清洗消毒器 第5部分：清潔效果的性能要求和測(cè)試方法 征求意見(jiàn)稿

1GB/T35267.5—XXXX清洗消毒器第5部分清潔效果的性能要求和測(cè)試方法本文件規(guī)定了對(duì)可重復(fù)使用醫(yī)療器械進(jìn)行清洗的清洗消毒器及其附件的清潔效果進(jìn)行測(cè)試的程序和試驗(yàn)方法。注2：本文件不適用于可重復(fù)使用醫(yī)療器械2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。ISO/DIS15883-1:-1，清洗消毒器第1部分：一般要求、術(shù)語(yǔ)和定義及試驗(yàn)ISO10993-1醫(yī)療器械的生物評(píng)價(jià)第1部分：風(fēng)險(xiǎn)管理過(guò)程中的評(píng)價(jià)和試驗(yàn)（Biologicalevaluationofmedicaldevices--Part1:Evaluationandtestingwithinariskmanagementprocess）ISO10993-5醫(yī)療器械的生物評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)（BiologicalEvaluationOfMedicalDevices.Part5:TestsForInVitroCytotoxicity）3術(shù)語(yǔ)和定義ISO15883-1界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。ISO和IEC在以下地址維護(hù)用于標(biāo)準(zhǔn)化的術(shù)語(yǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)：——ISO在線瀏覽平臺(tái)：/obp——IEC電百科：/3.13.2行動(dòng)值需要立即干預(yù)的監(jiān)測(cè)值。[來(lái)源：ISO11139:2018,3.5]3.33.4預(yù)警值特定條件下早期預(yù)警的監(jiān)測(cè)值。[來(lái)源：ISO11139:2018,3.11－修訂版－增加注1]3.53.6分析物用于化學(xué)分析的化學(xué)物質(zhì)。[來(lái)源：ISO11139:2018,3.1.2]3.73.8清潔2GB/T35267.5—XXXX無(wú)可見(jiàn)污染物并且分析物在特定水平以下。[來(lái)源：ISO11139:2018,3.45]3.93.10臨床應(yīng)用醫(yī)療產(chǎn)品在患者醫(yī)療過(guò)程的使用。[來(lái)源：ISO11139:2018,3.49，修訂版－增加注1]3.113.12負(fù)載在一個(gè)操作周期內(nèi)要一起處理的產(chǎn)品、設(shè)備或材料。[來(lái)源：ISO11139:2018,3,155]3.133.14產(chǎn)品過(guò)程的結(jié)果。[來(lái)源：ISO11139:2018,3.217]3.153.16漂洗通過(guò)水置換和稀釋去除過(guò)程殘留物。[來(lái)源：ISO11139:2018,3.237]3.173.18模擬使用按預(yù)期用途模擬醫(yī)療器械的使用。3.193.20污染物器械或其表面在使用或模擬使用后的自然或人為污染物。[來(lái)源：ISO11139:2018,3.257]3.213.22替代產(chǎn)品在過(guò)程模擬中設(shè)計(jì)用來(lái)代表產(chǎn)品，并且與實(shí)際產(chǎn)品具有可比性的產(chǎn)品。[來(lái)源：ISO11139:2018,3.291]3.233.24試驗(yàn)污染物設(shè)計(jì)用于替代在使用后的設(shè)備上發(fā)現(xiàn)的污染物或殘留的污染物的配方。[來(lái)源：ISO11139:2018,3.300]3.253.26清洗通過(guò)水流的方式去除表面的污染物。[來(lái)源：ISO11139:2018,3,121]4性能要求4.1概述3GB/T35267.5—XXXX4.1.1除4.1.3-4.1.5規(guī)定的要求外，還應(yīng)符合YY/T0734后續(xù)部分對(duì)清洗消毒器清潔性能的要求。4.1.2除4.1.4和4.1.5規(guī)定的試驗(yàn)外，還應(yīng)符合YY/T0734后續(xù)部分對(duì)清洗消毒器清潔試驗(yàn)的要求。4.1.3對(duì)確認(rèn)清洗消毒器符合本標(biāo)準(zhǔn)要求的清潔過(guò)程條件，如階段、溫度、壓力、流量、化學(xué)劑、水質(zhì)和水量，應(yīng)按照ISO/DIS15883-1:-，4.1.12和8.2b）進(jìn)行定義。注1：水質(zhì)參照ISO/DIS15883-1:-，5.23和GB/4.1.4應(yīng)在規(guī)定的清潔階段進(jìn)行清潔效果試驗(yàn)，包括在適當(dāng)情況下進(jìn)行沖洗、漂洗等（見(jiàn)5.2）。清潔階段應(yīng)按照ISO/DIS15883-1:2020,4.1規(guī)定，應(yīng)證實(shí)并記錄整個(gè)清潔階段不會(huì)干擾分析物的檢測(cè)。在清潔效果測(cè)試中，清洗消毒器應(yīng)在沒(méi)有任何消毒或干燥階段的情況下操作，且不應(yīng)影響測(cè)試過(guò)程的有效性和安全性。4.1.5清潔效果試驗(yàn)應(yīng)在清洗消毒器及其特定負(fù)載對(duì)應(yīng)的附件中進(jìn)行，分為兩個(gè)階段：a)在模擬使用條件下，用確定的試驗(yàn)污染物，包括分析物以及典型性負(fù)載（見(jiàn)4.4.1）進(jìn)行的型式試驗(yàn)；b)在臨床使用的最具挑戰(zhàn)污染負(fù)載的條件下進(jìn)行性能鑒定試驗(yàn)（見(jiàn)4.4.1或若合適（5.4.2使用替代產(chǎn)品進(jìn)行性能鑒定試驗(yàn)。4.2試驗(yàn)污染物注意事項(xiàng)4.2.1選擇試驗(yàn)污染物和涂染方法的理由應(yīng)得到證明并形成文件。試驗(yàn)污染物配方的選擇或開發(fā)可以基于文獻(xiàn)和臨床實(shí)踐（見(jiàn)附錄A及其參考文獻(xiàn)）中醫(yī)療器械/產(chǎn)品的使用的相關(guān)性論證。4.2.2蛋白質(zhì)試驗(yàn)的污染物應(yīng)符合B.2規(guī)定的性能準(zhǔn)則。4.2.3試驗(yàn)污染物的選擇，其使用方法和處理（如干燥）應(yīng)模擬負(fù)載最具挑戰(zhàn)的臨床使用條件。a)試驗(yàn)污染物成分應(yīng)包括在產(chǎn)品預(yù)期使用過(guò)程中，可能遇到一定量的代表性污染物的分析物，數(shù)量符合4.2.1規(guī)定，并且若適用，還應(yīng)包括產(chǎn)品臨床使用中預(yù)期被清潔的任何相關(guān)材料（s）（如造影劑、潤(rùn)滑油等）；b)試驗(yàn)污染物的使用方法應(yīng)模擬產(chǎn)品的使用條件，例如，對(duì)清潔造成更大挑戰(zhàn)的燒灼或加熱，和/或可促進(jìn)材料滲透到產(chǎn)品的各個(gè)部分的壓力梯度。產(chǎn)品中最難清潔的部件應(yīng)被污染（見(jiàn)4.3）；c)將試驗(yàn)污染物涂在產(chǎn)品或樣品上后，應(yīng)考慮產(chǎn)品從使用地點(diǎn)到處理地點(diǎn)的運(yùn)輸和停留時(shí)間條件（如溫度、時(shí)間、濕度），以及任何預(yù)處理（見(jiàn)）；d)在驗(yàn)證方法中，應(yīng)對(duì)污染物的組成進(jìn)行表征，并識(shí)別和考慮最具挑戰(zhàn)的污染物元素（如脂類、黏合劑、不溶性蛋白質(zhì)等），以確保驗(yàn)證試驗(yàn)可證明對(duì)污染物的有效去除。4.2.4試驗(yàn)污染物的提取、回收率方法和分析物檢測(cè)的方法應(yīng)得到驗(yàn)證和規(guī)定?；厥盏尿?yàn)證應(yīng)證明有能力將分析物降低到行動(dòng)值以下。除非另有說(shuō)明（見(jiàn)），回收率應(yīng)大于70%。4.3負(fù)載注意事項(xiàng)4.3.1負(fù)載類型，包括典型及最具挑戰(zhàn)臨床使用條件的各類代表性的產(chǎn)品，應(yīng)加以規(guī)定并證明恰當(dāng)。這些負(fù)載應(yīng)被用于型式試驗(yàn)和性能鑒定試驗(yàn)的清潔效果和過(guò)程殘留物測(cè)試也見(jiàn)ISO/DIS15883-1:-，8.1b）和GB/T35267.4。負(fù)載應(yīng)適合所測(cè)試的清洗消毒器類型。注1：在型式試驗(yàn)和性能鑒定試驗(yàn)中，若適用，當(dāng)證明替代品可以作為前述產(chǎn)品的代表去用于某些試驗(yàn)時(shí)，負(fù)載就4GB/T35267.5—XXXX4.3.2應(yīng)考慮產(chǎn)品類型和患者接觸區(qū)域的任何適用物理特征，包括但不限于：——鉸鏈和連接處；——粗糙不規(guī)則表面；——材料組成，包括孔隙；——接頭和盲端；——內(nèi)部可移動(dòng)部分（例如，線纜）。這些設(shè)計(jì)特點(diǎn)具有更大的污染物聚集和滯留風(fēng)險(xiǎn)，在整個(gè)產(chǎn)品的清潔效果和清潔終點(diǎn)的評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中應(yīng)特別加以考慮。注1：其他的醫(yī)療器械設(shè)計(jì)及清潔的細(xì)節(jié)見(jiàn)4.3.3任何在其說(shuō)明書中規(guī)定的必要的預(yù)處理，例如，人工預(yù)清潔或拆卸，應(yīng)在試驗(yàn)程序中體現(xiàn)。4.4清結(jié)效果試驗(yàn)方法4.4.1概述清潔效果應(yīng)通過(guò)目視檢查（見(jiàn)4.4.2）和蛋白質(zhì)定量檢測(cè)（見(jiàn)，注釋和附件B）來(lái)確定。對(duì)于侵入性醫(yī)療器械，在型式試驗(yàn)中，至少應(yīng)使用另外一種有效的定量分析測(cè)試方法來(lái)測(cè)量除蛋白質(zhì)外的其他分析物。非侵入性醫(yī)療器械只需要目視檢查。注1：一些非侵入性醫(yī)療器械可能代表較高的風(fēng)險(xiǎn)水平，例如嬰兒配方奶粉4.4.2目視檢查在清潔階段結(jié)束后，目視檢查應(yīng)證明所有可觀察到的負(fù)載表面都沒(méi)有可見(jiàn)的污染物。本要求不適用于由于產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)而無(wú)法對(duì)產(chǎn)品表面進(jìn)行目視檢查的情況。充分的目視檢查包括：——明確地檢查說(shuō)明；——充足的照明；——檢查輔助設(shè)備，如適用（如發(fā)光放大鏡——觀察距離。更多目視檢查的信息參見(jiàn)EN13018和ASTME3106。