DNA的復(fù)制突變損傷和修復(fù)課件

第四章DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)顧玉超海洋館229;82032067guycQQ:12237963674-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)遺傳變異種瓜得瓜，種豆得豆一龍生九子，九子各不同核酸是遺傳物質(zhì)

遺傳和變異的機(jī)制？

DNA復(fù)制DNA突變DNA修復(fù)4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)第一節(jié)DNA的復(fù)制4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)新鏈如何延伸？DNA復(fù)制遇到的問題“老鼠啃天”—如何起始復(fù)制?DNA復(fù)制合適終止？不同生物DNA復(fù)制是否相同？?jī)蓷l模板鏈如何分配？DNA復(fù)制的分子基礎(chǔ)是？4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)內(nèi)容一、DNA復(fù)制的一般特征二、原核生物的DNA復(fù)制三、真核生物的DNA復(fù)制四、逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA復(fù)制4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)一、DNA復(fù)制的一般特征（一）半保留復(fù)制、復(fù)制起點(diǎn)、復(fù)制子、復(fù)制叉、復(fù)制方向、復(fù)制終點(diǎn)（二）DNA復(fù)制的酶系（三）DNA復(fù)制的過程4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)（一）半保留復(fù)制、復(fù)制起點(diǎn)、復(fù)制子、復(fù)制叉、復(fù)制方向、復(fù)制終點(diǎn)復(fù)制可能的幾種方式舊鏈與新鏈如何分配？4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)密度梯度實(shí)驗(yàn)

1957,MeselsonandStahl含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液第二代梯度離心結(jié)果4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)

當(dāng)DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開成兩條單鏈，各自作為模板合成與之互補(bǔ)的新鏈。在子代DNA雙鏈中，一條是來自于親代，另一條完全重新合成。（掌握）這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制

1.半保留復(fù)制（semiconservativereplication）4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)2.復(fù)制起點(diǎn)（Originofreplication）大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)DNA復(fù)制開始時(shí)，總是從某一特定的位置起始，幾十到幾百個(gè)bp，富含AT。用ori或O表示4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)3、復(fù)制子（replicon）從復(fù)制起點(diǎn)至臨近的兩個(gè)復(fù)制終點(diǎn)之間的DNA序列；DNA分子中能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的最小功能單位。原核生物和病毒DNA只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，真核生物則含有多個(gè)復(fù)制子；作為含有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)的獨(dú)立復(fù)制單元的一個(gè)完整DNA分子或DNA分子上的某段區(qū)域。

4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)4、復(fù)制叉（replicationfork）DNA分子復(fù)制時(shí)兩條鏈解開成單鏈狀態(tài)，分別作為模板各自合成其互補(bǔ)鏈，這種Y型的結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。（掌握）4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)（1）雙向復(fù)制：大多數(shù)原核和真核生物是雙向等速方式復(fù)制。（一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)局部解鏈后會(huì)形成兩個(gè)復(fù)制叉，向相反方向同時(shí)復(fù)制）（2）單向復(fù)制：如質(zhì)粒ColE1。（一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)局部解鏈后只形成一個(gè)復(fù)制叉，向一個(gè)方向復(fù)制）5、復(fù)制方向4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)6、復(fù)制終點(diǎn)DNA上特定序列，DNA的復(fù)制在此終止。有的環(huán)狀DNA沒有特定的復(fù)制終點(diǎn)（如噬菌體）。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)底物（substrate)

:dATP，dGTP，dCTP，dTTP；

聚合酶(polymerase):依賴DNA的DNA聚合酶；

模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈；

引物(primer):

一小段RNA；

其他的酶和蛋白質(zhì)因子在研究復(fù)制時(shí)，將與復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)命名為：DnaA,DnaB,DnaC,‥‥‥DnaX將相關(guān)的基因命名為：dnaA,dnaB,dnaC,‥‥‥dnaX7、參與DNA復(fù)制的物質(zhì)4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)1、解旋酶（大腸桿菌DnaB）通過水解ATP釋放出的能力來解開復(fù)制叉處的DNA雙鏈。2、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）選擇性結(jié)合于單鏈DNA，防止重新締合成雙鏈以及被酶解。大腸桿菌的SSB有協(xié)同作用，真核生物的SSB則沒有。3、引物酶合成RNA引物，起始一條新DNA鏈的合成。4、DNA聚合酶分別以兩條單鏈DNA為模板，合成新的DNA鏈。5、DNA連接酶封閉兩個(gè)崗崎片段之間的切口。6、DNA旋轉(zhuǎn)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶II）引入負(fù)超螺旋，解決由于復(fù)制引起的超纏現(xiàn)象。（二）DNA復(fù)制的酶系4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)1、DNA聚合酶(dNMP)n+dNTP

