基因工程常用的工具酶

第二章基因工程常用的工具酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶2024/8/191.限制性核酸內(nèi)切酶：簡稱限制酶。是一類能識別雙鏈DNA分子中某種特定的核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶

20世紀50年代發(fā)現(xiàn)：λ噬菌體E.coliBPFU10-4E.coliB

PFU1λ噬菌體DNA被降解DNA被修飾E.coliB限制性核酸內(nèi)切酶：降解外來DNA防御修飾酶：DNA甲基化保護寄主細胞控制的限制與修飾系統(tǒng)（R/M體系）！2024/8/192.一、限制酶的種類限制修飾活性酶蛋白結(jié)構(gòu)相對分子質(zhì)量切割位點切割作用輔助因子實用性代表Ι型酶Ⅱ型酶Ⅲ型酶同時存在單獨存在同時存在多亞基結(jié)構(gòu)單亞基結(jié)構(gòu)兩個亞基30萬dal2-10萬dalΙ、Ⅱ之間

與識別位點不一致與識別位點一致與識別位點不一致Mg2+、ATP、SAMMg2+Mg2+、SAM

低高低EcoK、EcoBHindⅡ

EcoPΙ2024/8/193.二、限制酶的命名命名原則限制酶寄主微生物屬名頭字母（大寫）和種名前兩字母（小寫）表示寄主物種菌株名位于其后羅馬數(shù)字表示同一寄主菌株的不同限制修飾系統(tǒng)

Haemophilusinfluenzaed

HindΙ、

HindⅡ、Hind

Ⅲ

屬名種名株名

不同限制修飾系統(tǒng)

2024/8/194.三、Ⅱ型限制酶的特性-識別序列識別雙鏈DNA分子中特定的4-8對核苷酸序列5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點5‘…GAGGCCGAG…3’3‘…CTCCGGCTC…5’HaeⅢ的識別序列HaeⅢ

的切割位點2024/8/195.大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)部分限制酶能識別多種核苷酸序列5‘…GCGTPyPuACGAG…3’3‘…CGCAPuPyTGCTC…5’HindⅡ的識別序列PydCMP、dTMPPudAMP、dGMP2024/8/196.識別序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點回文結(jié)構(gòu):兩條核苷酸鏈的核酸序列呈雙重旋轉(zhuǎn)對稱排列的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)2024/8/197.三、Ⅱ型限制酶的特性-切割后形成的末端粘性末端：5‘…GTGAATTCGA…3’3‘…CACTTAAGCT…5’EcoRI5‘…GTGAATTCGA…3’3‘…CACTTAAGCT…5’平齊末端：5‘…GAGGCCGAG…3’3‘…CTCCGGCTC…5’5‘…GAGGCCGAG…3’3‘…CTCCGGCTC…5’HaeⅢ彼此具有互補核苷酸的單鏈延伸末端2024/8/198.三、Ⅱ型限制酶的特性-同尾酶、同裂酶同尾酶:來源各異、識別序列也不相同，但都產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制酶5‘…GTGGATCCGA…3’3‘…CACCTAGGCT…5’BamHI5‘…GTGGATCCGA…3’3‘…CACCTAGGCT…5’5‘…GTTGATCAGA…3’3‘…CAACTAGTCT…5’BclI5‘…GTTGATCAGA…3’3‘…CAACTAGTCT…5’BamHI、BclI為一組同尾酶2024/8/199.同裂酶:來源各異，但識別相同核酸序列的一類酶5‘…GTGATCGA…3’3‘…CACTAGCT…5’Sau3AI5‘…GAGATCCA…3’3‘…CTCTAGGT…5’MboI5‘…GTCCCGGGGA…3’3‘…CAGGGCCCCT…5’XmaI5‘…GTCCCGGGGA…3’3‘…CAGGGCCCCT…5’SmaI2024/8/1910.四、影響限制酶活性的因素DNA的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、EDTA、SDS增加限制酶用量擴大酶催化反應(yīng)體系延長酶催化時間DNA的甲基化程度：反應(yīng)溫度：DNA的分子結(jié)構(gòu)：酶緩沖液組成：甘油濃度：MgCl2：NaCl/KCl：Tris-HCl：β-巰基乙醇/二硫蘇糖醇（DTT）：牛血清白蛋白（BSA）：2024/8/1911.第二節(jié)DNA連接酶2024/8/1912.DNA連接酶：能夠催化雙鏈DNA片段相鄰的3‘羥基與5’磷酸基形成磷酸二酯鍵的酶作用特點只能連接雙螺旋DNA分子，不能連接單鏈DNA分子；DNA鏈上必須具有游離的3’-OH和5‘-P；只能封閉DNA鏈上磷酸二酯鍵切口，不能封閉多個核酸分子缺失形成的裂口；需要吸能：ATP/NAD+連接方式缺口DNA:平齊末端DNA：粘性末端DNA：5’5’3’3’OHP5’5’3’3’OHPPOH5’5’3’3’2024/8/1913.基因工程中常用的連接酶T4噬菌體DNA連接酶（T4連接酶）大腸桿菌DNA連接酶熱穩(wěn)定性DNA連接酶2024/8/1914.第三節(jié)DNA聚合酶2024/8/1915.DNA聚合酶：能夠催化DNA復(fù)制和修復(fù)DNA分子損傷的一類酶作用特點能夠把脫氧核苷酸分子連續(xù)的加到DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用條件脫氧核苷酸原料：四種脫氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）引物鏈：帶有3’-OH游離基團模板：單鏈或雙鏈DNA模板Mg2+：2024/8/1916.一、大腸桿菌DNA聚合酶Ι（DNApolI）酶特性：5’→3’聚合酶活性5’→3’核酸外切酶活性3’→5’核酸外切酶活性3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’dNTPMg2+DNApolI3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH5‘…C-G-A-G-T-OH2024/8/1917.切口平移反應(yīng)（Nicktranslation）用途：制備32P標記的DNA探針5’→3’核酸外切酶活性5’→3’核酸聚合酶活性5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘DNaseIDNApolIMg2+dNTPa-32P-dATP2024/8/1918.二、Klenow大片段酶DNA聚合酶一個片段：5’→3’核酸外切酶活性另一個片段：5’→3’聚合酶活性、3’→5’核酸外切酶活性枯草桿菌蛋白酶Klenow大片段酶Klenow大片段酶特性：5’→3’聚合酶活性