4.4.3分析方法概述分析物的接受標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)報(bào)警限值和行動(dòng)值規(guī)定的。蛋白質(zhì)和其他分析物的報(bào)警限值和行動(dòng)值已在和中規(guī)定。它們的行動(dòng)值是測(cè)試期間可接受的清潔效果的最大標(biāo)準(zhǔn)，但目標(biāo)值是作為報(bào)警限值給出的。當(dāng)報(bào)警限值和行動(dòng)值都規(guī)定時(shí)，如果檢測(cè)到的分析行動(dòng)值在兩個(gè)水平之間，則應(yīng)進(jìn)行調(diào)查，但應(yīng)認(rèn)為可以通過(guò)清潔要求。5GB/T35267.5—XXXX為了符合ISO/DIS15883-1:2020第4.2和6.10條的要求，應(yīng)使用行動(dòng)值。注1：本文檔中分析物值以單位面積（cm）表示。一些區(qū)域和國(guó)家指南規(guī)定了每個(gè)醫(yī)療器械或每個(gè)醫(yī)療器械側(cè)面的最大分析行動(dòng)值。不可能直接將每平方厘米表示的數(shù)值與每個(gè)醫(yī)療器械或每個(gè)醫(yī)療器械側(cè)面表示的數(shù)值進(jìn)行比較，除非已知醫(yī)療器械或醫(yī)療器械側(cè)面的表面積蛋白質(zhì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)為：——報(bào)警限值≥3μg/cm2；——行動(dòng)值≥6.4μg/cm2。對(duì)于每個(gè)樣本，清潔后的產(chǎn)品上蛋白質(zhì)最大的可接受水平應(yīng)比行動(dòng)值低。（見(jiàn)參考注1：蛋白質(zhì)檢測(cè)方法可包括附錄C中規(guī)定的方法其他分析物的實(shí)驗(yàn)方法若使用其他分析物，清潔后的產(chǎn)品上，這些分析物的可接受水平，包括：a)總有機(jī)碳（TOC）1)報(bào)警限值≥6μg/cm2（見(jiàn)參考【85】）2)行動(dòng)值≥12μg/cm2（見(jiàn)參考【67】）注1：TOC是指有機(jī)物中含碳總量，以非可b)碳水化合物1)報(bào)警限值≥0.9μg/cm22)行動(dòng)值≥1.8μg/cm2（見(jiàn)參考【34】，【40】和【53】）注2：Dubois等人[53]的檢測(cè)單糖的方法有所不同，因此碳水化合物因組成不同，測(cè)試水平也是有所不同。報(bào)警限c)血紅蛋白1)報(bào)警限值≥1.0μg/cm2（見(jiàn)參考【73】）2)行動(dòng)值≥2.2μg/cm2（見(jiàn)參考【34】、【35】、【42】和【51】）注3：血紅蛋白檢測(cè)方法可包括附件D中規(guī)定的方法d)三磷酸腺苷（ATP）1)報(bào)警限值≥10fmol，ATP/cm2（見(jiàn)參考【37】和【89】）2)行動(dòng)值≥22fmol，ATP/cm2（見(jiàn)參考【36】、【37】和【43】）注4：相對(duì)光單位（RLU）到飛摩爾的轉(zhuǎn)換可以從特定的ATP監(jiān)1)報(bào)警限值≥2.2EU/器械（參見(jiàn)【12】和【33】）2)行動(dòng)值≥20EU/器械（參見(jiàn)【12】【32】和【33】）注6：對(duì)于直接或間接接觸心血管系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)的植入物和產(chǎn)品，推薦內(nèi)毒4.4.4過(guò)程殘留清洗階段，包括任何清洗后的漂洗，不得在負(fù)載上留下任何可能在后續(xù)使用中有害或損害后續(xù)過(guò)程階段的過(guò)程殘留物（見(jiàn)5.5）。6GB/T35267.5—XXXX5試驗(yàn)方法5.1清潔試驗(yàn)方法驗(yàn)證5.1.1概述型式試驗(yàn)（見(jiàn)5.3）和性能鑒定試驗(yàn)（見(jiàn)5.4）所采用的清潔試驗(yàn)方法應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。注1：清潔試驗(yàn)方法包括試驗(yàn)污染物、污染方法、回5.1.2負(fù)載污染方法負(fù)載污染方法，包括其應(yīng)用和任何處理，應(yīng)模擬清洗消毒器清潔階段的等效挑戰(zhàn)，就像最具挑戰(zhàn)的臨床污染負(fù)載所呈現(xiàn)的一樣，包括指定的負(fù)載載體（見(jiàn)4.2.3和5.2.1）。負(fù)載污染方法應(yīng)規(guī)定所有條件，包括對(duì)污染產(chǎn)品進(jìn)行一定時(shí)間、溫度和濕度（即停留時(shí)間）的干燥，這將代表在清洗消毒器中待處理的產(chǎn)品的使用條件。注1：條件制定示例參見(jiàn)K?hnlein等人25.1.3檢測(cè)方法對(duì)于用于清潔驗(yàn)證研究的每種分析物和每種方法，應(yīng)確定直接或提取的檢測(cè)限值。應(yīng)確定試驗(yàn)污染物的回收率。應(yīng)計(jì)算出相應(yīng)的校正因子并應(yīng)用于結(jié)果（見(jiàn)4.2.4）。注1：ISO11737-1[2]給出了確定生物負(fù)載量回收率的方法和應(yīng)用生物負(fù)載量校正因子的例子。這些原則和一般應(yīng)進(jìn)行陽(yáng)性和陰性對(duì)照，以識(shí)別過(guò)程條件對(duì)檢測(cè)方法的干擾（見(jiàn)5.2.2）。5.1.4分析物測(cè)定方法應(yīng)對(duì)用于清潔驗(yàn)證研究的每種分析物的選擇方法進(jìn)行驗(yàn)證。5.2清洗消毒器要求5.2.1清潔試驗(yàn)應(yīng)在規(guī)定的清洗消毒器負(fù)載上進(jìn)行。最具挑戰(zhàn)的負(fù)載應(yīng)包括代表性的產(chǎn)品和指定的負(fù)載架。除非另有說(shuō)明，載有代表性產(chǎn)品的每種負(fù)載架都應(yīng)單獨(dú)進(jìn)行測(cè)試。5.2.2應(yīng)規(guī)定清洗消毒器清洗階段的參數(shù)和清洗過(guò)程中的化學(xué)劑。型式試驗(yàn)應(yīng)在規(guī)定的最具挑戰(zhàn)參數(shù)（如溫度、時(shí)間、過(guò)程化學(xué)劑濃度、供給、壓力和流速）下進(jìn)行。5.2.3清潔驗(yàn)證應(yīng)在沒(méi)有任何消毒或干燥階段的情況下進(jìn)行測(cè)試（見(jiàn)ISO/DIS15883-1:-，6.10）。5.3清潔模式試驗(yàn)基本原則除本文件要求外，ISO15883其他適用部分的相關(guān)清潔試驗(yàn)要求也應(yīng)適用。5.3.2試劑/材料7GB/T35267.5—XXXX應(yīng)使用凝血或符合4.2標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)污染物。5.3.3程序試驗(yàn)負(fù)載、清洗消毒器腔壁和負(fù)載架應(yīng)使用試驗(yàn)污染物進(jìn)行污染（見(jiàn)4.2.1和4.3）。污染表面應(yīng)按中所述進(jìn)行處理。清潔試驗(yàn)階段應(yīng)在清洗消毒器定義的最具挑戰(zhàn)處理?xiàng)l件下進(jìn)行，重復(fù)三次（見(jiàn)5.2.2）。5.3.4可接受準(zhǔn)則清潔效果應(yīng)符合4.4.2規(guī)定的無(wú)可見(jiàn)污染物，并符合4.4.3規(guī)定的試驗(yàn)負(fù)載的行動(dòng)值。若適用，清潔效果應(yīng)符合4.4.3規(guī)定的試驗(yàn)負(fù)載的報(bào)警限值。對(duì)于腔壁和負(fù)載架來(lái)說(shuō)，目視檢查可滿足要求。5.4清潔性能鑒定試驗(yàn)5.4.1基本原則測(cè)試應(yīng)符合ISO/DIS15883-1:-，6.10.3和ISO15883的適用部分。5.4.2試劑/材料清洗消毒器應(yīng)使用經(jīng)臨床污染的實(shí)際負(fù)載進(jìn)行測(cè)試。這些負(fù)載應(yīng)該是清洗消毒器要處理的具有代表性的負(fù)載，包括已知的難以清潔的產(chǎn)品。對(duì)于特定的產(chǎn)品，可以使用模擬臨床使用條件的替代產(chǎn)品來(lái)進(jìn)行清潔效果驗(yàn)證。替代產(chǎn)品和試驗(yàn)污染物應(yīng)判斷（見(jiàn)5.1和4.2）是否適用于臨床使用條件。注1：替代產(chǎn)品可以用來(lái)模擬在不破壞情況下難以取樣或取樣方法提取效5.4.3程序污染物表面在清潔之前應(yīng)保持在最具挑戰(zhàn)的代表性停留條件（如時(shí)間、溫度和濕度）下（見(jiàn)）。清潔試驗(yàn)應(yīng)在可類比負(fù)載上進(jìn)行，重復(fù)三次（見(jiàn)5.2）。5.4.4可接受準(zhǔn)則清潔效果應(yīng)符合4.4.2規(guī)定的無(wú)可見(jiàn)污染物，并符合4.4.3規(guī)定的試驗(yàn)負(fù)載的行動(dòng)值。若適用，清潔效果應(yīng)符合4.4.3試驗(yàn)負(fù)載的報(bào)警限值。對(duì)于腔壁和負(fù)載架，目測(cè)檢查即可（見(jiàn)4.4.2）。5.5過(guò)程殘留5.5.1概述作為型式測(cè)試的一部分，在風(fēng)險(xiǎn)分析和細(xì)胞毒性測(cè)試要求中應(yīng)規(guī)定可接受的過(guò)程殘留量。性能鑒定試驗(yàn)要求對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行過(guò)程殘留的定期取樣（見(jiàn)ISO/DIS15883-1:—，表A.1）。如果過(guò)程或過(guò)程化學(xué)劑發(fā)生變化，應(yīng)重復(fù)進(jìn)行型式試驗(yàn)和性能鑒定試驗(yàn)。所有準(zhǔn)備在清洗消毒器中使用的過(guò)程化學(xué)劑都應(yīng)符合這一要求。8GB/T35267.5—XXXX5.5.2風(fēng)險(xiǎn)分析風(fēng)險(xiǎn)分析應(yīng)形成文件，證明過(guò)程殘留風(fēng)險(xiǎn)已降低到有害水平以下。風(fēng)險(xiǎn)分析應(yīng)考慮ISO10993-1的要求。5.5.3細(xì)胞毒性包括清洗消毒器及其負(fù)載在內(nèi)的醫(yī)療器械應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)試，以證明其不存在潛在的有害殘留物，除非根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估另有證明（見(jiàn)ISO/DIS15883-1:-，4.4和4.6）。任何此類風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估都應(yīng)包括驗(yàn)證過(guò)程中使用的過(guò)程化學(xué)劑的細(xì)胞毒性。