(dNMP)

n+1+ppi1、聚合反應(yīng)具有方向性:5

3

2、DNA聚合酶不能催化兩個(gè)游離的脫氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的3-OH逐個(gè)添加脫氧核苷酸，使核苷酸鏈不斷延長(zhǎng)。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)DNA聚合酶一般具有多種活性：DNA聚合酶活性；

5核酸外切酶活性；5核酸外切酶活性。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)原核生物的DNA聚合酶polI：多肽，多功能，對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。polII：次要的DNA修復(fù)酶polIII：十個(gè)亞基，DNA復(fù)制中主要的酶4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)DNA聚合酶活性、

5核酸外切酶活性、

5核酸外切酶活性DNApolI4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段

/

Klenow

片段

604個(gè)氨基酸

DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNApolI4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)SubunitkDaGeneSubassemblya130dnaE|5'-3'

polymerasee27.5dnaQ(mutD)|

POL

IIICORE3'-5'exonucleaseq10|t71dnaXg47.5dnaX|d35|ATPdependentd'33|

g

COMPLEXclamploaderc15|y12|b40.6dnaN

b

CLAMPprocessivityfactorDNApolIII4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)真核生物的DNA聚合酶pol

合成RNA引物在復(fù)制延長(zhǎng)中起催化作用在沒有其他DNA-pol時(shí)才發(fā)揮催化作用在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用pol

pol

pol

pol

4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)先導(dǎo)鏈(leadingstrand)

順著解鏈方向生成的子鏈，其復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，所得到一條連續(xù)片段的子鏈。5’3’3

5

3

5

解鏈方向

（三）復(fù)制的半不連續(xù)性4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)3

5

3

5

解鏈方向復(fù)制方向與解鏈方向相反，須等待解開足夠長(zhǎng)度的模板鏈才能繼續(xù)復(fù)制，所得到一條由不連續(xù)片段組成的子鏈。后滯鏈(laggingstrand)

岡崎片段（Okazakifragment）

3’5’3’3’5’Okazakifragment4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)5`5`5`RNA酶OHP5`DNA聚合酶dNTP5`5`PATPADP+Pi5`5`DNA連接酶后滯鏈上不連續(xù)性片段的連接4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)二、原核生物的DNA復(fù)制（一）復(fù)制的起始1、復(fù)制原點(diǎn)（1）富含AT；（2）含有多個(gè)回文序列，有11個(gè)GATC，其中8個(gè)GATC保守，A發(fā)生甲基化；（3）具有R1、R2、R3、R4四個(gè)重復(fù)序列，作為蛋白結(jié)合位點(diǎn)；（4）上述重復(fù)序列右側(cè)緊鄰著兩個(gè)啟動(dòng)子。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)OriCinE.colichromosomalDNA4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶OHSSB3

5

3

5

2、大腸桿菌DNA復(fù)制的起始起始復(fù)合體（引發(fā)體）：DnaA、DnaB、DnaC、組蛋白樣蛋白HU、旋轉(zhuǎn)酶、SSB引發(fā)體結(jié)合于OriC，另外還需要引物酶DnaG的參與4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)InitiationofDNAreplicationinE.coli4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)二、復(fù)制的延伸二者同時(shí)復(fù)制，相差一個(gè)崗崎片段先導(dǎo)鏈：引物酶，polIII后滯鏈：引物酶，polIII，polI，DNA連接酶4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)（三）復(fù)制的終止Ter位點(diǎn)結(jié)合有Tus蛋白，阻止復(fù)制叉的移動(dòng)。此時(shí)形成兩個(gè)纏繞的子代DNA分子，稱為子代二價(jià)體。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)子代二價(jià)體可以先由拓?fù)洚悩?gòu)酶I在親本鏈上打開一個(gè)切口，使兩個(gè)子代DNA分子解套分離，然后由polI修復(fù)，DNA連接酶封閉切口。子代二價(jià)體還可以先由由polI修復(fù)，DNA連接酶封閉切口，再由拓?fù)洚悩?gòu)酶II在雙鏈上打開，使兩個(gè)子代DNA分子解套分離。復(fù)制叉2完成復(fù)制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II連鎖染色體復(fù)制叉14-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)三、真核生物的DNA復(fù)制4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)復(fù)制起點(diǎn)1、猴病毒SV40的復(fù)制起點(diǎn)，64bp四個(gè)GAGGC，大T抗原的結(jié)合位點(diǎn)一個(gè)15bp的回文序列，一個(gè)17bp的全部是AT的序列大T抗原具有螺旋酶活性，可解開雙鏈2、酵母的復(fù)制起點(diǎn)，11bp(A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T)4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)多復(fù)制起點(diǎn)4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)（一）復(fù)制的起始DNA螺旋酶、單鏈結(jié)合蛋白、復(fù)制蛋白R(shí)PA，pol（引物）（二）DNA的延伸先導(dǎo)鏈和后滯鏈都由pol合成，增殖細(xì)胞核抗原PCNA可以象夾子一樣將pol固定到模板上，提高其結(jié)合力40倍。pol具有填補(bǔ)缺口作用。DNA連接酶（三）復(fù)制的終止5’末端隱縮問題！端粒telomere3‘5‘5‘3‘4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)端粒真核細(xì)胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，由簡(jiǎn)單的不含遺傳信息的重復(fù)序列組成，形成反折式的二級(jí)結(jié)構(gòu)，且含G的鏈總是3’端突出。Group Organism Telomericrepeat(5'to3'towardtheend)Vertebrates Human,mouse,Xenopus TTAGGGFilamentousfungi Neurospora TTAGGGSlimemolds Physarum,Didymium TTAGGG Dictyostelium AG(1-8)Ciliatedprotozoa Tetrahymena,Glaucoma TTGGGG Paramecium TTGGG(T/G) Oxytricha,Stylonychia, TTTTGGGG Euplotes Fissionyeasts

Schizosaccharomycespombe TTAC(A)(C)G(1-8)Buddingyeasts Saccharomycescerevisiae TGTGGGTGTGGTG4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)端粒的功能：完成染色體末端的復(fù)制，防止染色體DNA降解、末端融合、缺失和非正常重組而影響細(xì)胞分裂，維持染色體的穩(wěn)定完整。端粒由端粒酶催化產(chǎn)生，端粒酶是由RNA和逆轉(zhuǎn)錄酶組成，在生殖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中有活性，在正常體細(xì)胞中無活性。細(xì)胞每分裂1次，端?？s短50－200bp。老年人的端粒長(zhǎng)度短于青年人。當(dāng)端粒長(zhǎng)度不再縮短時(shí)，細(xì)胞停止分裂，轉(zhuǎn)為衰亡。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)TelomeraseisareversetranscriptasetogetherwithatemplateRNAItisactiveingermcells,notinsomaticcells,andisactivatedincancers4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)端粒酶與抗腫瘤藥物：（1）反義核酸：結(jié)合端粒酶中的RNA，使端粒不能延長(zhǎng)。（2）核酶：降解端粒酶中的RNA，使端粒不能延長(zhǎng)。（3）逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：如3’－疊氮胸苷AZT（4）端粒酶蛋白抗體4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)RNA衣殼被膜逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯整合入宿主細(xì)胞染色體DNA進(jìn)入細(xì)胞丟失被膜丟失衣殼逆轉(zhuǎn)錄RNARNAcDNA衣殼蛋白被膜蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶四、逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)逆轉(zhuǎn)錄酶：RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性

DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性

RNaseH活性（可水解DNA-RNA雜合分子中的RNA）4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)病毒RNA的PBS序列與宿主tRNA互補(bǔ)形成局部雙鏈；以tRNA的3’OH為引物合成DNA－鏈（負(fù)鏈、反義鏈）的5’端；

