藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)

關(guān)于藥物研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)生物藥物制造的生物化學(xué)基礎(chǔ)一、生物藥物制備方法的特點（1）目的物存在于組成非常復(fù)雜的生物材料中（2）目的物在生物材料中含量極微（3）生物活性成分離開生物體后，易變性破壞（4）生物藥物制造工藝設(shè)計理論性不強（5）生物制藥工藝多采用“逐級分離”法（6）生物藥物的均一性檢測與化學(xué)上純度概念不完全相同。第2頁,共69頁，星期六，2024年，5月生物藥物分離的主要原理：1.根據(jù)不同組分分配率的差別進行分離

萃取分配層析吸附層析鹽析結(jié)晶第3頁,共69頁，星期六，2024年，5月2.根據(jù)生物大分子的特性①根據(jù)分子形狀和分子大小不同：差速離心、超離心、膜分離透析、超濾、凝膠過濾②根據(jù)分子電離性質(zhì)（帶電性）不同：離子交換法、電泳法、等電聚焦法③根據(jù)分子極性大小與溶解度不同：溶液提取法、逆流分配法、分配層析法、鹽析法④根據(jù)配基特異性不同親和層析法第4頁,共69頁，星期六，2024年，5月二、生物合成技術(shù)生物合成是利用生物細胞的代謝反應(yīng)（更多的是利用微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)）來合成化學(xué)方法難于合成的藥物或藥物中間體。第5頁,共69頁，星期六，2024年，5月微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng):

是利用微生物的代謝作用來進行某些化學(xué)反應(yīng)，確切地說就是利用微生物代謝過程中某種酶對底物進行催化反應(yīng)，以生成所需要的活性物質(zhì)。第6頁,共69頁，星期六，2024年，5月

半合成藥物是指一個藥物其部分結(jié)構(gòu)由天然資源得到，然后用化學(xué)合成法制得最終產(chǎn)品或應(yīng)用微生物轉(zhuǎn)化將化學(xué)合成的中間產(chǎn)物，通過某些生物合成步驟來解決藥物合成中難于進行的化學(xué)反應(yīng)，從而獲得最終有效化合物。第7頁,共69頁，星期六，2024年，5月第8頁,共69頁，星期六，2024年，5月三、生物技術(shù)

生物技術(shù)（biotechnology）又稱生物工程（bioengineering），是利用生物有機體（動物、植物和微生物）或其組成部分（包括器官、組織、細胞或細胞器等）發(fā)展新產(chǎn)品或新工藝的一種技術(shù)體系。第9頁,共69頁，星期六，2024年，5月

基因工程細胞工程酶工程發(fā)酵工程

生物技術(shù)第10頁,共69頁，星期六，2024年，5月重組DNA技術(shù)（基因工程）基本原理：目的基因的獲取重組DNA導(dǎo)入受體細胞目的基因與載體的拼接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選工程菌（或細胞）的大量培養(yǎng)與目的蛋白的生產(chǎn)

第11頁,共69頁，星期六，2024年，5月（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)

第12頁,共69頁，星期六，2024年，5月（二）基因載體的選用定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA第13頁,共69頁，星期六，2024年，5月載體的選擇標準能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。第14頁,共69頁，星期六，2024年，5月質(zhì)粒

(plasmid)特點

能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。第15頁,共69頁，星期六，2024年，5月第16頁,共69頁，星期六，2024年，5月（三）限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ第17頁,共69頁，星期六，2024年，5月BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口第18頁,共69頁，星期六，2024年，5月（四）重組體的構(gòu)建即外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接第19頁,共69頁，星期六，2024年，5月BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接第20頁,共69頁，星期六，2024年，5月2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端第21頁,共69頁，星期六，2024年，5月目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連第22頁,共69頁，星期六，2024年，5月3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。第23頁,共69頁，星期六，2024年，5月5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體第24頁,共69頁，星期六，2024年，5月受體菌條件

安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)（五）重組DNA導(dǎo)入受體菌第25頁,共69頁，星期六，2024年，5月（六）重組體的篩選

1.重組體的表型進行篩選

抗藥性標記篩選、營養(yǎng)素的依賴篩選

2.限制酶切圖譜分析鑒定

3.利用核酸雜交技術(shù)進行鑒定第26頁,共69頁，星期六，2024年，5月(插入失活法)抗藥性標記選擇目錄第27頁,共69頁，星期六，2024年，5月組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成λDNA重組體標志補救第28頁,共69頁，星期六，2024年，5月重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為