參見(jiàn)[45]和[47]。根據(jù)ISO10993-1定義的風(fēng)險(xiǎn)分析，可能需要額外的生物相容性測(cè)試。5.5.4取樣方法應(yīng)規(guī)定從負(fù)載中提取過(guò)程殘留物的取樣方法和檢測(cè)樣品中過(guò)程殘留物的分析方法。這些方法應(yīng)能夠確定過(guò)程化學(xué)劑低于規(guī)定的潛在有害濃度（即可接受最大濃度見(jiàn)ISO/DIS15883-1:-，6.10.4）。5.5.5可接受準(zhǔn)則應(yīng)基于風(fēng)險(xiǎn)分析或細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果規(guī)定行動(dòng)值和報(bào)警限值。9GB/T35267.5—XXXX附錄B（資料性）附錄C試驗(yàn)污染物示例C.1概述表A.1提供了可用于測(cè)試清潔效果的試驗(yàn)污染物的簡(jiǎn)化示例，以滿足4.2的要求。沒(méi)有單一的試驗(yàn)污染物可被確定為用于所有臨床實(shí)踐的代表。表A.1試驗(yàn)污染物制備方法的示例——0.1ML肝素（10IU）/100mL羊血。4℃~8℃GB/T35267.5—XXXX將組分A和B溶解在相應(yīng)的溶劑A和B中，室溫（20~物——牛白蛋白：0.5g——（可選）牛膽汁：20g——碳酸氫鈉：2gGB/T35267.5—XXXX每100mL羊血注入0.1mL肝素。4℃~8℃保存?zhèn)銰B/T35267.5—XXXX注1：使用國(guó)家法規(guī)允許的含有特定動(dòng)物來(lái)源注2：表A.1中提供的試驗(yàn)污染物及其制備方法的詳細(xì)資料可以在-2209,。ATCC編號(hào)是該參考培養(yǎng)標(biāo)本提供的GB/T35267.5—XXXX附錄E（規(guī)范性）附錄F基于蛋白質(zhì)污染物的性能評(píng)價(jià)F.1原則F.1.1試驗(yàn)背景該測(cè)試方法基于本文件的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)試驗(yàn)方案獲得的測(cè)試結(jié)果。該測(cè)試方案主要研究了在規(guī)定的溫度和暴露時(shí)間條件下，規(guī)定測(cè)試污染物的溶解情況。在模擬不銹鋼平面的標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試件（STP）上涂上新鮮凝結(jié)的羊血作為測(cè)試污染物。將涂抹測(cè)試污染物的STP浸入化學(xué)成分確定的清洗劑配方中，以評(píng)估清潔效果。通過(guò)確定的提取蛋白質(zhì)的測(cè)定方法測(cè)定清潔度。F.1.2試驗(yàn)方案本附錄規(guī)定了使用已定義的試驗(yàn)方法評(píng)估蛋白質(zhì)污染物的試驗(yàn)方案。應(yīng)根據(jù)臨床相關(guān)性（見(jiàn)4.2）選擇用于符合附錄B的試驗(yàn)污染物，并且還應(yīng)滿足B.2中規(guī)定的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。所選擇的試驗(yàn)污染物應(yīng)含有最低量的蛋白質(zhì)，而與其他任何成分無(wú)關(guān)，以符合本附錄的評(píng)估和一致注1：測(cè)試污染物中初始蛋白質(zhì)不足不利于協(xié)議執(zhí)行的預(yù)期順序如下：a)溶液和試劑的制備；b)通過(guò)清洗，涂污染物，調(diào)節(jié)，切割和稱重來(lái)制備STPs；c)控制溶液的紫外可見(jiàn)光譜（UV-Vis）鄰苯二甲醛（OPA）法；d)牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備和校準(zhǔn)曲線的建立；e)用于陰性對(duì)照STPs的UV-VisOPA方法；f)用于陽(yáng)性對(duì)照STPs的UV-VisOPA方法；g)通過(guò)浸泡、萃取、洗脫和UV-VisOPA分析對(duì)處理過(guò)的STPs進(jìn)行測(cè)試；h)最后清潔所有已處理的STPs。F.2驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)按照本附錄的要求進(jìn)行測(cè)試時(shí)，所選的測(cè)試污染物（見(jiàn)4.2.2）應(yīng)符合表B.1規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。蛋白質(zhì)的剩余百分比使用公式（B.3）計(jì)算，見(jiàn)B.11.3。表B.1經(jīng)測(cè)試的STPs的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)試的STPs上殘留的污染物剩余蛋白質(zhì)應(yīng)為12%且≥2%GB/T35267.5—XXXX被測(cè)試的STPs上殘留的污染物F.3STP準(zhǔn)備F.3.1概述B.3.1.1和B.3.1.2中規(guī)定了STP的材料和尺寸以及試驗(yàn)所需的STPs數(shù)量。F.3.1.1所需STPs數(shù)量測(cè)試總共需要12個(gè)STPs。這包括：a)8個(gè)帶涂層的STPs-在純水中進(jìn)行兩個(gè)測(cè)試，兩個(gè)溫度和兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)測(cè)試條件重復(fù)兩次；b)2個(gè)帶涂層的STPs-陽(yáng)性對(duì)照測(cè)試；c)2個(gè)無(wú)涂層的STPs-陰性對(duì)照測(cè)試。F.3.1.2材料和尺寸STPs由厚度為0.127mm的退火316L不銹鋼箔制成。最終尺寸為50mm×50mm。F.3.2不銹鋼箔制備不銹鋼箔條應(yīng)切割成長(zhǎng)（220~250）mm×寬200mm，用5號(hào)邁耶棒（見(jiàn)表B.2）清潔并涂上試驗(yàn)污染物，然后干燥。然后將不銹鋼箔從箔的中心切成50mm×50mm的STPs（每邊留有25mm的余量/用于處理用于試驗(yàn)，然后進(jìn)行處理。STPs只能使用一次，并且測(cè)試系列所需的所有STPs應(yīng)同時(shí)準(zhǔn)備。F.3.2.1不銹鋼箔表面處理F.在用測(cè)試污染物涂覆之前，應(yīng)清洗長(zhǎng)（220~250）mm×寬200mm的不銹鋼箔，并確認(rèn)不含蛋白質(zhì)。F.為便于不銹鋼箔的背面識(shí)別，清洗前需要使用劃線器將不銹鋼箔背面劃線分割為50mmx50mm的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方格（STPs）并編號(hào)，如圖B.1所示。圖B.1不銹鋼箔裁至大約250mm×200mm，刻在一面劃線識(shí)別F.3.2.2不銹鋼箔的清洗過(guò)程GB/T35267.5—XXXX劃線的不銹鋼箔和所有直接相關(guān)的設(shè)備應(yīng)按以下方法清洗。表B.2所示為過(guò)程所需設(shè)備、表B.3所示為過(guò)程所需化學(xué)品。具有相似參數(shù)的設(shè)備和化學(xué)品可以代替表B.2和表B.3中所列的設(shè)備或藥品，但是所用的不銹鋼應(yīng)與表B.2中規(guī)定的相同。表B.2設(shè)備———Faithfull工具，StockNDartford,KentDA26QE,長(zhǎng)度（230~270）mm— Litlington,Royston,Hwww.rubbersuckers.co.http://suctioncupsu用于實(shí)驗(yàn)室間研究的設(shè)備可以來(lái)自所列供應(yīng)商；也可以使用其他供應(yīng)商。表B.3清洗不銹鋼箔和相關(guān)設(shè)備所需的化學(xué)品———用于實(shí)驗(yàn)室間研究的化學(xué)品來(lái)自所列供應(yīng)商；可以使用其他供應(yīng)商。F.3.2.3步驟按照如下步驟將不銹鋼箔與設(shè)備分開清洗：a)將需要清洗的不銹鋼箔或設(shè)備放入適當(dāng)大小的清潔塑料容器內(nèi)；b)在大燒杯中準(zhǔn)備足量的質(zhì)量比為5%的Decon90清洗液；c)將溶液加熱至45℃至50℃,加熱過(guò)程一直攪拌；d)將加熱的溶液加入塑料容器中，確保所有設(shè)備完全浸入；GB/T35267.5—XXXXe)靜置10min，偶爾搖晃容器；f)倒出清洗劑溶液；g)用純水沖洗設(shè)備兩次，同時(shí)保持搖擺運(yùn)動(dòng)，以確保所有的清洗劑都從設(shè)備上清除；h)用異丙醇沖洗設(shè)備，以便于干燥；i)小心地將清洗過(guò)的設(shè)備取出并放置在適當(dāng)?shù)臒o(wú)蛋白質(zhì)環(huán)境中。F.3.3STPs涂層F.3.3.1注意事項(xiàng)應(yīng)采取預(yù)防措施，以確保將規(guī)定量的測(cè)試污染物僅施加到不銹鋼箔未劃刻側(cè)的指定區(qū)域上，不能覆蓋劃定的一側(cè)，并確保測(cè)試污染物不會(huì)溢出箔的邊緣。注意有關(guān)涂層STPs的視頻指南可從以下鏈接獲得：https:www.youtube.com/watch？v=V6-1v0aM-P0https:www.youtube.com/watch？v=Y-iDF1pKJJAF.3.3.2步驟如下對(duì)不銹鋼箔進(jìn)行涂層：a)確保使用新鮮制作的測(cè)試污染物；b)將有劃痕的不銹鋼箔的面朝下放在無(wú)蛋白的防滑表面上；c)在不銹鋼箔的一面（無(wú)劃痕的一側(cè)）均勻地涂抹約5mL的測(cè)試污染物（見(jiàn)圖B.2），不要超出邊緣；d)用5號(hào)邁耶棒（K涂層機(jī)）壓力均勻平穩(wěn)地?cái)傞_測(cè)試污染物；e)在20℃至25℃（室溫）下，使涂層的不銹鋼箔干燥至少2至4個(gè)小時(shí)；f)用干凈的剪刀小心地將涂層的不銹鋼箔切成單獨(dú)的STPs（如B.所述，約50mmx50mm），沿劃線（反面）切割，同時(shí)避免污染涂層側(cè)；g)在受控條件下，將各個(gè)STPs置于20℃至25℃和40％至60％相對(duì)濕度（RH）的條件下并存儲(chǔ)24小時(shí)±2小時(shí)（請(qǐng)參閱B.3.5）；h)檢查STPs，并放棄所有未完全覆蓋的STPs；i)用精度是4位數(shù)實(shí)驗(yàn)分析天平上稱重所有STPs，并記錄重量[見(jiàn)表E.4（陽(yáng)性對(duì)照）和表E.5（浸沒(méi)STPs）]；注2：可以使用干凈的不含蛋白質(zhì)的塑料一次性培養(yǎng)皿或類似物來(lái)稱量和儲(chǔ)存STPs，確保測(cè)試污染物涂層面一直朝上，以防止STPs背面被蛋白質(zhì)污染，并且在使j)在受控條件下，24小時(shí)內(nèi)使用涂層并稱重的STPs，并確保不使用時(shí)將其保持在上述條件下；k)確保STPs在運(yùn)輸過(guò)程中和使用前保持覆蓋。