高效液相色譜法分析芳香類化合物

高效液相色譜法分析芳香類化合物一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解高效液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)、原理及操作。2、了解色譜分離的基本原理，反相分配色譜的基本規(guī)律。3、掌握色譜的基本定性、歸一化法定量方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：以液體為流動(dòng)相的色譜稱為液相色譜，根據(jù)在兩相分離過程的物理化學(xué)原理不同可分為吸附色譜、分配色譜、凝膠色譜、離子色譜、親和色譜等。本實(shí)驗(yàn)主要是分配色譜。分配色譜即液液色譜，是基于樣品分子在包覆于惰性載體上的固定相液體和流動(dòng)相液體之間根據(jù)樣品分配系數(shù)不同達(dá)到分配平衡。反相分配色譜即流動(dòng)相極性比固定相大。反相分配色譜用的是非極性填料分析柱（如ODS-C18），流動(dòng)相是極性較強(qiáng)溶液（如甲醇和水）。色譜條件主要包括色譜柱、流動(dòng)相組成與流速、色譜柱恒溫箱溫度，檢測(cè)波長(zhǎng)等。芳香族化合物含有共軛雙鍵，對(duì)220nm,254nm的紫外光有較強(qiáng)的吸收，可通過分配色譜分離檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)采用反相HPLC檢測(cè)。三、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：實(shí)驗(yàn)儀器：Agilent1100型液相色譜儀：真空在線脫氣裝置、四元梯度泵、多波長(zhǎng)檢測(cè)器。

ODS-C18柱試劑：甲醇（色譜純），水（超純水），苯、萘、菲的甲醇溶液，苯、萘、菲的混合液。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、確定實(shí)驗(yàn)條件打開計(jì)算機(jī)，等啟動(dòng)完畢后依次打開輸液泵、真空在線脫氣裝置、柱溫箱、檢測(cè)器開關(guān)。（實(shí)驗(yàn)前已操作）通訊完畢后，設(shè)定操作條件。流動(dòng)相：甲醇/水=80/20；總流速0.500ml/min，設(shè)定在220nm，254nm兩個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)30℃。2、定性分析流動(dòng)相比例設(shè)為甲醇/水=80/20，等基線平穩(wěn)后依次將苯、萘、菲的甲醇溶液進(jìn)樣5μL，得出三種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間。將三種物質(zhì)的混合溶液進(jìn)樣5μL同樣實(shí)驗(yàn)條件下比較各峰的保留時(shí)間。3、定量分析（面積歸一化法）將上述混合液的定性譜圖對(duì)應(yīng)物質(zhì)的3個(gè)峰面積積分校正因子校正后歸一化計(jì)算（254nm）。4、流動(dòng)相組成對(duì)混合樣保留時(shí)間的影響梯度條件1：時(shí)間/min函數(shù)函數(shù)0更改溶劑組分溶劑組分A：80.0%B:20.0%4更改溶劑組分溶劑組分A：90.0%B：10.0%5更改溶劑組分溶劑組分A：100.0%B：0.0%

設(shè)定開始時(shí)流動(dòng)相甲醇：水=80:20，平衡至基線穩(wěn)定后開始進(jìn)樣，完成一次梯度洗脫后，用甲醇：水=80:20的流動(dòng)相平衡約10min，開始第二次梯度洗脫。梯度條件2：時(shí)間/min函數(shù)函數(shù)0更改溶劑組分溶劑組分A：80.0%B:20.0%3更改溶劑組分溶劑組分A：90.0%B：10.0%4更改溶劑組分溶劑組分A：100.0%B：0.0%

5、關(guān)機(jī)用純甲醇沖色譜柱約半小時(shí)，基線平穩(wěn)后在工作站上關(guān)閉輸液泵、柱溫箱、檢測(cè)器，然后關(guān)閉工作站，依次關(guān)閉儀器上檢測(cè)器、柱溫箱、輸液泵的電源開關(guān)。關(guān)閉計(jì)算機(jī)。五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析:表三：苯萘菲校正因子

苯萘菲校正因子1.000.080.01

1、定性分析：根據(jù)實(shí)驗(yàn)可得在一定實(shí)驗(yàn)條件下（如實(shí)驗(yàn)步驟設(shè)定），220nm，254nm下苯、萘、菲的保留時(shí)間如下：表四：實(shí)驗(yàn)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間