小結(jié)分分離目的基因

切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌

篩篩選重組體

第29頁,共69頁，星期六，2024年，5月DNA重組技術(shù)的主要應(yīng)用：1.運用DNA重組技術(shù)大量生產(chǎn)基因工程藥物。2.定向改造生物的基因結(jié)構(gòu)，構(gòu)建高產(chǎn)菌株，用于改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)。3.用于基礎(chǔ)研究，用于基因結(jié)構(gòu)與基因組功能的調(diào)節(jié)研究，用于分子雜交等。第30頁,共69頁，星期六，2024年，5月第二節(jié)

藥物質(zhì)量控制的生物化學(xué)基礎(chǔ)第31頁,共69頁，星期六，2024年，5月一、藥物質(zhì)量控制的常用生化分析法（一）免疫分析法

1.免疫擴散法

2.免疫電泳法

3.放射免疫測定法（RIA）4.酶聯(lián)免疫測定法（ELISA）就是讓抗體或抗原與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測。第32頁,共69頁，星期六，2024年，5月（二）電泳分析法第33頁,共69頁，星期六，2024年，5月第34頁,共69頁，星期六，2024年，5月（三）酶法分析第35頁,共69頁，星期六，2024年，5月1.終止反應(yīng)法2.連續(xù)測定法3.循環(huán)放大分析法第36頁,共69頁，星期六，2024年，5月二、生物藥物質(zhì)量控制的生化分析方法（一）多肽與蛋白質(zhì)類藥物的主要分析方法

1.蛋白質(zhì)藥物的純度分析聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)SDS

毛細管電泳(CE)

等電聚焦(IEF)

高效液相色譜法(HPLC)第37頁,共69頁，星期六，2024年，5月2.多肽與蛋白質(zhì)分子量的測定使用較多的是超速離心法，凝膠層析法和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法等。超速離心法凝膠層析法第38頁,共69頁，星期六，2024年，5月SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法第39頁,共69頁，星期六，2024年，5月3.蛋白質(zhì)的定量測定（1）物理性質(zhì)：紫外分光光度法，折射率法，比濁法。（2）化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法，雙縮脲比色法，

Folin-酚法，BCA法。（3）染色性質(zhì)：考馬斯亮蘭G-250結(jié)合法、銀染、金染。（4）其他：熒光激發(fā)。第40頁,共69頁，星期六，2024年，5月4.膠體金比色法膠體金是一種帶負電荷的疏水性膠體，加入蛋白質(zhì)后，紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色，595nm處測定樣品的吸收值，計算含量。第41頁,共69頁，星期六，2024年，5月5.生物質(zhì)譜法：多肽和蛋白質(zhì)的分子量可用MALDI/MS（基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜法）或ESI/MS（電噴霧離子化質(zhì)譜法）直接測定，用質(zhì)譜法測定蛋白質(zhì)的分子量簡便，快速、靈敏、準確。第42頁,共69頁，星期六，2024年，5月（二）核酸類藥物的主要分析方法1.紫外分光光度法：測定RNA與DNA含量260nm2.地衣酚顯色法測定RNA含量

3，5-二羥甲苯3.二苯胺法測定DNA含量第43頁,共69頁，星期六，2024年，5月（三）酶類藥物的分析酶類藥物的主要質(zhì)量指標是它的催化活力。（四）重組DNA藥物中的可能雜質(zhì)檢查

1.外源性DNA2.宿主細胞蛋白質(zhì)3.二聚體或多聚體的測定4.降解產(chǎn)物的測定第44頁,共69頁，星期六，2024年，5月第三節(jié)

藥理學(xué)研究的生物化學(xué)基礎(chǔ)第45頁,共69頁，星期六，2024年，5月神經(jīng)遞質(zhì)又稱突觸分泌信號(synapticsignal)特點由神經(jīng)元細胞分泌；通過突觸間隙到達下一個神經(jīng)細胞；作用時間較短。例如：乙酰膽堿、去甲腎上腺素等一、藥物作用的生物化學(xué)基礎(chǔ)（一）神經(jīng)傳導(dǎo)與神經(jīng)遞質(zhì)第46頁,共69頁，星期六，2024年，5月乙酰膽堿受體功能模式圖1.受體-離子通道型（二）受體的結(jié)構(gòu)與功能第47頁,共69頁，星期六，2024年，5月※G蛋白(guanylatebindingprotein)是一類和GTP或GDP相結(jié)合、位于細胞膜胞漿面的外周蛋白，由、、三個亞基組成。有兩種構(gòu)象：非活化型；活化型2．受體-G蛋白-效應(yīng)蛋白型第48頁,共69頁，星期六，2024年，5月RＲHACγαβGDPαGTPβγ腺苷酸環(huán)化酶ACATPcAMP第49頁,共69頁，星期六，2024年，5月與配體結(jié)合后具有酪氨酸蛋白激酶活性，如胰島素受體