圖B.2邁耶棒方向顯示的涂有涂層的一面朝上GB/T35267.5—XXXXF.3.4陰性對(duì)照STPsF.3.4.1步驟如下準(zhǔn)備陰性對(duì)照STPs：a)將一塊不銹鋼箔劃成兩個(gè)50x50mmSTPs，并標(biāo)識(shí)為N1和N2。切成單獨(dú)的STPs并清潔（請(qǐng)參閱B.3.2.3）；b)在實(shí)驗(yàn)室分析天平上稱量各個(gè)STPs的重量，并記錄重量（見(jiàn)表E.3）。注意可以使用干凈的無(wú)蛋白的塑料一次性培養(yǎng)皿或類似物稱重并存儲(chǔ)切好的STPs，以防止STPs的蛋F.3.5STPs保存F.3.5.1概述對(duì)STPs的進(jìn)行保存的條件：溫度在20℃至25℃之間，相對(duì)濕度（RH）在40％至60％之間進(jìn)行。保存的設(shè)備和試劑應(yīng)至少準(zhǔn)備2小時(shí)，然后再用測(cè)試污染物對(duì)不銹鋼箔進(jìn)行涂層。F.3.5.2步驟保存STPs的條件如下：a)使用適當(dāng)尺寸的干燥器或密閉室，在適當(dāng)尺寸的容器中邊攪拌邊向100mL的純水中添加足夠的硝酸鎂[Mg(NO3)2]，以得到飽和溶液，確保未溶解的硝酸鎂殘留在容器中；b)將飽和溶液轉(zhuǎn)移到更大的容器（例如大培養(yǎng)皿）中，并將其放在干燥器/腔室的底部；c)固定干燥器/腔室并關(guān)閉，確保其氣密；d)保持至少2小時(shí)的相對(duì)濕度穩(wěn)定；e)在受控條件下，將各個(gè)STPs置于20℃至25℃和40％至60％相對(duì)濕度（RH）的條件下并保存24h±2h。F.4浸漬試驗(yàn)裝置F.4.1概述進(jìn)行浸漬測(cè)試所需的設(shè)備和附件在下面列出，并在圖B.3中以圖形方式表示。F.4.2裝置a)有固定速度設(shè)置（50rpm）的磁力攪拌爐；b)長(zhǎng)度25mm，直徑6mm的磁力攪拌棒；c)純水；d)玻璃燒杯（400mL深蹲型，直徑80mm）；e)玻璃燒杯溫度測(cè)量系統(tǒng)[(0-100)℃±0.5℃]；f)鐵支架、蒸餾瓶夾及固定PVC吸帽的裝置，并將夾具和STPs固定在適當(dāng)位置，避免與涂覆區(qū)域直接接觸；g)秒表；h)長(zhǎng)鑷子；i)PVC吸帽。GB/T35267.5—XXXX1—溫度探頭或溫度計(jì)；2—蒸餾瓶夾（和長(zhǎng)鑷子一起固定3—鐵支架；4—長(zhǎng)鑷子；5—PVC吸帽；6—玻璃燒杯；7—STPs（標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試件8—純水（平衡）；9—磁子；10—磁力攪拌爐。圖B.3浸漬試驗(yàn)裝置F.5浸漬試驗(yàn)過(guò)程F.5.1概述浸漬測(cè)試過(guò)程在兩個(gè)溫度，25℃±2℃和75℃±2℃,兩個(gè)時(shí)間間隔30s和90s下進(jìn)行。F.5.2步驟進(jìn)行浸漬試驗(yàn)如下：a)將100mL純水放入400mL燒杯中。調(diào)整攪拌速度到50rpm；b)確保燒杯中的溫度處于所需的測(cè)試溫度，并在±2℃的公差范圍內(nèi)；c)將受污染的STPs一面朝下放置在適當(dāng)清潔、無(wú)蛋白質(zhì)的表面上，將40mm的PVC吸帽附著在未涂覆的一面上，并將長(zhǎng)鉗固定在PVC吸帽上（見(jiàn)圖B.4）；d)將STPs以水平方向懸浮在燒杯中的純水中（見(jiàn)圖B.3深度足夠完全浸沒(méi)（大約10mm到15mm），但也不要接觸磁力攪拌棒，并啟動(dòng)秒表。有必要在浸入STPs之前暫時(shí)關(guān)閉攪拌器，以防止在STPs被污染的一面表面形成氣泡；GB/T35267.5—XXXXe)在規(guī)定的浸泡時(shí)間后，停止攪拌，取下夾緊的STPs，輕輕剝離測(cè)試溶液；f)將STPs固定在PVC吸力帽上，用長(zhǎng)鉗固定，將STPs的一側(cè)放在無(wú)蛋白吸水性紙巾上30s（見(jiàn)）；g)置于含有洗脫液和b.6.2中配制的玻璃微珠的500mL玻璃燒杯上。使用無(wú)蛋白鑷子拉上吸帽邊緣的吸脫扣片，讓STPs落入洗脫液中（見(jiàn)圖B.6）；h)每次浸泡溫度和浸泡時(shí)間重復(fù)浸泡測(cè)試兩次。圖B.4將長(zhǎng)鉗和吸帽安裝到STPs上圖B.5STPs浸泡30s后放置圖B.6將STPs放置在洗脫溶液中，并拆卸吸帽GB/T35267.5—XXXXF.6STPs洗脫過(guò)程F.6.1概述將洗脫過(guò)程中殘留的蛋白質(zhì)提取到洗脫溶液中，然后用OPA試劑使用紫外-可見(jiàn)光譜法對(duì)其進(jìn)行分析。應(yīng)戴無(wú)蛋白質(zhì)非乳膠手套，以避免蛋白質(zhì)污染。F.6.2步驟洗脫STPs中殘留蛋白如下：a)將10mL洗脫溶液（1%SDS溶液見(jiàn)B.12.2）倒入500mL燒杯中；b)向燒杯中加入2.0g（200~400）μm的玻璃珠；c)將STPs放入洗脫溶液后（見(jiàn)B.5.2g），蓋上燒杯以減少蒸發(fā)；d)在20℃至25℃的軌道振動(dòng)篩上攪拌（20~30）min；注1：攪拌時(shí)間是為了讓所有殘留蛋白有足夠的時(shí)間從STPs中洗脫出來(lái)，其他測(cè)試污染物可e)停止攪動(dòng)，使用無(wú)蛋白鑷子去除STPs，確保玻璃珠保留在燒杯中，把STPs放在蛋白質(zhì)不吸收組織上，保留STPs，通過(guò)重量分析確定STPs的涂層重量（見(jiàn)B.10）；f)讓洗脫的溶液靜置，直到玻璃珠沉淀到燒杯底部。小心地將洗脫液倒入小瓶（如閃爍小瓶蓋上蓋子，確保玻璃珠保留在燒杯中。在瓶子上貼上STPs編號(hào)和測(cè)試條件，例如STPs#1,25℃,30秒，重復(fù)1；g)用UV-VisOPA方法分析洗脫溶液（見(jiàn)B.9）。F.7UV-Vis鄰苯二甲醛（OPA）法F.7.1概述用OPA法萃取后，直接用紫外－可見(jiàn)分光光度法定量測(cè)定洗脫液中的殘留蛋白質(zhì)含量。應(yīng)使用該方法獲得UV-Vis吸光度讀數(shù)。這一過(guò)程需要校準(zhǔn)曲線和UV-VIS標(biāo)準(zhǔn)/控制。F.7.2設(shè)備執(zhí)行UV-Vis分析需要以下設(shè)備和附件：a)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，波長(zhǎng)340nm；b)可校準(zhǔn)的移液槍；c)一次性吸液管；d)相同類型和品牌的比色皿；或用于300nm以上分析的高質(zhì)量一次性比色皿，由耐刮擦材料制成，消光系數(shù)變化最??；e)適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)室玻璃器具（例如燒杯、容量瓶等）。F.7.3校準(zhǔn)曲線對(duì)于復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的定量，測(cè)試污染物中的蛋白質(zhì)濃度應(yīng)參照牛血清白蛋白V（BSA）進(jìn)行評(píng)估。這使得可以通過(guò)使用BSA校準(zhǔn)曲線來(lái)定量STPs上的蛋白質(zhì)。注1：所獲得的量化值僅表示以牛血清白蛋白當(dāng)量F.7.4牛血清白蛋白原液制備GB/T35267.5—XXXXF.7.4.1概述牛血清白蛋白（BSA）校準(zhǔn)曲線用于測(cè)定STPs上的蛋白質(zhì)含量。表B.4列出了所需的材料，用于制備校準(zhǔn)曲線的稀釋樣品。表B.4BSA原液所需化學(xué)用品--F.7.4.2步驟按如下方式準(zhǔn)備BSA原液：a)稱出100mg±0.1mg固體牛血清白蛋白，記錄重量，加入100mL容量瓶中；b)在裝有固體牛血清白蛋白的容量瓶中加入1%SDS溶液，輕輕攪拌，標(biāo)定至100mL，確保完全溶解，原液濃度為1.0mg/mL(1000μg/mL)；注1：該原液用于進(jìn)行所有后續(xù)稀釋，以構(gòu)建BSA校準(zhǔn)曲線，并c)使用校準(zhǔn)移液槍從BSA原液中制備稀釋液，使用1%SDS溶液作為稀釋劑以便覆蓋2.5μg/mL至800μg/mL的初始濃度范圍（參見(jiàn)表E.2）；注2：濃度不應(yīng)超過(guò)800μl/mL(+20μl/mL)，d)不使用時(shí)，稀釋液應(yīng)保持在20℃至25℃（室溫），遠(yuǎn)離光線，F(xiàn).7.5OPA法的UV-Vis系統(tǒng)和試劑兼容性F.7.5.1概述在分析之前，有必要確定試劑和稀釋劑是否適合使用，以最大限度地減少錯(cuò)誤結(jié)果。應(yīng)使用四（4）種因素來(lái)確定設(shè)備（分光光度計(jì)和比色皿）是否合格，并使用兩（2）種試劑來(lái)確定測(cè)試期間獲得的吸光度是否可靠。這可確保：a)使用的稀釋劑是可接受的（即未降解）；b)測(cè)量的吸光度被歸一化以用于計(jì)算，并考慮了用于制備樣品的試劑和稀釋劑的吸光度。F.7.5.2系統(tǒng)適宜性控制F.應(yīng)在使用UV-VIS分光光度計(jì)進(jìn)行分析之前和之后執(zhí)行四（4）個(gè)系統(tǒng)適宜性控制。表B.5中列出了控制方法和典型吸收值。表B.5系統(tǒng)適宜性測(cè)試在儀器中沒(méi)有比色皿的情況下，從UV-Vis分光光度計(jì)（在如果獲得的值不在-0.001和+0.001之間，則只需在儀器上-在進(jìn)行樣品計(jì)算時(shí)，當(dāng)用于后續(xù)分析時(shí)，試管的任何吸光-典型吸收：-0.001至0.001（或自動(dòng)調(diào)零時(shí)為0.000）GB/T35267.5—XXXX-只用1%的SDS溶液裝滿試管，并從溶液中獲得三個(gè)讀數(shù)。-典型吸光度：0.03至0.05-僅將SDS/硼酸鹽溶液裝入試管，并從溶液中獲得三個(gè)讀-典型吸光度：0.03至0.05-只用OPA試劑裝滿試管，從溶液中獲得三個(gè)讀數(shù)。-典型吸收：0.09至0.11，應(yīng)為≤0.15F.對(duì)于每個(gè)對(duì)照組，在構(gòu)建BSA校準(zhǔn)曲線（見(jiàn)B.7.6）和平均值（見(jiàn)表E.1）之前，獲得三（3）個(gè)值。對(duì)于系統(tǒng)適用性和試劑控制（B.7.5.3），使用相同的比色皿被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)做法。但是，在不可行的情況下，應(yīng)采取措施避免比色皿內(nèi)不一致和比色皿之間的差異。F.在每次分光光度分析之前，應(yīng)將比色皿用1％SDS溶液沖洗兩次。F.7.5.3試劑對(duì)照F.在使用UV-Vis分光光度計(jì)進(jìn)行分析之前和之后，應(yīng)進(jìn)行兩次試劑的對(duì)照。表B.6列出了控制方法和典型吸收值。表B.6試劑控制試驗(yàn)/硼酸鹽溶液（1：1v/v比例）填充比色皿。使用一次性—用已校準(zhǔn)的自動(dòng)移液器向試管中加入等體積的1％SDS溶F.