QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)

QX200?微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)V4.0PCR技術(shù)的發(fā)展歷程普通PCR定性定量PCR相對(duì)定量數(shù)字PCR絕對(duì)定量數(shù)字PCR時(shí)代來(lái)臨2011/10數(shù)字PCR時(shí)代來(lái)臨2012/06數(shù)字PCR時(shí)代來(lái)臨2012/07數(shù)字PCR時(shí)代來(lái)臨2013/09微滴式數(shù)字PCR用于核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量微滴式數(shù)字PCR用于核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量數(shù)字PCR發(fā)展歷程V4.0數(shù)字PCR背景BertVogelstein著名腫瘤學(xué)家微陣列芯片式數(shù)字PCR均一性差成本高通量低BIO-RAD微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)微滴分析儀微滴發(fā)生器2011年7月2012年3月2012年6月2012年12月QX100上市2012年度讀者選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)備獎(jiǎng)2012年度R&D100創(chuàng)新獎(jiǎng)——美國(guó)科技界的奧斯卡2012年度北美數(shù)字PCR技術(shù)市場(chǎng)領(lǐng)導(dǎo)獎(jiǎng)QX100/200?獲得獎(jiǎng)項(xiàng)QX100/200?用戶分布全球各地微滴式數(shù)字PCR技術(shù)原理V4.0配制反應(yīng)液將引物、探針、DNA模板、ddPCR

supermix配制成20ul反應(yīng)液，加入到微滴發(fā)生卡上1引物和探針ddPCR反應(yīng)液DNA模板DG8微滴發(fā)生卡檢測(cè)微滴將96孔板放入微滴分析儀，順序吸取每個(gè)樣品的微滴并隨載液流逐一通過(guò)雙色檢測(cè)器4

分析數(shù)據(jù)有熒光信號(hào)的微滴為陽(yáng)性，無(wú)熒光信號(hào)的微滴為陰性，軟件記錄每個(gè)樣品里陽(yáng)性微滴的比例5微滴分析器

顯示結(jié)果軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，并以多種方式顯示檢測(cè)結(jié)果6PCR擴(kuò)增將微滴轉(zhuǎn)移到96孔PCR板上，于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增3PCR熱循環(huán)儀制備微滴將微滴反生卡放入微滴生成器，在2.5分鐘內(nèi)將每個(gè)20ul反應(yīng)液分成20000個(gè)微滴2微滴生成器微滴式數(shù)字PCR的基本流程生成均一化的微滴將含有樣品的預(yù)混液和油加入微滴發(fā)生卡的指定位置，并放入微滴發(fā)生器內(nèi)。每個(gè)樣品可生成20,000個(gè)微滴，8個(gè)樣品大約需2.5分鐘將PCR反應(yīng)板直接放入微滴分析儀，自動(dòng)對(duì)樣品進(jìn)行逐個(gè)分析每個(gè)微滴逐個(gè)通過(guò)檢測(cè)器，每小時(shí)可完成32個(gè)樣品的檢測(cè)快速微滴檢測(cè)數(shù)字化結(jié)果——無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量EverypartitionisanindividualreactionvesselEnd-pointPCRIfapartitionhasatargetmoleculeitwillbereadasapositiveIfapartitionhasnotargetmoleculesitwillbereadas

anegativeInquantitativePCR(qPCR)—timecourse,quantificationcycle(Cq)orthresholdcycle(CT),

standardcurves微滴式數(shù)字PCR提高檢測(cè)靈敏度為什么提高了靈敏度BulkSample–20μL40,000wildtypemolecules40mutantmolecules19,960dropletsw/omutant40dropletsw/mutantPartitionedSample–20,000×1nLMutantabundance0.1%Mutantabundance33%精準(zhǔn)的定量結(jié)果和極佳的重復(fù)性精準(zhǔn)的定量結(jié)果和極佳的重復(fù)性zoominEachdatapoint=metawell1S.aureusdilutions(copies/ul)ConstanthumangDNA(RPP30)88,0002倍梯度稀釋精準(zhǔn)的定量結(jié)果和極佳的重復(fù)性S.aureusdilutions(copies/ul)ConstanthumangDNA(RPP30)zoomedin1.1倍梯度稀釋QX200?微滴式數(shù)字PCR特點(diǎn)絕對(duì)定量，不依賴Ct值，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線

兼容染料法和探針?lè)?，同時(shí)滿足科學(xué)研究和臨床檢測(cè)要求適用復(fù)雜樣品檢測(cè)，不易受PCR擴(kuò)增效率影響超高靈敏度，可檢測(cè)單拷貝模板精準(zhǔn)的定量結(jié)果和極佳的重復(fù)性微滴式數(shù)字PCR應(yīng)用介紹V4.0——稀有事件檢測(cè)（RED）方法：

采用ddPCR雙重檢測(cè)，引物/探針序列與qPCR相同 hmg基因作為野生型玉米內(nèi)參基因

MON810引物探針用于特異性檢測(cè)MON810轉(zhuǎn)基因事件結(jié)論：

ddPCR的線性范圍足夠覆蓋日常的GMO檢測(cè)范圍，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行酶切aLOQ與aLOD方面，ddPCR的結(jié)果優(yōu)于qPCR