RNaseH水解雜合雙鏈中的病毒RNA5’端R序列和U5序列；新合成的DNA－鏈通過R序列，從模板RNA的5’端跳到3’端；

DNA－鏈向模板RNA的5’端延伸負(fù)鏈的合成：4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)

RNaseH去除雜合雙鏈中的絕大多數(shù)RNA；

剩余的一段RNA作為引物合成DNA＋鏈的3’端；

RNaseH去除RNA引物和tRNA；DNA＋鏈從DNA－鏈的5’端跳到3’端，以PBS序列互補(bǔ)配對(duì)；延伸，完成DNA雙鏈合成正鏈的合成：4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)病毒DNA雙鏈分子通過病毒編碼的整合酶整合到宿主DNA中。宿主DNA序列中插入的這段病毒DNA稱為原病毒或前病毒。原病毒DNA利用宿主的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生大量的病毒RNA和病毒蛋白，經(jīng)過包裝形成新的病毒顆粒。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因產(chǎn)物可以致癌；艾滋病是由HIV（一種逆轉(zhuǎn)錄病毒）引起的。癌基因（轉(zhuǎn)化基因）：人類或其他動(dòng)物基因組中含有的一類基因，被激活后能導(dǎo)致正常細(xì)胞發(fā)生癌變。原癌基因：未活化的癌基因。細(xì)胞癌基因：人和動(dòng)物細(xì)胞基因組上存在的癌基因。病毒癌基因：病毒基因組中的癌基因的同源序列。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)抗艾滋病藥物1、抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活性

核苷類似物：3’疊氮脫氧胸苷AZT，雙脫氧肌苷ddI，雙脫氧胞苷ddC苯二氮雜卓，二吡啶并二氮哌酮，二異芳香基哌秦2、抑制HIV其他蛋白或酶，如Tat蛋白、蛋白酶等3、？？？4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)DNA的體外復(fù)制－PCR標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：10×擴(kuò)增緩沖液1ul

4種dNTP混合物200umol/L

引物各1～10pmol

模板DNA10～200ng

TaqDNA聚合酶0.25u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至10ul

在加熱至90℃以上的PCR儀中預(yù)變性94℃2分鐘,然后循環(huán):94℃1分鐘，50℃1分鐘，72℃1.5分鐘，共30輪循環(huán)。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)思考題是否可以用E.coli的DNApolI進(jìn)行體外的DNA末端標(biāo)記？為什么？如果不可以的話可以選擇哪個(gè)你學(xué)過的酶？4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)第二節(jié)基因突變一、突變的概念和類型二、突變的原因三、突變體的分離與分析4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)一、突變的概念和類型（一）概念突變mutation－－遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）發(fā)生可遺傳的永久性的改變，包括染色體數(shù)目變異、染色體結(jié)構(gòu)變異、基因突變。自發(fā)突變spontaneousmutation－－自然發(fā)生的突變，無論是因?yàn)閺?fù)制錯(cuò)誤還是自然界中的突變劑作用的結(jié)果。頻率較低，高等生物為10-5－10-8，低等生物為10-4－10-10。誘發(fā)突變inducedmutation－－人們使用一些物理因素或化學(xué)試劑引起的突變。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)突變劑mutagen－－引起突變的物理因素或化學(xué)試劑。突變生成作用mutagenesis－－由于突變劑的作用而產(chǎn)生突變的過程或作用。突變基因mutantgene－－帶有突變位點(diǎn)的基因。野生型基因widetypegene－－沒有發(fā)生突變的基因。突變體mutant－－帶有突變基因的生物個(gè)體或群體。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)1、根據(jù)使DNA堿基序列發(fā)生的變化：（1）點(diǎn)突變－－DNA上某些堿基對(duì)發(fā)生改變，可引起堿基替代。（單點(diǎn)突變、多點(diǎn)突變）