對(duì)于兩個(gè)對(duì)照，在構(gòu)建BSA校準(zhǔn)曲線之前（參見(jiàn)B.7.6）獲得三（3）個(gè)值并記錄平均值（參見(jiàn)表E.1）F.在每次分光光度分析之前，應(yīng)將比色皿用1％SDS溶液沖洗兩次。如果在同一過(guò)程中試劑對(duì)照A溶液的吸光度大于試劑對(duì)照B的吸光度，則應(yīng)重新制備溶液。F.7.6繪制BSA校準(zhǔn)曲線以下步驟用于標(biāo)稱體積為3.0mL的比色皿。如果比色皿的標(biāo)稱體積大于或小于此值，請(qǐng)相應(yīng)地調(diào)整體積。使用等體積的樣品和稀釋劑（1：1體積比的混合物）。如果使用的所有比色皿對(duì)所用試劑的吸光度相近，則可以使用多個(gè)比色皿確定樣品的吸光度。F.7.6.1樣品制備和紫外數(shù)據(jù)采集步驟準(zhǔn)備樣品以獲取數(shù)據(jù)，如下所示：a)確保在進(jìn)行前的同一天已執(zhí)行系統(tǒng)適用性控制（請(qǐng)參閱B.7.5.2）和試劑控制（請(qǐng)參閱B.7.5.3GB/T35267.5—XXXXb)使用已校準(zhǔn)的自動(dòng)移液器，將等體積的對(duì)照試劑A和準(zhǔn)備好的待測(cè)BSA稀釋液（例如1.50mL的對(duì)照試劑A和+1.50mLBSA稀釋液）添加到比色皿中；c)用一次性移液器混合比色皿中的內(nèi)容物。應(yīng)注意盡量減少氣泡的形成，因?yàn)檫@會(huì)干擾分光光度計(jì)的讀數(shù)；d)靜置60s至90s，并確保樣品不渾濁；e)將比色皿放在UV-Vis分光光度計(jì)中，并從溶液中獲得三個(gè)讀數(shù)。記錄平均值（見(jiàn)表E.2注2：所獲得的吸光度是針對(duì)BSA樣品/在使用的稀釋f)移開比色皿，丟棄內(nèi)容物并用1％SDS溶液沖洗兩次；g)使用校準(zhǔn)的自動(dòng)移液器向試管中加入等體積的OPA試劑和準(zhǔn)備好的待測(cè)BSA稀釋液（例如1.50mLOPA試劑和+1.50mLBSA稀釋液）；h)用一次性移液器混合比色皿中的內(nèi)容物，應(yīng)注意盡量減少氣泡的形成，因?yàn)檫@會(huì)干擾分光光度計(jì)的讀數(shù)；i)靜置60s至90s，并確保樣品不渾濁；j)將比色皿放在UV-Vis分光光度計(jì)中，并從溶液中獲得三個(gè)讀數(shù)，記錄平均值（見(jiàn)表E.2注3：所獲得的吸光度是使用稀釋濃度的BSA樣品/Ok)移開比色皿，丟棄內(nèi)容物，并用1％SDS溶液沖洗兩次；l)對(duì)準(zhǔn)備覆蓋2.5μg/mL至800μg/mL范圍的所有BSA稀釋液重復(fù)B.7.6.1b）至B.7.6.1注4：用比色皿中的稀釋劑將BSA溶液樣品的濃度（BSA初始濃度）有效地減半（稱F.7.6.2校正標(biāo)準(zhǔn)化平均樣品吸光度（NEBSA）計(jì)算每個(gè)BSA稀釋樣品的平均吸光度，然后使用試劑對(duì)照進(jìn)行減法歸一化（見(jiàn)表E.2）。a)標(biāo)準(zhǔn)化BSA樣品/自身吸光度（SAEn）是平均吸光度值－平均試劑對(duì)照A；b)標(biāo)準(zhǔn)化BSA樣品/OPA試劑（OPAEn）是平均吸光度值－平均試劑對(duì)照B；c)校正標(biāo)準(zhǔn)化平均樣品吸光度（NEN）為OPAEn-SAEn。式中，“n”是被測(cè)樣品的BSA初始濃度，單位為μg/mL。F.7.6.3繪制BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線方法如下：a)將標(biāo)準(zhǔn)化BSA濃度(μg/mL,x軸)與校正標(biāo)準(zhǔn)化樣本平均吸光度(NEBSA,y軸)進(jìn)行繪圖，并用線性趨勢(shì)擬合的方法(y=mx+c類型)擬合成一條最佳擬合線。b)確定并記錄（見(jiàn)表E.1）曲線圖斜率（x-系數(shù)項(xiàng)）、曲線圖截距（c-截距項(xiàng)）和r2值（R2要求＞0.990）。曲線圖的代數(shù)式項(xiàng)用于計(jì)算陰性、陽(yáng)性和浸泡試驗(yàn)STPs樣品中污染物的蛋白質(zhì)濃度。F.8陰性和陽(yáng)性對(duì)照F.8.1陰性對(duì)照STPs無(wú)涂層的STPs作空白測(cè)定，用來(lái)確定干擾物質(zhì)的背景水平。在檢測(cè)前，確保作為陰性對(duì)照的兩種STPs（N1,N2）的重量都已確定并記錄。應(yīng)在構(gòu)建BSA校準(zhǔn)曲線后進(jìn)行陰性對(duì)照STPs蛋白測(cè)定。使用洗脫法完成STPs提取，然后使用OPA方法獲得校正標(biāo)準(zhǔn)化平均樣本吸光度（NE），然后從BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線推導(dǎo)出代數(shù)式的項(xiàng)，確定兩個(gè)單獨(dú)STPs上的蛋白質(zhì)（作為BSA當(dāng)量）的數(shù)量。GB/T35267.5—XXXX注意檢測(cè)極限是試劑對(duì)照A的吸光度（見(jiàn)B.7.5.3）。F.8.1.1測(cè)量陰性對(duì)照STPs上蛋白質(zhì)的含量測(cè)量陰性對(duì)照STPs蛋白質(zhì)含量的方法如下：a)通過(guò)洗脫法完成STP的提?。ㄒ?jiàn)B.6）。對(duì)保留的STP進(jìn)行重量分析（見(jiàn)B.10）。b)確保系統(tǒng)適宜性控制（見(jiàn)b.7.5.2）和試劑控制（見(jiàn)b.7.5.3）在進(jìn)行前的同一天執(zhí)行。c)用一個(gè)標(biāo)有刻度的自動(dòng)移液管將等體積的試劑對(duì)照品a和提取的陰性對(duì)照STP洗脫溶液（各1.50mL）加入比色皿中。d)用一次性吸管混合比色皿內(nèi)的物質(zhì)。應(yīng)盡量減少氣泡的形成，氣泡會(huì)干擾分光光度計(jì)讀數(shù)的準(zhǔn)確性。e)靜置(60~90)s，確保樣品不渾濁/模糊。f)將樣品放入紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)中，得到溶液的三次讀數(shù)。記錄平均值（見(jiàn)表E.3）。g)取出比色皿，棄去內(nèi)容物，用1%SDS溶液沖洗兩次。h)使用標(biāo)有刻度的自動(dòng)吸管將等體積的OPA試劑和提取的陰性對(duì)照STP洗脫溶液（各1.50mL）加入比色皿中。i)用一次性吸管混合比色皿內(nèi)的物質(zhì)。應(yīng)盡量減少氣泡的形成，氣泡會(huì)干擾分光光度計(jì)讀數(shù)的準(zhǔn)確性。j)靜置(60~90)s，并確保樣品不渾濁/模糊。k)將比色皿放入紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)中，從溶液中獲得三次讀數(shù)。記錄平均值（見(jiàn)表E.3）。l)取出比色皿，棄去內(nèi)容物，用1%SDS溶液沖洗兩次。m)重復(fù)B.8.1.1a）到B.8.1.1l)，建立另一個(gè)陰性對(duì)照STP。F.8.1.2校正標(biāo)準(zhǔn)化陰性對(duì)照樣品的吸光度（NEn）F.計(jì)算每個(gè)陰性對(duì)照樣品各自吸光度的平均值，然后使用試劑對(duì)照進(jìn)行減法的歸一化（見(jiàn)表a)標(biāo)準(zhǔn)化樣品/自吸光度(SAEn）=平均吸光度值-平均試劑對(duì)照A；b)標(biāo)準(zhǔn)化樣品/OPA試劑(OPAEn）=平均吸光度值-平均試劑對(duì)照B；c)陰性對(duì)照的校正標(biāo)準(zhǔn)化樣本平均吸光度STPs:NEn=OPAEn-SAEn。其中，對(duì)于STP為N1或N2，n的值是1或2。F.每個(gè)陰性對(duì)照STP試驗(yàn)的蛋白質(zhì)含量（mg）使用下面的公式（B.1）計(jì)算，其中項(xiàng)x（系數(shù)）和c（截距）之前已通過(guò)BSA校準(zhǔn)曲線確定：xNxNE?c然后計(jì)算陰性對(duì)照STPs的平均蛋白含量（見(jiàn)表E.3）。F.8.2陽(yáng)性對(duì)照STPsGB/T35267.5—XXXX確保在試驗(yàn)前確定并記錄兩種作為陽(yáng)性對(duì)照的STPs的重量[見(jiàn)B.3.3.2i)]。陽(yáng)性對(duì)照STPs蛋白試驗(yàn)應(yīng)在BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線建立后進(jìn)行。使用洗脫法完成STP提取，然后使用OPA方法獲得校正標(biāo)準(zhǔn)化平均樣本吸光度（NE然后使用從BSA校準(zhǔn)曲線推導(dǎo)出代數(shù)式的項(xiàng)，確定兩個(gè)單獨(dú)STPs上的蛋白質(zhì)（作為BSA當(dāng)量）的數(shù)量。應(yīng)計(jì)算兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照STPs的平均蛋白質(zhì)含量，然后結(jié)合STPs涂層平均重量（見(jiàn)B.10）來(lái)確定每一污染物上的蛋白質(zhì)含量（mg蛋白質(zhì)/mg污染物涂層）。該值用于計(jì)算在浸泡試驗(yàn)中所使用的涂層STPs上蛋白質(zhì)的理論涂層量。檢測(cè)的極限為試劑對(duì)照A獲得的吸光度（見(jiàn)B.7.5.3）。F.8.2.1檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照STPs的蛋白含量檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照STPs蛋白含量如下：a)通過(guò)洗脫法完成STP提?。ㄒ?jiàn)B.6）。對(duì)保留的STP進(jìn)行重量分析（見(jiàn)B.10）。除了已規(guī)定的STP編號(hào)外，還要將洗脫內(nèi)容標(biāo)記為P1和P2。b)在進(jìn)行對(duì)照之前，準(zhǔn)備好適合的材料（見(jiàn)B.7.5.2）和試劑用量（見(jiàn)B.7.5.3）。c)使用校準(zhǔn)的自動(dòng)移液管將1000μl陽(yáng)性對(duì)照STP洗脫溶液添加到含有4mL（4000μl）1%SDS溶液的小瓶中，并充分混合。這是必要的稀釋步驟，以確保獲得的吸光度值在BSA校準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。d)用經(jīng)校準(zhǔn)的自動(dòng)移液管，向試管中加入等量的試劑對(duì)照組A和1號(hào)稀釋樣品（見(jiàn)B.8.2.1c）各50mL。e)使用一次性移液管混合試管中的試劑。應(yīng)注意盡量減少氣泡的形成，因?yàn)檫@會(huì)干擾分光光度計(jì)的讀數(shù)。f)放置60秒至90秒，確保樣品不混濁/模糊。