與qPCR相比，ddPCR結(jié)果的真實(shí)度更高微滴式數(shù)字PCR用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)ddPCR雙重實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因物質(zhì)的線性范圍涵蓋了實(shí)驗(yàn)室常規(guī)GMO檢測(cè)的所有濃度范圍

(0.1%to100%transgene/endogeneratiocp/cp).ddPCR雙重檢測(cè)MON810/hmg的線性范圍與qPCR用兩個(gè)單重實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的結(jié)果相近，與cdPCR（2－3個(gè)數(shù)量級(jí)）相比線性范圍更廣。.TheddPCRresponseforhmgwaslinearfrom5to118,000hmgcopies(R2=0.9990).TheddPCRresponseforMON810waslinearfrom6to4,340MON810copies(R2=0.9993)微滴式數(shù)字PCR用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)Intra-andinter-cartridgerepeatabilityoftheddPCRwasassessedbytwodifferentoperatorsandovertwodifferentdaysforMON810contentdetermination.Sevenreplicateswereappliedpercartridge.Lessthan10%variabilitywasobservedwithineachofthefivecartridgesforthedeterminationofMON810content.微滴式數(shù)字PCR用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)微滴式數(shù)字PCR用于外周血中基因突變檢測(cè)微滴式數(shù)字PCR用于外周血中基因突變檢測(cè)微滴式數(shù)字PCR應(yīng)用介紹V4.0——拷貝數(shù)變異檢測(cè)（CNV）準(zhǔn)確檢測(cè)MRGPRX1基因拷貝數(shù)ddPCRIndividual

WellsddPCRMergedWells(6wells)MeasureMRGPRX1genecopiesfromvarioussamples56Copynumber123456IncreasedprecisionwithmergedwellsSampleSampleSignificance:Neurologicaldiseaseandfemalefertilityhavebeenlinkedtoastructurallycomplexregionofchromosome17(17q21.31).Problem:17q21.31hasinversionsandCNVsthataredifficulttoevaluateacrosspopulationsbecauseoftechnologicallimitations.NGSisusefulbutveryexpensive.Solution:ddPCRenableseasyvalidationandstudyofCNVsdiscoveredbysequencingfromastructurallycomplexlocusacrosspatientcohorts.NatureGenetics2012ddPCRconfirmsNGSandscreenswithsensitivityforCNV.微滴式數(shù)字PCR用于NGS結(jié)果確認(rèn)Copynumberanalysisof3regionsof17q21.31bywhole-genomesequencing(b–d)and

byddPCR(e–g)Copynumberdeterminationin234samplesbyNGSandddPCRis>99%concordant(h–j)ddPCRprovidesaneasy,inexpensive,andaccuratewaytovalidateandfurtherstudyCNVsdiscoveredbyNGSBoettgerLMetal.(2012).Structuralhaplotypesandrecentevolutionofthehuman17q21.31region.NatGenet

44,881–885.微滴式數(shù)字PCR與NGS結(jié)果高度吻合微滴式數(shù)字PCR用于22q11.2微缺失征檢測(cè)微滴式數(shù)字PCR用于22q11.2微缺失征檢測(cè)微滴式數(shù)字PCR應(yīng)用介紹V4.0——病原微生物檢測(cè)微滴式數(shù)字PCR用于全球首例“功能性治愈”艾滋病嬰兒TheProblem

AninfantwasbornHIVpositivebut2yearslaterhasnodetectablevirusbytraditionalmethodsNeedextremelysensitivequantificationofHIVgenomesinpatientsTheSolutionDevelopanultra-sensitiveHIVgenomedetectionprotocolusingddPCRAllowforconfirmationofastateoffunctionalHIVcureFunctionalHIVCureafterVeryEarlyARTofanInfectedInfantDeborahPersaud*1,HGay2,CZiemniak1,YHChen1,MPiatak3,T-WChun4,MStrain5,DRichman5,andKLuzuriaga61JohnsHopkinsUnivSchofMed,Baltimore,MD,US;2UnivofMississippiMedCtr,Jackson,US;3FrederickNatlLabforCancerRes,MD,US;4NIAID,NIH,Bethesda,MD,US;5UnivofCaliforniaSanDiego,LaJollaandVASanDiegoHlthcareSystem,US;and6UnivofMassachusettsMedSch,Worcester,US微滴式數(shù)字PCR用于全球首例“功能性治愈”艾滋病嬰兒ApproachInfantinfectionconfirmedbypositiveHIVDNA/RNAtestingon2nddayoflifePlasmaviralloadtestspositiveondaysoflife7,12,20Reachedundetectablelevelsatage29daysUltrasensitiveHIVDNA(dropletdigitalPCR),plasmaviralload(singlecopy)assays,andquantitativeco-cultureassaysweredoneatage24and26monthstoassessHIVpersistenceAgeHIVDNAdetectedbyddPCRReplication-competentvi