轉(zhuǎn)換－－不同嘌呤(A,G)或不同嘧啶(C,T)之間的轉(zhuǎn)變。

顛換－－嘌呤和嘧啶之間的轉(zhuǎn)變。（2）堿基插入－－某些堿基序列的增加。（3）堿基缺失－－某些堿基序列的缺失。（4）移框突變－－改變基因的讀碼框架的突變，如插入或缺失n+1或n+2個(gè)堿基。（二）基因突變的類型4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)2、根據(jù)對(duì)遺傳信息的改變（1）同義突變synonymousmutation或沉默突變silentmutation：沒有改變蛋白質(zhì)氨基酸序列的基因突變。密碼子的簡(jiǎn)并性：AAA、AAG，都是Lys（2）錯(cuò)義突變missensemutation引起了蛋白質(zhì)氨基酸序列變化的基因突變。（3）無義突變nonsensemutation使某個(gè)氨基酸的密碼子變成終止密碼子的基因突變。（4）中性突變neutralmutation－－蛋白質(zhì)活性不受影響。（5）滲漏突變leakymutation－－蛋白質(zhì)活性部分喪失。也可能蛋白質(zhì)活性完全喪失。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)3、根據(jù)突變是否背離野生型：（1）正向突變forwardmutation改變了野生型性狀的突變。（2）回復(fù)突變backmutation或反向突變r(jià)eversemutation使突變體所改變的野生型性狀回復(fù)的突變。真正的原位回復(fù)突變很少，大多是原來的突變位點(diǎn)依然存在，而它的表現(xiàn)型被第二位點(diǎn)的突變所抑制，因此又稱抑制突變suppressormutation。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)二、突變的原因（一）自發(fā)突變1、DNA復(fù)制錯(cuò)誤復(fù)制時(shí)形成了不正確的堿基配對(duì)，沒有被清除被當(dāng)作模板進(jìn)行下一輪復(fù)制。2、堿基本身存在互變異構(gòu)體，可能形成錯(cuò)誤的堿基配對(duì)。如胞嘧啶可由氨基轉(zhuǎn)變?yōu)閬啺被膳cA配對(duì)。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)3、自發(fā)的化學(xué)變化（1）脫嘌呤作用：當(dāng)嘌呤從脫氧核糖上脫落后，DNA聚合酶在合成互補(bǔ)鏈時(shí)可隨機(jī)選擇一個(gè)堿基進(jìn)行延伸。一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞在37℃條件下，20小時(shí)內(nèi)通過自發(fā)水解可從DNA鏈上脫落約10000個(gè)嘌呤堿和500個(gè)嘧啶堿。在一個(gè)長(zhǎng)壽命的非復(fù)制的哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如人的神經(jīng)細(xì)胞）的整個(gè)生活中自發(fā)脫嘌呤數(shù)約為108個(gè)嘌呤堿，它們占細(xì)胞DNA中總嘌呤數(shù)的3%。每個(gè)細(xì)胞每小時(shí)脫去的嘌呤堿和嘧啶堿分別約為580個(gè)和29個(gè)。自發(fā)脫嘧啶反應(yīng)一般頻率很低。（2）脫氨基作用：堿基的氨基被脫去。如胞嘧啶有一氨基易被氧化成羰基，變成尿嘧啶。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)4、氧化作用損傷堿基細(xì)胞代謝產(chǎn)生的一些活性氧基團(tuán)，如過氧化物、過氧化氫、羥基等，可使堿基氧化，導(dǎo)致配對(duì)發(fā)生變化。Oxidationproducts4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)（二）誘發(fā)突變1、物理因素（1）紫外線：嘌呤和嘧啶的雜環(huán)有很強(qiáng)的吸收254－160nm紫外線的能力，主要引起同一條DNA鏈上相鄰的兩個(gè)嘧啶共價(jià)連接，形成嘧啶二聚體，造成雙螺旋變形，從而阻斷轉(zhuǎn)錄并暫時(shí)阻止DNA復(fù)制，引起細(xì)胞死亡。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)（2）離子化射線：

X射線、射線、射線、射線、宇宙射線等，產(chǎn)生具有高度反應(yīng)性的離子（自由基），與DNA反應(yīng)，造成損傷，如單鏈斷裂、雙鏈解開、堿基改變等。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)2、化學(xué)試劑（1）堿基類似物能產(chǎn)生兩種互變異構(gòu)體，配對(duì)方式不同，導(dǎo)致突變。5-溴尿嘧啶（5-BU）：酮式（常見），與A配對(duì)烯醇式（少見），與G配對(duì)氨基嘌呤（2-AP）：正常（常見），與T配對(duì)亞胺（少見），與C配對(duì)5-BrU:G:AenolformBrOHHOBrKetoformHO4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)（2）堿基的修飾劑