g)將樣品放置于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中，并讀取溶液的三個(gè)讀數(shù)。記錄其平均值（見(jiàn)表E.4）。h)倒掉試管中的溶液，并用1%SDS溶液沖洗兩次試管。i)使用經(jīng)校準(zhǔn)的自動(dòng)移液管，向試管中加入等量的OPA試劑和1號(hào)稀釋樣品（見(jiàn)B.8.2.1c）各50mL。j)使用一次性移液管混合試管中的試劑。應(yīng)注意盡量減少氣泡的形成，因?yàn)檫@會(huì)干擾分光光度計(jì)的讀數(shù)。k)放置60秒至90秒，確保樣品不混濁/模糊。l)將試管放置于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中，并讀取溶液的三個(gè)讀數(shù)。記錄其平均值（見(jiàn)表E.4）m)倒掉試管中的溶液，并用1%SDS溶液沖洗兩次試管。n)重復(fù)B8.2.1a）至B8.2.1m）步驟，來(lái)獲得另一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照STP。F.8.2.2校正標(biāo)準(zhǔn)化陽(yáng)性對(duì)照樣品吸光度值（NEn）F.對(duì)于所使用的每個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣品，計(jì)算各自的平均吸光度值，然后使用試劑對(duì)照品通過(guò)減法進(jìn)行歸一化，如下：a)標(biāo)準(zhǔn)化樣品/自身吸光度值（SAEn）是記錄的陽(yáng)性對(duì)照試劑A組的平均吸光度值；b)標(biāo)準(zhǔn)化樣品/OPA試劑（OPAEn）是記錄的陽(yáng)性對(duì)照試劑B組的平均吸光度值；c)陽(yáng)性對(duì)照STPs的校正標(biāo)準(zhǔn)化平均樣品吸光度值NEn）=（OPAEn）-（SAEn其中，n為1或2時(shí)是相對(duì)于STPs的P1或P2，如B.8.2.1a）中所述。GB/T35267.5—XXXXF.每個(gè)被檢測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量（mg）由以下公式（B.2）得出，其中公式中的x（系數(shù)）和c（截距）已由BSA校準(zhǔn)曲線確定：xNxNE?c然后計(jì)算出所有檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照組STPs的平均蛋白質(zhì)含量。F.9浸泡試驗(yàn)STPs殘留蛋白質(zhì)的測(cè)定-紫外可見(jiàn)光譜分析法對(duì)于經(jīng)過(guò)浸泡試驗(yàn)（見(jiàn)B.5）洗脫萃?。ㄒ?jiàn)B.6）的STPs，如果樣品吸光度大于1.200，則在進(jìn)行紫外可見(jiàn)光譜分析之前，洗脫溶液可能需要額外稀釋[見(jiàn)B.9b]。用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定殘余蛋白質(zhì)，如下所示。a)按照陰性對(duì)照STPs的蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法（見(jiàn)B.8.1.1并利用公式（B.1見(jiàn)B.）計(jì)算殘余蛋白質(zhì)含量；b)如果發(fā)現(xiàn)吸光度值大于1.200，則按照包括額外稀釋步驟的陽(yáng)性對(duì)照STPs蛋白質(zhì)含量測(cè)量方法（見(jiàn)B8.2.1），并使用公式（B2）計(jì)算殘余蛋白質(zhì)含量（見(jiàn)B.）；c)記錄結(jié)果（見(jiàn)表E.5）。F.10STP涂層重量的測(cè)定F.10.1清潔使用過(guò)的STPs應(yīng)徹底清潔、干燥和稱重試驗(yàn)使用的所有STPs，以確定STP的實(shí)際污染物涂層重量。F.10.2步驟測(cè)定STP涂層重量如下：a)向干凈的玻璃燒杯（500mL）中加入300mLSDS清洗液（見(jiàn)B.12.3），并加熱至40℃;b)將STPs上所有松散的玻璃珠去除；c)將所有STPs放入清洗液中；d)連續(xù)攪拌溶液（10～15）min，確保STPs不會(huì)粘連在一起；e)使用鑷子取出單個(gè)的STP，浸入含有500mL純水的燒杯中，同時(shí)旋轉(zhuǎn)STPs，然后浸入含有500mL純水的第二個(gè)干凈燒杯中，再次旋轉(zhuǎn)；f)用鑷子將STP浸入含有100mL丙酮或70%異丙醇的燒杯中，并旋轉(zhuǎn)溶液；g)用鑷子取出STP，放在無(wú)絨布或紙巾上，讓兩邊風(fēng)干；h)檢查STP的清潔度（使用鑷子操作STP）。如果有可見(jiàn)微粒/殘留物，重復(fù)B.10.2的步驟；i)對(duì)其余所有的STPs重復(fù)B.10.2e）至B.10.2h）的操作步驟。F.10.3STPs涂層重量（重量分析）進(jìn)行重量分析如下：a)使用干凈并且干燥的鑷子或鉗子，用精確到小數(shù)點(diǎn)后4位的實(shí)驗(yàn)室分析天平分別稱量已徹底清潔和干燥（見(jiàn)B.10.2）的所有處理后的STPs，并記錄重量（見(jiàn)表E.3、E.4和E.5）；b)從B.3.3.2i陽(yáng)性對(duì)照和浸泡STPs）或B.3.4.1B陰性對(duì)照）中確定的STPs總重量減去清潔的STP重量[見(jiàn)B.10.3a）]來(lái)計(jì)算STP涂層重量。見(jiàn)表E.3、E.4和E.5。F.11浸泡后STPs上蛋白質(zhì)殘留量的計(jì)算GB/T35267.5—XXXXF.11.1使用以下計(jì)算方法計(jì)算每片的蛋白質(zhì)含量，并記錄結(jié)果（詳見(jiàn)表格E.4）。陽(yáng)性對(duì)照蛋白平均含量（詳見(jiàn)B.）÷平均陽(yáng)性對(duì)照毛重（詳見(jiàn)B.10.3）。F.11.2使用以下方式計(jì)算并記錄結(jié)果，計(jì)算用于浸泡試驗(yàn)的STP的理論計(jì)算蛋白質(zhì)含量（mg詳見(jiàn)表STPn重量（見(jiàn)B.10.3）x每片的蛋白質(zhì)含量（見(jiàn)B.11.1）。其中“n”是選定的STP編號(hào)。F.11.3使用公式（B.3）計(jì)算測(cè)試STP上剩余的蛋白質(zhì)百分比，如下所示 理論計(jì)算蛋白質(zhì)含量詳見(jiàn)B.11.2)F.11.4根據(jù)公式（B.3）計(jì)算的剩余蛋白質(zhì)百分比應(yīng)符合B.2中規(guī)定的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。F.12溶液的制備F.12.1概述下面制備的溶液，尤其是含有十二烷基硫酸鈉（SDS）作為組分的溶液，偶爾會(huì)變得渾濁，通常在20℃以下或長(zhǎng)期儲(chǔ)存時(shí)。使用前，應(yīng)檢查所有溶液是否有沉淀。如果觀察到沉淀，在溫水下將溶液加熱至35℃并攪拌，直到所有固體溶解。制備的溶液，尤其是用于進(jìn)行紫外光可見(jiàn)光控制的溶液（詳見(jiàn)B.7.5）應(yīng)清澈無(wú)可見(jiàn)雜質(zhì)。F.12.2含量1%SDS溶液的制備1%SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液（見(jiàn)表B.7）應(yīng)用作已處理STPs浸泡的洗脫溶液，以及用于UV-Vis分析的稀釋劑和比色皿沖洗溶液。該溶液也用作UV-Vis對(duì)照品（系統(tǒng)適用性試驗(yàn)）。以下方法適用于2.0通常足以進(jìn)行試驗(yàn)。溶液在20℃至25℃（室溫）下穩(wěn)定，無(wú)需特殊儲(chǔ)存。表B.71%十二烷基硫酸鈉溶液所需的成分--制備1%十二烷基硫酸鈉溶液如下：a)稱取20.000g±0.002g十二烷基硫酸鈉并記錄重量；b)在2L燒杯中加入1800mL純水；c)向純水中加入十二烷基硫酸鈉，攪拌直至得到溶液；d)如果需要，使用氫氧化鈉溶液測(cè)量并調(diào)節(jié)pH至11.0–11.1；e)將溶液轉(zhuǎn)移到2L容量瓶中；f)用150mL純水沖洗2L燒杯，并向容量瓶中添加洗滌液；g)用更多的純水補(bǔ)充至容量瓶上的2L標(biāo)記；h)塞住容量瓶并混合內(nèi)容物；i)將2L容量瓶中的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到合適的瓶子中；j)在瓶子上貼上準(zhǔn)備日期和內(nèi)容物的標(biāo)簽。F.12.3處理后的STPs清洗液的制備GB/T35267.5—XXXX在測(cè)定涂層重量（見(jiàn)B.10）之前，用10%w/w十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液（見(jiàn)表B.8）清洗處理過(guò)的STPs。以下方法適用于2.0L，通常足以進(jìn)行清潔。溶液在20℃至25℃（室溫）下穩(wěn)定，無(wú)需特殊儲(chǔ)存。表B.810%（w/w）十二烷基硫酸鈉溶液所需的成分--制備STP清洗液如下：a)稱取200.0g±0.5g十二烷基硫酸鈉并記錄重量；b)向2L燒杯中添加1800g±0.5g純水（按重量計(jì)）；c)向純水中加入十二烷基硫酸鈉，攪拌直至得到溶液。如果需要幫助溶解，加熱至50℃;d)轉(zhuǎn)移到一個(gè)合適的瓶子里，貼上內(nèi)容物和制備日期的標(biāo)簽；e)溶液在20℃至25℃（室溫）下穩(wěn)定，無(wú)需特殊儲(chǔ)存。F.12.4含量20%（w/w）十二烷基硫酸鈉溶液的制備使用20%（w/w）SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液（見(jiàn)表B.9）作為成分制備SDS/硼酸鹽（見(jiàn)B.12.6）和OPA試劑（見(jiàn)B.12.7）。以下方法適用于200mL。溶液在20℃至25℃（室溫）下穩(wěn)定，無(wú)需特殊儲(chǔ)存。表B.920%（w/w）十二烷基硫酸鈉溶液所需的成分 按如下方法制備20%（無(wú)重量）SDS溶液：a)將140mL的純水加入一個(gè)200mL的容量瓶中；b)稱量40.00g±0.02gSDS，并記錄重量；c)將SDS部分加入體積瓶，同時(shí)輕輕攪拌以幫助溶解（如需要可加熱至50℃);d)溶解后，加入純水，達(dá)到200mL；e)停止使用容量瓶，輕輕混合內(nèi)容物，以減少發(fā)泡；f)將容量瓶中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到合適的瓶子和標(biāo)簽內(nèi)容物中。制備20%（w/w）SDS溶液使溶液攪拌泡沫?；旌蠎?yīng)保持在最低限度，但足以幫助固體溶解。F.12.50.1M硼酸鹽溶液的制備0.1M硼酸鹽溶液（見(jiàn)表B.10）用作制備SDS/硼酸鹽（見(jiàn)B.12.6）和OPA試劑（見(jiàn)B.12.7）.該溶液在20℃至25℃（室溫）下保持穩(wěn)定，不需要特殊存儲(chǔ)。