連接成一條完整的DNA鏈。polI5′→3′外切酶活性水解引物。polI聚合活性填補空隙。DNA連接酶連接缺口。滯后鏈RNA引物的切除:

DNA聚合酶Ⅰ的5′3′核酸外切酶活性滯后鏈的連接滯后鏈的連接：DNA連接酶DNA聚合酶Ⅰ2、真核生物的端粒和端粒酶端粒：是真核生物染色體線性DNA分子末端的結構

富含GC的重復序列人：(TTAGGG)n端粒酶：RNA-蛋白質復合物，既有模板，又有逆轉錄酶以自身的RNA為模板延長DNA單鏈，然后反折為雙鏈，爬行模式。端粒酶與生物體的衰老、腫瘤的發(fā)生有關。真核DNA的復制過程特征真核生物染色體有核小體結構；真核生物基因組龐大；真核細胞染色體比較復雜，可能有多個復制起點，同時DNA上往往有多個復制子；真核生物有DNA聚合酶α和δ，其中α與滯后鏈的合成有關，δ與領頭鏈的合成有關；真核生物DNA的復制子在每個細胞周期僅起始復制一次。第四節(jié)DNA的損傷修復突變-----DNA分子上堿基的改變自發(fā)突變、人工誘變一、突變的意義突變是進化、分化的分子基礎只有基因型改變的突變致死性的突變突變是某些疾病的發(fā)病基礎二、引發(fā)突變的因素誘變因素

突變類型物理因素

紫外線照射形成胸腺嘧啶二聚體

離子輻射打斷DNA分子上的共價鍵化學因素5-溴尿嘧啶5-溴尿嘧啶（5-BU）取代A，并異構成G，結果A-T配對變?yōu)镚-T配對，最后變?yōu)镚-C配對

羥胺轉換T為C，結果A-T配對變?yōu)镃-G配對

亞硝酸鹽使C脫氨成U，原G-C配對變?yōu)镚-U配對，最后變?yōu)锳-T配對

氮芥類

使G的N-7烷化后除去，成為無鳥嘌呤的鏈生物因素

腫瘤病毒插入宿主細胞基因組中，引起細胞癌變?nèi)?、突變分子改變的類型錯配（點突變）

一個堿基改變?nèi)笔А⒉迦牒涂蛞仆蛔?/p>

片段插入或缺失重排

較大片段重組或重排DNA損傷的化學及物理因素幾種化學誘變劑結構圖四、損傷的修復損傷--復制過程中發(fā)生的DNA突變光修復切除修復重組修復SOS修復1、光修復紫外光照射可使相鄰的兩個T形成二聚體（T^T）光修復酶可使二聚體解聚為單體狀態(tài)，DNA完全恢復正常。光修復酶的激活需300-600nm波長的光。（T^T）2、切除修復參與的酶有核酸內(nèi)切酶，polI，DNA連接酶核酸內(nèi)切酶識別損傷部位→切開核酸單鏈→外切酶切除損傷部位→聚合酶修復→連接酶連接3、重組修復重組蛋白RecA，polⅠ，連接酶參與。聚合酶在損傷部位跳過去，在下一個岡崎片段的起始位置或前導鏈的相應位置上重新合成引物和DNA鏈，新鏈在損傷相對應處留下缺口。然后完整的母鏈上相對應于損傷部位的正確核苷酸序列片段移到有缺口的新鏈上，而母鏈上的空缺則通過聚合來補上。損傷鏈的損傷并未除去，但在后代中已被稀釋。4、錯配修復甲基化指導的錯配修復：修復在復制過程中錯配且沒有被校正的單個