(高清版)GB∕T 37870-2019 個體鑒定的高通量測序方法

ICS07.080GB/T37870—2019個體鑒定的高通量測序方法國家市場監(jiān)督管理總局中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會GB/T37870—2019本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草?！騁B/T37870—2019合核酸生物技術(shù)和高通量測序技術(shù)以檢測人體樣本的STR位點和SNP位點進行個體鑒定，對于維護社會穩(wěn)定有極其重要的意義。1GB/T37870—2019個體鑒定的高通量測序方法下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T29859—2013生物信息學(xué)術(shù)語GB/T30989—2014高通量基因測序技術(shù)規(guī)程GB/T29859—2013及GB/T30989—2014界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。為了便于使用，以下重復(fù)列出了GB/T29859—2013及GB/T30989—2014中的某些術(shù)語和定義。3.1測定氨基酸或核苷酸序列的過程。[GB/T29859—2013,定義2.4.13]3.2區(qū)別于傳統(tǒng)Sanger(雙脫氧法)測序，能夠一次并行對大量核酸分子進行平行序列測定的技術(shù)，通常一次測序反應(yīng)能產(chǎn)出不低于100Mb的測序數(shù)據(jù)。[GB/T30989—2014,定義3.19]下列縮略語適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)dNTP:脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleotidetriphosphate)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)SNP:單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphisms)STR:短串聯(lián)重復(fù)序列(ShortTandemRepeat)采集樣本后，結(jié)合核酸生物技術(shù)和高通量測序技術(shù)，檢測特異的分子遺傳標(biāo)記位點(STR位點和2GB/T37870—2019SNP位點),通過比較測試樣本與待檢者的分型結(jié)果是否均相同，鑒定測試樣本是否來源于待檢者。若測試樣本與待檢者有兩個及以上位點分型結(jié)果不同，在排除等位基因丟失等前提下，判斷為不特異的分子遺傳標(biāo)記位點進行檢測。增加檢測更多位點后，測試樣本與待檢者有兩個及以上位點分型匹配概率是人群中的隨機個體純粹由于機會與待檢者分型結(jié)果一致的概率，以此估計一個理論上的隨機個體碰巧匹配的可能性。似然率在數(shù)值上等于樣本來源于待檢者的概率與樣本來源于隨機個體的概率比值。6試驗條件和其他區(qū)域。實驗室人員應(yīng)具備良好的分子生物學(xué)專業(yè)技術(shù)操作能力。7.1PCR儀：溫度設(shè)置范圍為0℃~99℃,最大循環(huán)數(shù)為99。7.2高通量測序儀：測序通量≥100Mb,堿基識別質(zhì)量>20,堿基識別正確率≥99.9%。7.3離心機：實驗室通用高速離心機，最高轉(zhuǎn)速不低于16000r/min。7.4渦旋振蕩儀。7.5冰箱：溫度調(diào)節(jié)范圍為—20℃~4℃。8試劑8.2DNA提取試劑8.2.1Chelex-100試劑基因組DNA提取試劑盒。8.3PCR擴增試劑個體鑒定的引物混合液及PCR反應(yīng)的預(yù)混體系。PCR反應(yīng)的預(yù)混體系包括DNA聚合酶、PCR3GB/T37870—2019選取高多態(tài)性的STR位點和雜合度大于0.3的SNP位點，作為候選的分子遺傳標(biāo)記位點，并進行引物設(shè)計與合成(參見附錄A)。9.2DNA提取采用Chelex法或試劑盒法進行DNA提取。提取后的DNA濃度應(yīng)大于1ng/μL,應(yīng)置于-20℃或-20℃以下條件保存。a)血液和血痕：取少量血液或血痕加入適量純水，劇烈振蕩，室溫下放置30min以上。用于PCR擴增或置4℃冰箱內(nèi)低溫保存?zhèn)溆?。c)唾液斑：剪取約0.5cm2的唾液斑加入適量純水，劇烈振蕩，在室溫下放置15min。4GB/T37870—20199.2.3試劑盒法當(dāng)樣本為血液和唾液時，可采用試劑盒法。按照DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取。9.3文庫制備與DNA測序?qū)⒑蜻x分子遺傳標(biāo)記位點的引物混合液和PCR反應(yīng)的預(yù)混體系加至適量的DNA中進行PCR擴增。擴增完成后選擇合適的磁珠對PCR產(chǎn)物進行純化。純化后的PCR產(chǎn)物濃度應(yīng)符合高通量測序儀的文庫構(gòu)建要求。取純化后的PCR產(chǎn)物按照高通量測序儀說明書進行文庫構(gòu)建和文庫質(zhì)檢。當(dāng)文庫的片段長度分布符合預(yù)期，且文庫濃度符合高通量測序儀測序要求時，文庫質(zhì)檢合格。最后將多個質(zhì)檢合格的文庫按比例混合后，選擇合適的測序讀長進行高通量測序。9.4位點分型對高通量測序數(shù)據(jù)進行過濾，去除帶有高通量測序接頭和測序質(zhì)量值較低的測序序列。根據(jù)測序數(shù)據(jù)的文件格式和測序讀長選擇比對軟件并設(shè)定比對參數(shù)，將過濾后的測序數(shù)據(jù)比對到人類參考基因組上。取出比對到人類參考基因組唯一位置的測序序列，并保留其比對信息。選擇適用于高通量測序數(shù)據(jù)的STR分型軟件和SNP分型軟件，對候選的分子遺傳標(biāo)記位點進行分型。STR的分型結(jié)果包含樣本編號、STR位點及基因型，基因型以重復(fù)單元的次數(shù)表示，未得到分型或無法明確判定分型的記為NA(缺失值)。SNP的分型結(jié)果包含樣本編號、SNP位點和基因型，基因型以堿基A、C、G、T表示，未得到分型或無法明確判定分型的記為NA。10結(jié)果分析按式(1)計算匹配概率，從理論上估計測試樣本來自群體中的隨機個體卻因碰巧而與待檢者發(fā)生匹配的可能性。以頻率估計概率，群體中發(fā)現(xiàn)這種基因型的頻率即是隨機個體碰巧匹配概率。隨機匹配概率越小，測試樣本來自群體中隨機個體的可能性就越小，說明測試樣本與待檢者匹配可能不是隨機發(fā)生的，測試樣本更可能來自待檢者。匹配概率的計算：Pr(E|H?)=1×P(X)……(1)Pr(E|Ha)——在Ha條件下獲得這種基因型的概率；E——獲得這種基因型的期望值；H——測試樣本來自群體中的隨機個體；P(X)——群體中這種基因型的頻率。按式(2)計算似然率，判斷在某種基因型組合下，測試樣本更可能來自待檢者，還是更可能來自人群中的隨機個體。當(dāng)似然率在數(shù)值上超過1時，從統(tǒng)計學(xué)上認(rèn)為測試樣本更可能來自待檢者。反之，如果小于1,測試樣本更可能來自群體種的隨機個體。當(dāng)似然率在數(shù)值上超過全球人口總數(shù)時，認(rèn)為測試樣本來自待檢者。因為從概率上估計幾乎不可能在世界上找到具有同樣基因型組合的另一個人。似然率的計算：LR=Pr(E|Hp)/Pr(E|Ha)……(2)LR——似然率；Pr(E|Hp)——在Hp條件下獲得某種基因型組合的概率；5GB/T37870—2019E——獲得某種基因型組合的期望值；Hp——測試樣本來自待檢者；Ha