表B.100.1M硼酸鹽溶液所需的組分--按如下方法制備0.1M的硼酸鹽溶液：a)稱量76.20g±0.01g十水合四硼酸鈉，并記錄重量；b)將1500mL的純水（已加熱至40℃至45℃)加入一個(gè)2L的燒杯中；c)將十水合四硼酸鈉加入含有純水的燒杯中，攪拌至溶解；d)將溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)2L的容量瓶中；GB/T35267.5—XXXXe)用3x100mL純水沖洗出2L燒杯，并在2L容量燒瓶中加入洗滌液；f)允許2L容量瓶中的內(nèi)容物平衡到20℃至25℃（室溫）；g)用純水、塞子和混合物配制到2L標(biāo)記；h)將0.1M硼酸鹽溶液轉(zhuǎn)移到瓶子中，并標(biāo)明內(nèi)容物和準(zhǔn)備日期。F.12.6SDS/硼酸鹽溶液的制備SDS/硼酸鹽溶液（見(jiàn)表B.11）作為稀釋劑，以確定測(cè)試樣品的自吸光度，并構(gòu)建BSA校準(zhǔn)曲線（見(jiàn)B.7.6）該溶液也用作紫外－可見(jiàn)控制（系統(tǒng)適用性測(cè)試）。以下方法為1.0l，溶液在20℃至25℃（室溫）下穩(wěn)定，不需要特殊存儲(chǔ)。表B.11SDS/硼酸鹽溶液成分組成---->99.0%-->99.0% 配置SDS/硼酸鹽溶液，方法如下：a)將以下溶液依次加入1L容量瓶中，倒入時(shí)輕輕攪拌；1)20%(w/w)SDS溶液50mL，3)純水20mL；b)向1L容量瓶中緩緩加入0.1M硼酸鹽溶液，直至瓶?jī)?nèi)溶液體積達(dá)到1L；c)塞住容量瓶并使瓶?jī)?nèi)各溶劑充分混合，然后將溶液轉(zhuǎn)移到合適的瓶子中，并貼上溶劑名稱和制備日期的標(biāo)簽；d)使用1M氫氧化鈉溶液將溶液的pH值調(diào)節(jié)至9.3±0.1。F.12.7OPA試劑的制備以O(shè)PA試劑（見(jiàn)表B.12）為稀釋劑，測(cè)定供試品和為構(gòu)建BSA校準(zhǔn)曲線而制備的稀釋樣品的OPA吸光度。試劑也是紫外－可見(jiàn)對(duì)照品（系統(tǒng)適用性試驗(yàn)）。以下方法適用于1.0L。將OPA試劑儲(chǔ)存在20℃至25℃（室溫）的暗處，直至需要使用，并在14天內(nèi)使用。表B.12OPA試劑所需成分>99.0%>98.0%-- >99.0%>99.0%->99.0% 制備OPA試劑溶液，方法如下：a)稱取1.6g±0.01gOPA和4.64g±0.005g2-巰基乙磺酸鈉分別放在小瓶中并記錄重量；b)向OPA中添加20mL甲醇并溶解固體，視情況在純水下短暫加熱，以幫助溶解；c)向2-巰基乙磺酸鈉中加入20mL純水，溶解固體；GB/T35267.5—XXXXd)在1L燒杯中，添加50mL20%（w/w）SDS溶液和750mL0.1M硼酸鹽溶液，并輕輕攪拌混合；e)向燒杯中加入OPA/甲醇溶液[見(jiàn)B.12.7B）]，并用20mL0.1M硼酸鹽溶液沖洗小瓶。向燒杯中加入沖洗液；f)向燒杯中加入2-巰基乙磺酸鈉鹽溶液[見(jiàn)B.12.7c）]，并用20mL0.1M硼酸鹽溶液沖洗小瓶。向燒杯中加入沖洗液；g)蓋上燒杯并繼續(xù)攪拌，直到所有固體溶解并獲得完整的溶液；h)將燒杯中的液體倒入1L容量瓶中；i)每次使用50mL0.1M硼酸鹽溶液沖洗燒杯兩次，并向燒瓶中添加沖洗液；j)用0.1M硼酸鹽溶液補(bǔ)充至1L標(biāo)記；塞住并混合溶液；k)將溶液轉(zhuǎn)移到適當(dāng)大小的瓶子中（首選黃褐色玻璃）；l)使用1M氫氧化鈉溶液將溶液的pH值調(diào)節(jié)至9.3±0.1；m)用鋁箔包裹容量瓶底部和頸部，以避免溶液降解。GB/T35267.5—XXXX附錄H（資料性）附錄I檢測(cè)和評(píng)估殘留蛋白質(zhì)污染物試驗(yàn)方法的示例型式檢驗(yàn)（以及性能和常規(guī)檢測(cè)）中清潔效果的初步檢查采用目視檢查法。殘留蛋白質(zhì)的定量分析應(yīng)只適用于目測(cè)清潔的產(chǎn)品。定量檢測(cè)方法的選擇應(yīng)考慮其檢測(cè)范圍、準(zhǔn)確性和特異性，且應(yīng)與驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)和被檢產(chǎn)品相適應(yīng)。改良的鄰苯二甲醛（OPA）法（見(jiàn)參考文獻(xiàn)[57]、[74]和[75]）和二喹啉甲酸（BCA）方法（見(jiàn)參考文獻(xiàn)[90]和[92]）是取樣后蛋白質(zhì)定量的首選方法。由于OPA和BCA方法不直接測(cè)定蛋白質(zhì)，殘留的過(guò)程化學(xué)品或其他物質(zhì)可能會(huì)干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定。因此，需要檢測(cè)陰性對(duì)照（即與檢測(cè)器械相同處理和提取的未受污染的醫(yī)療器械）以排除干擾。I.1.1樣品處理通過(guò)用1%十二烷基硫酸鈉（SDS）的水溶液沖洗（或提?。┊a(chǎn)品或產(chǎn)品的指定區(qū)域，來(lái)獲得殘留蛋白質(zhì)分析樣品。應(yīng)優(yōu)先提取產(chǎn)品中與患者組織接觸并在重復(fù)使用過(guò)程中產(chǎn)生轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的區(qū)域。這樣可避免結(jié)果來(lái)自產(chǎn)品非關(guān)鍵區(qū)域。應(yīng)將用于提取的1%SDS溶液應(yīng)將pH值調(diào)節(jié)到11，并使用刻度至少為0.5pH單位的pH試紙，或用0.1N的氫氧化鈉溶液校準(zhǔn)過(guò)的pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。蛋白質(zhì)提取方法的有效性應(yīng)通過(guò)確保所有殘留物都溶解來(lái)檢驗(yàn)，例如，通過(guò)使用蛋白染色劑對(duì)非溶性殘留物進(jìn)行染色，如考馬斯亮藍(lán)R-250、氨基黑、SYPRORuby、STAINSALL（廣譜染色劑）、PonceauS（麗春紅S）。注1：所描述的光譜檢測(cè)方法不能有效地檢測(cè)到提取物應(yīng)用最小體積的1%SDS溶液進(jìn)行提取，以避免因使用大體積提取而引起的任何分析誤差，并有一個(gè)適當(dāng)?shù)臋z測(cè)限來(lái)評(píng)估檢測(cè)樣品表面蛋白質(zhì)殘留的實(shí)際情況。大體積提取會(huì)因稀釋效應(yīng)而顯著降低總靈敏度。因此，提取體積應(yīng)盡可能小的同時(shí)確保所有被污染的表面能不斷被浸濕或浸沒(méi)，允許提取液在取樣表面上流動(dòng)。然而，過(guò)少體積提取會(huì)降低蛋白質(zhì)回收率。因此，需要仔細(xì)地平衡漂洗體積。浸濕產(chǎn)品比將提取體積降低到給定限度以下更重要。此外，小體積重復(fù)提取比大體積單次提取更有效。若染色顯示有不溶解的蛋白質(zhì)，可以通過(guò)加熱SDS溶液（如，40℃)和超聲的方式來(lái)提高提取效率。注2：在參考文獻(xiàn)[94]公布的數(shù)據(jù)表明，在溫度高的pH=11SDS溶液可以用于溶解來(lái)自血樣中高分子量纖維蛋白殘留不能使用光譜檢測(cè)方法來(lái)測(cè)定任何沒(méi)有經(jīng)過(guò)過(guò)濾或單獨(dú)的濁度測(cè)量校正的混濁溶液中的蛋白質(zhì)。如果渾濁是由于后處理中的錯(cuò)誤造成的，則應(yīng)確定產(chǎn)生渾濁的原因并加以糾正。渾濁樣本可使用0.2μm注射過(guò)濾器過(guò)濾除去混濁，但必須確保濾膜不吸附蛋白質(zhì)。膜過(guò)濾應(yīng)與蛋白質(zhì)測(cè)定的所有其他步驟一起進(jìn)行驗(yàn)證。使用SDS溶液的提取應(yīng)在一段確定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，期間應(yīng)進(jìn)行密集攪拌（無(wú)論是手工攪拌還是使用渦旋器）或沖洗。例如，SDS提取可以通過(guò)浸泡30分鐘，每10分鐘進(jìn)行30秒的密集攪拌/沖洗來(lái)完成。也GB/T35267.5—XXXX可以使用其他驗(yàn)證過(guò)的提取方法。提取方法應(yīng)確保獲得適當(dāng)?shù)奶崛⌒手?。?：用2-5mLSDS溶液的聚苯烯袋提取產(chǎn)品表面的蛋白質(zhì)?？梢允褂醚b有2-5mL1%SDS溶液的密封、牢固且大到可容納產(chǎn)品的聚苯烯（pp）袋來(lái)提取整個(gè)產(chǎn)品上的殘留污染物。一旦產(chǎn)品密封在有1%SDS溶液的袋中，就可通過(guò)翻轉(zhuǎn)或搖動(dòng)袋和通過(guò)袋操作產(chǎn)品來(lái)提取。鉸鏈產(chǎn)品應(yīng)通過(guò)袋子操作，以使SDS溶液與鉸鏈的隱藏表面接觸。注3：聚丙烯、其他袋材料和塑料管通常用助滑劑或脫模劑（例如脲酰胺）進(jìn)行處理，從而使在產(chǎn)品密集混合過(guò)程中從塑料表面釋放出來(lái)，并在提取液中產(chǎn)生渾濁。這是測(cè)試陰性對(duì)照的很好做法（即與測(cè)試產(chǎn)品相同處理和提取的未污染產(chǎn)品），以識(shí)別任何干擾。帶有腔體或者大且容易接近空腔的產(chǎn)品（如穿刺套管）的提取用一個(gè)合適的聚丙烯塑料袋也是可行的。通過(guò)來(lái)回傾斜，SDS溶液可以定向例2：用2-3mLSDS溶液從鉸鏈產(chǎn)品中部分提取蛋白質(zhì)一些鉸鏈產(chǎn)品（如：Crile夾具）被用于標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試，以評(píng)估關(guān)鍵功能區(qū)域的清潔效果，如鉸鏈。在SDS溶液中萃取時(shí)，鉸鏈需要對(duì)接點(diǎn)進(jìn)行密集活動(dòng)。例3：用2-5mLSDS溶液從軸管中提取提取具有狹長(zhǎng)腔體的產(chǎn)品時(shí)，可以將其末端放置在燒杯中并用實(shí)驗(yàn)室支架夾子固定直立。使用移液管或注射器將2-5mL的SDS溶液注入沖洗產(chǎn)品管腔中。從燒杯中抽取SDS溶液。在提取過(guò)程中，每間隔一段時(shí)間（如5min），使用同一SDS溶液來(lái)回沖洗循環(huán)5次。類似的提取過(guò)程也可以用于可拆卸的微創(chuàng)外科（MIS）產(chǎn)品，通過(guò)將軸與具有功能端的插入件分離，并將插入件放置在長(zhǎng)度和內(nèi)徑都足以容納產(chǎn)品的一段試管中。夾緊或密封一端，加入SDS溶液進(jìn)行提取。同樣夾緊或密封另一端并旋轉(zhuǎn)產(chǎn)品，使SDS溶液來(lái)回流動(dòng)。內(nèi)部通道可能接觸到污染物質(zhì)且無(wú)法目測(cè)的樣品，應(yīng)用SDS溶液沖洗以收集樣品。