苯/min萘/min菲/min220nm4.6075.7287.528254nm4.6065.7277.528

由實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)可看出，同種物質(zhì)在不同實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)下的保留時(shí)間基本保持不變，即物質(zhì)的保留時(shí)間與實(shí)驗(yàn)發(fā)射波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。（1）影響保留時(shí)間的主要因素有色譜柱規(guī)格、柱溫，流動(dòng)相組成、流速，進(jìn)樣器到色譜柱間管線的規(guī)格等，同一種物質(zhì)在相同實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)得保留時(shí)間與發(fā)射波長(zhǎng)無(wú)關(guān)，發(fā)射波長(zhǎng)只影響物質(zhì)出峰的強(qiáng)度。（2）由于反相分配色譜中流動(dòng)相極性比固定相大，故極性大的溶質(zhì)易被洗脫，故極性大的溶質(zhì)保留時(shí)間較短，故實(shí)驗(yàn)中三種物質(zhì)的極性苯>萘>菲三種物質(zhì)的混合物在同樣實(shí)驗(yàn)條件下三個(gè)峰的保留時(shí)間為：表五：混合物各峰保留時(shí)間

123220nm4.6065.7327.524254nm4.6065.7337.524

由實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定性保留時(shí)間測(cè)定數(shù)據(jù)可看出，1、2、3三種物質(zhì)分別對(duì)應(yīng)苯、萘、菲，不同實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)下同種物質(zhì)的保留時(shí)間相同，但混合物中物質(zhì)的保留時(shí)間與純物質(zhì)中保留時(shí)間略有差異，說(shuō)明其他同類型物質(zhì)會(huì)對(duì)物質(zhì)保留時(shí)間有影響。（混合物中其他物質(zhì)的存在可視為溶劑組分不同，溶劑的極性改變導(dǎo)致物質(zhì)的保留時(shí)間有所改變）2、定量分析（254nm）：由上述混合物定性分析實(shí)驗(yàn)中可得，4.606min即苯峰的積分面積為237.380mAu*s,5.733min即萘峰的積分面積為702.335mAu*s,7.524min即菲峰的積分面積為866.522.進(jìn)行面積歸一化，Wi=fiAi/ΣfiAi*100%由于還有未知雜質(zhì)物質(zhì)存在，不能確定計(jì)算各物質(zhì)在實(shí)驗(yàn)體系中得質(zhì)量分?jǐn)?shù)，故混合物中三種物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為m苯：m萘：m菲=(1.00*237.380)：(0.08*702.335)：（0.01*866.522）=273.380:56.187:8.665≈32:7:13、流動(dòng)相組成對(duì)混合樣保留時(shí)間的影響（254nm）表六：梯度洗脫樣品保留時(shí)間

1/min2/min3/min梯度條件14.6095.6156.819梯度條件24.6065.5766.666代表物質(zhì)苯萘菲

由實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)可看出不同梯度條件下，同種物質(zhì)的保留時(shí)間發(fā)生改變，在知道混合物大致組成及各物質(zhì)的保留時(shí)間下，根據(jù)物質(zhì)極性改變梯度條件可有效縮短試驗(yàn)時(shí)間及提高分離能力。實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相隨甲醇含量的增加，極性減小，兩個(gè)梯度條件下，流動(dòng)相極性減小越快，需要洗脫時(shí)間越短。六、思考題：1、反相色譜的基本規(guī)律是什么，為什么會(huì)有這樣的規(guī)律？答：反相色譜的基本規(guī)律：待測(cè)樣品中極性大的組分先被洗脫，即極性大的組分保留時(shí)間較短。原因：反相色譜流動(dòng)相極性比固定相極性大，根據(jù)相似相容原理極性大的組分會(huì)先溶解到流動(dòng)相中，極性小的后溶解流動(dòng)相中，故極性大的先被檢測(cè)出，極性小的后被檢測(cè)出，保留時(shí)間大。2、反相色譜中流動(dòng)相的組成對(duì)保留時(shí)間的影響如何？答：反相色譜主要分離非極性樣品，極性強(qiáng)的先出柱，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑所占比例越大，（即極性越?。矢鶕?jù)相似相容原理樣品在流動(dòng)相中分配系數(shù)增大，故洗脫速率越大，保留時(shí)間越短。3、在什么條件下可以用面積歸一法作定量分析？有何優(yōu)缺點(diǎn)？答：條件：樣品中所有物質(zhì)均能被檢測(cè)出，且所有物質(zhì)均能進(jìn)行歸屬即每種組分均能分辨均能確定修正因子。優(yōu)點(diǎn)：計(jì)算簡(jiǎn)單、定量結(jié)果與進(jìn)樣量無(wú)關(guān)，操作條件不需嚴(yán)格控制。缺點(diǎn)：不管試樣中