亞硝酸：氧化脫氨成酮基

Gto黃嘌呤X，仍與C配對(duì)

Ato次黃嘌呤H，與C配對(duì)

CtoU，與A配對(duì)4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)烷化劑：甲基磺酸乙酯EMS，亞硝酸胍NG等，使堿基烷基化，主要發(fā)生在G的N7和A的N3，有時(shí)也發(fā)生在A的N7。導(dǎo)致兩個(gè)效應(yīng)：一是G烷基化后與T配對(duì)，二是發(fā)生脫嘌呤作用。乙基亞硝基脲甲基甲烷磺酸鹽4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)（3）DNA插入劑：原黃素、吖啶橙、溴化乙啶等，平面的化合物，直徑大致等于嘌呤和嘧啶堿基對(duì)之間的距離，可插入兩對(duì)相鄰的堿基對(duì)之間。當(dāng)復(fù)制時(shí)，隨機(jī)插入或減少一個(gè)堿基，造成移框突變。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)三、突變體的分離與分析（一）突變體的分離原核生物、單倍體真核生物：表型變化雙倍體真核生物：雜交、自交、回交等遺傳學(xué)手段（二）突變體的分析1、細(xì)胞水平：染色體帶型分析互補(bǔ)分析2、分子水平：限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合單鏈構(gòu)象多態(tài)性