insulingrowthfactorreceptor,IGF-R

表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGF-R)。第50頁,共69頁，星期六，2024年，5月4．受體-轉(zhuǎn)錄因子型高度可變區(qū)位于N端，具有轉(zhuǎn)錄活性DNA結(jié)合區(qū)含有鋅指結(jié)構(gòu)激素結(jié)合區(qū)位于C端，結(jié)合激素、熱休克蛋白，使受體二聚化，激活轉(zhuǎn)錄鉸鏈區(qū)第51頁,共69頁，星期六，2024年，5月第52頁,共69頁，星期六，2024年，5月（三）跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）不同種類的受體使用由共同組分構(gòu)成的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號（2）在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中不同類型的磷酸化同時起作用第53頁,共69頁，星期六，2024年，5月（四）細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與藥物研究

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的激動劑和抑制劑是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)藥物的研究出發(fā)點，尤其是各種蛋白激酶的抑制劑更是被廣泛用做母體藥物進行抗腫瘤新藥。第54頁,共69頁，星期六，2024年，5月信號轉(zhuǎn)導(dǎo)干擾藥物的藥效和副作用

取決于：一、它所干擾的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在體內(nèi)是否廣泛存在，如果廣泛存在各細胞內(nèi)，副作用難以控制。二、藥物自身的選擇性，對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的選擇性越高，副作用越小。第55頁,共69頁，星期六，2024年，5月（五）藥物作用的靶酶藥物對靶酶的作用：

調(diào)節(jié)酶量調(diào)節(jié)酶活力第56頁,共69頁，星期六，2024年，5月酶抑制劑應(yīng)用臨床的條件：（1）被抑制的靶酶所催化的生化反應(yīng)與某種疾病的發(fā)生有關(guān)，具有治療作用。（2）酶抑制劑具有特異性。（3）具有某種藥動學(xué)特征，能到達作用部位、具有合理、可預(yù)見的量效關(guān)系和作用持續(xù)時間。（4）對人體毒性小，療效指數(shù)高。（5）應(yīng)符合藥品標準。第57頁,共69頁，星期六，2024年，5月（六）細胞生長調(diào)節(jié)因子

1.細胞生長刺激因子類

2.細胞生長抑制因子類第58頁,共69頁，星期六，2024年，5月（七）細胞凋亡的生物化學(xué)

細胞凋亡是某些生理或病理條件下，細胞接受到某種信號所觸發(fā)的并按一定程序進行的主動、緩慢的死亡過程。

生化特征：（1）DNA片段化（2）谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、鈣蛋白酶激活：如磷脂酰絲氨酸顯露（3）一些特殊蛋白質(zhì)、RNA的產(chǎn)生和合成第59頁,共69頁，星期六，2024年，5月二、新藥篩選的生物化學(xué)方法（一）放射配基受體結(jié)合法（RRA）第60頁,共69頁，星期六，2024年，5月（二）酶學(xué)實驗法

肝臟細胞色素P450系統(tǒng)（三）膜功能研究方法

1.鈣調(diào)蛋白-紅細胞膜的制備及鈣調(diào)蛋白功能測定

2.心肌細胞膜的制備與功能測定第61頁,共69頁，星期六，2024年，5月（四）生化代謝功能分析法

1.降血糖藥物實驗法

2.調(diào)血脂藥及抗動脈粥樣硬化藥實驗法

3.凝血藥和抗凝血藥實驗法（五）逆向藥理學(xué)基因→受體→藥物第62頁,共69頁，星期六，2024年，5月一、酶與藥物設(shè)計二、受體與藥物設(shè)計（一）受體介導(dǎo)的靶向藥物設(shè)計（二）藥物與受體結(jié)合的構(gòu)象分析

1．同源分子法

2．歸納法

3．演繹法

4．比較分子力場分析法第四節(jié)與藥物設(shè)計有關(guān)的生物化學(xué)原理第63頁,共69頁，星期六，2024年，5月三、藥物代謝轉(zhuǎn)化與前體藥物設(shè)計

研究藥物代謝的主要目的是確定藥物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化的途徑，并定量地確定每一代謝途徑及其中間體的藥理活性。第64頁,共69頁，星期六，2024年，5月