I.1.2蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的校準(zhǔn)殘留蛋白的準(zhǔn)確定量取決于用于該方法制備的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。用于校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清白蛋白（BSA，分?jǐn)?shù)V）。準(zhǔn)備或購(gòu)買濃度為200mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)原液。使用1%SDS溶液中稀釋此原液制備濃度梯度的稀釋液（例如200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL），并儲(chǔ)存在干凈的試管中。產(chǎn)品提取物的蛋白質(zhì)含量通過(guò)比較提取物的測(cè)量值與通過(guò)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸線計(jì)算得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)決定。標(biāo)準(zhǔn)樣品和提取物樣品應(yīng)以相同的方式進(jìn)行分析。I.2評(píng)價(jià)殘留蛋白污染物的改良OPA法改良的鄰苯二甲醛（OPA）法是一種測(cè)定一級(jí)氨基團(tuán)的定量方法，它們存在于蛋白質(zhì)多肽鏈的游離α-氨基和賴氨酸(ε-）上。OPA法在N，N-二甲基-2-巰基乙基氯化銨和一級(jí)氨基團(tuán)的存在下，形成穩(wěn)定的熒光色烷基硫-2-烷基異吲哚，在340nm處可用分光光度法檢測(cè)。伯胺普遍存在自然界中，且可出現(xiàn)在加工過(guò)程中使用的化學(xué)物質(zhì)中，因此要將陰性對(duì)照的確定包括在內(nèi)，以排除可能干擾的物質(zhì)。注可以使用類似或更高精度的方法，例如：熒光計(jì)（見(jiàn)參考文獻(xiàn)[82]）。制備OPA試劑溶液時(shí)，應(yīng)將40mg鄰苯二甲醛溶于1mL甲醇中（混合至完全溶解），然后加入50mL的0.1M四硼酸二鈉緩沖液（pH為9.3）100mg的N，N-二甲基-2-巰基乙基氯化銨和1.25mL的20%SDS水溶液。應(yīng)將溶液儲(chǔ)存在不透明的瓶子中以避免光線照射，且配制當(dāng)天使用有效。GB/T35267.5—XXXX用1%SDS溶液以相同比例稀釋OPA試劑來(lái)制備分光度計(jì)空白組，用于標(biāo)準(zhǔn)溶液和產(chǎn)品提取物的蛋白質(zhì)測(cè)定。使用空白試驗(yàn)值將分光光度計(jì)調(diào)零。調(diào)整分光光度計(jì)波長(zhǎng)為340nm，并使用光程1cm的石英比色皿（或適用于此波長(zhǎng)的一次性半微量比色皿）。在測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)溶液和產(chǎn)品提取物樣品時(shí)，使用相同比例的樣品和OPA試劑。例如，加入200μl標(biāo)準(zhǔn)溶液或提取樣品到1mL（1：5）新制備的OPA溶液中。只要反應(yīng)混合物的pH保持在9.3（用pH試紙確認(rèn)），樣品與OPA試劑的比例可降到1：1。較低的稀釋濃度會(huì)導(dǎo)致OPA試劑的pH發(fā)生變化，并有可能使結(jié)果無(wú)效。使用吸液管混合反應(yīng)液，或使用瓶蓋蓋住比色皿，并輕輕搖晃對(duì)溶液進(jìn)行完全混合。反應(yīng)5min并將混合后產(chǎn)生的所有氣泡除去后，測(cè)定其吸光度值。當(dāng)吸光度值＞0.010時(shí)，所分析的樣品可能含有可吸收340nm波長(zhǎng)光的物質(zhì)。因此，應(yīng)確定自吸光度值并從OPA測(cè)量結(jié)果中減去。自吸光度的測(cè)定采用相同比例的樣品加入1%SDS溶液中（代替OPA試劑）。吸取200μl的1%SDS產(chǎn)物提取液到1mL的1%SDS溶液中，混合并測(cè)定1%SDS溶液的吸光度。從OPA反應(yīng)后樣品的吸光度和相對(duì)于牛血清白蛋白稀釋系列的校準(zhǔn)確定的蛋白質(zhì)量中減去（見(jiàn)C.1.2）。I.2.3蛋白質(zhì)含量的計(jì)算為了計(jì)算產(chǎn)品或提取部分上的總殘留蛋白，應(yīng)考慮提取中所使用的SDS溶液的體積。提取樣品中蛋白質(zhì)的濃度(μg/mL）乘以用于提取被測(cè)產(chǎn)品/區(qū)域的1%SDS的總體積（mL）。例如，如果測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度為10μg/mL，提取液體積為5mL，則總殘留蛋白質(zhì)為50μg。如上述，不必要的高提取液體積會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)計(jì)算結(jié)果倍增、分析干擾及干擾蛋白質(zhì)測(cè)定方法。I.2.4驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)/結(jié)果解釋查閱有關(guān)干擾物質(zhì)的相關(guān)文獻(xiàn)。I.3評(píng)價(jià)殘留蛋白質(zhì)污染物的BCA方法二喹啉甲酸法與雙縮脲反應(yīng)相似，在堿性環(huán)境中，蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu+，Cu+與2分子的二喹啉甲酸結(jié)合生成在562nm波長(zhǎng)處有最大吸收的紫色生色團(tuán)。在試驗(yàn)環(huán)境下，可將Cu2+還原成Cu+的其他物質(zhì)也會(huì)形成BCA生色團(tuán)。因此，進(jìn)行陰性對(duì)照組有助于排除干擾。I.3.2材料/試劑試劑A和B的配制如下：試劑A：將1g的2,2-聯(lián)喹啉-4,4－二甲酸二鈉，2g的碳酸鈉，0.16g的酒石酸鈉，0.4g的NaOH和0.95g的碳酸氫鈉加入100mL蒸餾水中，并用10M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至11.25。試劑B：將0.4g五水硫酸銅加入10mL蒸餾水中。將100份試劑A與2份試劑B混合制備成標(biāo)準(zhǔn)溶液（SWS）。將SWS溶液儲(chǔ)存在不透光的瓶子中以避免光線照射，且配制當(dāng)天使用有效。將100μl提取液或標(biāo)準(zhǔn)溶液加入1mLSWS（或200μl提取物或標(biāo)準(zhǔn)溶液和2mLSWS）作為試驗(yàn)，將100μl純水加1mLSWS作為空白對(duì)照組?；旌喜⒃谑覝叵路磻?yīng)兩小時(shí)（20℃±1℃)。然后在10分鐘內(nèi)用分GB/T35267.5—XXXX光光度計(jì)在562nm波長(zhǎng)下測(cè)量空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液和產(chǎn)品提取樣品，通過(guò)在清潔的試管中測(cè)量純化水來(lái)重置為零，通過(guò)從測(cè)量值中減去空白值來(lái)調(diào)整測(cè)量值。注意：BCA試驗(yàn)的顯色依據(jù)反應(yīng)速率（沒(méi)有真正反應(yīng)終點(diǎn)反應(yīng)顏色隨著反應(yīng)物（Cu2+和過(guò)量BCA）的消耗變深。生色團(tuán)在10min內(nèi)無(wú)明顯偏差。產(chǎn)品提取物的蛋白質(zhì)濃度是通過(guò)與牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)比較進(jìn)行確定（見(jiàn)C.1.2）。產(chǎn)品提取物的蛋白濃度相對(duì)于牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)。I.3.4總蛋白含量的計(jì)算計(jì)算產(chǎn)品提取物的總蛋白（見(jiàn)C.2.3）。I.3.5驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)/結(jié)果解釋查閱有關(guān)干擾物質(zhì)的相關(guān)文獻(xiàn)。GB/T35267.5—XXXX附錄K（資料性）附錄L檢測(cè)血紅蛋白以評(píng)估清潔效果的測(cè)試方法示例L.1血紅蛋白檢測(cè)方法L.1.1原理除了通過(guò)目視檢查對(duì)清潔效果進(jìn)行初步檢查外，還可在殘留蛋白測(cè)試的基礎(chǔ)上，進(jìn)行殘留血紅蛋白測(cè)試。殘留血紅蛋白的檢測(cè)可以根據(jù)污垢的種類的調(diào)整。方法的選擇應(yīng)考慮其檢測(cè)范圍、準(zhǔn)確性和特異性，并應(yīng)適合驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)試的產(chǎn)品。血紅蛋白化學(xué)定量中，所有的反應(yīng)都發(fā)生在非蛋白血紅素成分中，其中心位置的鐵分子是氧結(jié)合的位置。由于下面描述的定量方法不能直接測(cè)量血紅蛋白（或直接在特定波長(zhǎng)測(cè)量殘留的工藝化學(xué)品或其他物質(zhì)可能會(huì)干擾血紅蛋白反應(yīng)或可能在相同的波長(zhǎng)吸收。而測(cè)試陰性對(duì)照（即與測(cè)試產(chǎn)品相同加工和提取的未污染樣品）有助于排除化學(xué)或光學(xué)干擾。L.1.2樣品用于殘留血紅蛋白分析的樣品是通過(guò)用1%十二烷基硫酸鈉（SDS），pH為11的水溶液對(duì)產(chǎn)品或產(chǎn)品的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行沖洗（洗脫）或擦拭得到的。關(guān)于殘留蛋白提取方法的詳細(xì)信息，請(qǐng)參照本文檔的C.1.1部分，這些方法同樣適用于血紅蛋白。L.2微血尿測(cè)試條對(duì)血紅蛋白的半定量分析L.2.1原理市售的檢測(cè)試紙非常靈敏，是快速獲得半定量殘留血紅蛋白評(píng)估結(jié)果的簡(jiǎn)便方法，可作為初步篩查試驗(yàn)。這些產(chǎn)品不需要特殊設(shè)備，在幾分鐘內(nèi)給出檢測(cè)結(jié)果，檢出限（LOD）<1μg/mL。這些檢測(cè)試紙使用了一種基于血紅蛋白假過(guò)氧化物酶活性的化學(xué)物質(zhì)。因?yàn)長(zhǎng)OD與允許的殘留血紅蛋白限值相比非常低，因此對(duì)于確認(rèn)清洗后的手術(shù)器械上是否殘留血紅蛋白十分有用。例如，如果測(cè)試產(chǎn)品的表面積為100cm2，干預(yù)水平為2ug/cm2，則允許的殘留血紅蛋白為220μg。L.2.2程序a)將一滴產(chǎn)品提取液（見(jiàn)D.1.2）滴在測(cè)試區(qū)域（檢測(cè)試紙的末端），然后擦拭（從測(cè)試條的側(cè)邊）或輕敲試紙，去除多