DNA測(cè)序4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)第三節(jié)DNA的修復(fù)一、復(fù)制修復(fù)二、損傷修復(fù)三、復(fù)制后修復(fù)（也屬于損傷修復(fù)）四、限制與修飾4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)一、復(fù)制修復(fù)1、尿嘧啶糖基酶系統(tǒng)dUTP摻入DNA中；胞嘧啶脫氨氧化成為尿嘧啶。難以被校正系統(tǒng)識(shí)別修復(fù)過程：尿嘧啶糖基酶從糖－磷酸骨架上切除U；無嘌呤內(nèi)切核酸酶（AP內(nèi)切酶）切斷無堿基核糖的5’-磷酸參與的磷酸二酯鍵；polI從游離的3’-羥基開始合成，切刻平移幾個(gè)核苷酸；DNA連接酶封閉切口。5‘GTAUGGAT3’3‘CATGCCTA5’4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)2、錯(cuò)配修復(fù)（E.coli）復(fù)制錯(cuò)配率10-5，校正99%，錯(cuò)配修復(fù)0.999%，最后突變率10-10。錯(cuò)配修復(fù)也可以修復(fù)小片段DNA的插入或缺失引起的突變。GAATCGCCTTATCG如何識(shí)別哪條鏈上的堿基是錯(cuò)配的？DNA上每隔250bp就有一個(gè)GATC，其中A被dam甲基化酶甲基化，新合成的鏈上甲基化程度低。修復(fù)過程：mutS蛋白識(shí)別錯(cuò)配的堿基，并吸引mutL蛋白結(jié)合到錯(cuò)配位置，mutL蛋白激活mutH蛋白，在新合成的鏈上向5’方向?qū)ふ褿ATC，并在GATC的5’端切斷；由5’3’外切酶切除這段含有錯(cuò)配堿基的DNA，約1kb；polI填補(bǔ)缺口；DNA連接酶封閉切口；dam甲基化酶將新合成鏈上的GATC中的A甲基化。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)3、無嘌呤修復(fù)脫氧核糖與堿基之間的糖苷鍵穩(wěn)定性低，易自發(fā)脫去堿基，其中去嘌呤速度比去嘧啶快20倍。無嘌呤內(nèi)切核酸酶（AP內(nèi)切酶）切斷無堿基核糖的5’-磷酸參與的磷酸二酯鍵；polI從游離的3’-羥基開始合成，切刻平移幾個(gè)核苷酸；DNA連接酶封閉切口。與尿嘧啶糖基酶系統(tǒng)比較4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)二、損傷修復(fù)1、光復(fù)活光復(fù)活酶，35KDa，在幾乎所有細(xì)胞中都存在。光復(fù)活酶在暗處與胸腺嘧啶二聚體結(jié)合，然后被可見光(藍(lán)光)激活，切斷環(huán)丁基環(huán)，使胸腺嘧啶二聚體恢復(fù)到正常的兩個(gè)胸腺嘧啶單體，最后光復(fù)活酶從DNA上解離。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)2、甲基轉(zhuǎn)移酶如O6-甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)3、切除修復(fù)UvrABC識(shí)別DNA損傷引起的DNA雙鏈的變形；在損傷兩側(cè)的糖－磷酸骨架上分別作一切口。原核生物中是從損傷5’端7個(gè)核苷酸到3’端3－4個(gè)核苷酸，真核生物中是從損傷5’端24個(gè)核苷酸到3’端5個(gè)核苷酸；DNA聚合酶從3’-OH開始合成，并置換這一區(qū)域；DNA連接酶封閉切口。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)三、復(fù)制后修復(fù)1、重組修復(fù)DNA復(fù)制時(shí)，DNA聚合酶到達(dá)一個(gè)損傷位置，暫時(shí)停止。等待很短的時(shí)間后，DNA聚合酶跳過損傷部位，DNA合成重新開始，這樣在一條子代鏈上有一個(gè)缺口。另一條母鏈上的一段同源序列重組到缺損的子代鏈上，導(dǎo)致子代鏈完整，而兩條母鏈一條有損傷，一條有缺口。新產(chǎn)生缺口的母鏈由polI修復(fù)，而最初的受損母鏈則保留其損傷。受損的母鏈經(jīng)多次復(fù)制后被稀釋。RecA，RecBCD4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)2、SOS修復(fù)當(dāng)細(xì)菌DNA受損嚴(yán)重時(shí)被激活，降低復(fù)制的忠實(shí)性，跳過受損部位繼續(xù)合成，加入的核苷酸經(jīng)常是錯(cuò)誤的。最終形成的子代DNA通常是有缺陷的，有時(shí)甚至是沒有功能的。好死不如賴活著！細(xì)菌中存在，而真核生物中不存在。Why?4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)四、限制與修飾細(xì)菌為了保護(hù)自己的DNA的完整性，進(jìn)化出一套限制－修飾系統(tǒng)，阻止外來DNA的入侵。限制性內(nèi)切酶將外來的DNA切斷，而修飾酶則把自身的DNA甲基化（N6-甲基腺嘌呤和5-甲基胞嘧啶），使得自身限制性內(nèi)切酶無法切割。4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)（一）定義限制酶（restrictionendonuclease,restrctionenzymes）是一類專門切割DNA的酶，它們能特異結(jié)合一段被稱為限制酶識(shí)別順序的特殊DNA序列，并切割dsDNA。

(二）分類限制酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的。所有的限制酶可分成3類。

限制性核酸內(nèi)切酶4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)三類限制性核酸內(nèi)切酶性質(zhì)比較性質(zhì)第一類第二類第三類限制-修飾活性多功能酶限制酶與修飾酶分開多功能酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)三種不同亞基單一蛋白兩種不同亞基輔助因子Mg2+、ATP、SAMMg2+Mg2+、ATP、（SAM*）識(shí)別位點(diǎn)二分非對(duì)稱序列4-6bp，大多為回文序列5-7bp，非對(duì)稱序列切割位點(diǎn)非特定，離識(shí)別位點(diǎn)1Kb特定，在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)

特定，離識(shí)別位點(diǎn)24-26bp*SAM（S-腺苷甲硫氨酸）對(duì)酶有激活作用，但非必需4-DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)（三）命名（1973年SmithandNathane,1980Robers）

屬名+種名+株名+流水號(hào)

E

coRI第一個(gè)字母大寫、斜體該微生物屬名的第一個(gè)字母第二、三個(gè)字母小寫、斜體該微生物種名的前兩個(gè)字母第四個(gè)字母大寫該微生物株名的第一個(gè)字母羅馬字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ從一種微生