3’→5’核酸外切酶活性2024/8/1919.Klenow大片段酶用途：補平限制酶切割DNA后產(chǎn)生的粘性末端5‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’2024/8/1920.用32PdNTP對3‘凹端進行末端同位素標記5‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’2024/8/1921.cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈應(yīng)用sanger雙脫氧末端中止法進行DNA測序2024/8/1922.三、TagDNA聚合酶來源嗜熱水生棲熱菌酶特性5’→3’聚合酶活性、3’→5’核酸外切酶活性耐高溫：75~80℃應(yīng)用：PCR技術(shù)（聚合酶鏈式反應(yīng)）2024/8/1923.PCR技術(shù)基本原理：類似于細胞內(nèi)DNA復(fù)制過程基本步驟(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補鏈引物1互補鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補鏈引物2互補鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）PCR反應(yīng)示意圖(e)(f)(g)2024/8/1924.94℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）溫度（℃）時間（min）947260循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期2024/8/1925.特點待擴增的DNA鏈限定在模板上的退火位點之間待擴增DNA鏈得到迅速大量擴增反應(yīng)體系組成影響因素模板dNTPDNA聚合酶引物A、BMgCl2引物的設(shè)計退火溫度MgCl2濃度2024/8/1926.第四節(jié)DNA修飾酶2024/8/1927.一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶（TDT）：在沒有模板存在的條件下，能催化dNTP隨機加于DNA分子的3‘-OH端5‘p3‘HOOH3‘p5‘TDTMg2+

dATPAAAAAAAAAAAAOH3‘5‘p3‘HOp5‘同聚物尾巴Poly（dA）2024/8/1928.作用底物：帶3’-OH末端的單鏈DNA5‘pOH3‘TDTMg2+

dATPAAAAAAAAAAAAOH3‘5‘p2024/8/1929.帶3’-OH單鏈突出末端的雙鏈DNA5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TDTMg2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAOH3‘

p5‘

帶3’-OH平齊末端的雙鏈DNA5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TDTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3‘

p5‘

2024/8/1930.用途：外源DNA與載體的重組DNA片段3‘端標記2024/8/1931.二、堿性磷酸酶細菌堿性磷酸酶（BAP）：來自E.coli小牛腸堿性磷酸酶（CIP）：來自小牛腸作用：催化核酸分子脫去5’-P5‘pOH3‘

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