CO2氣腹對(duì)大鼠腹膜炎細(xì)菌生長(zhǎng)及移位的影響

1/1CO2氣腹對(duì)大鼠腹膜炎細(xì)菌生長(zhǎng)及移位的影響CO2氣腹對(duì)大鼠腹膜炎細(xì)菌生長(zhǎng)及移位的影響歐夢(mèng)川1，羅云1，王崇樹(shù)1,21.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外一科（四川南充文化路63號(hào)637000）；2.川北醫(yī)學(xué)院肝膽胰腸研究所（四川南充涪江路234號(hào)637000）[摘要]目的研究不同氣腹壓力及作用時(shí)間對(duì)大鼠腹膜炎腹腔感染細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖和細(xì)菌移位的影響。

方法大鼠腹腔內(nèi)注射大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)混懸液，建立大鼠急性細(xì)菌性腹膜炎模型，60只SD大鼠隨機(jī)分為6組，通過(guò)不同二氧化碳?xì)飧箟毫皶r(shí)間處理后，分別取腹水進(jìn)行細(xì)菌定量培養(yǎng)和菌種分離鑒定，對(duì)門靜脈血進(jìn)行血培養(yǎng)和內(nèi)毒素測(cè)定。

結(jié)果經(jīng)過(guò)氣腹處理3小時(shí)后，高氣腹組與對(duì)照組，低氣腹組與對(duì)照組相比，細(xì)菌CFU濃度有顯著性升高（P0.05）;高氣腹組血培養(yǎng)陽(yáng)性率高于對(duì)照組（P0.05）;高氣腹組內(nèi)毒素含量高于低氣腹組（P0.05），低氣腹組內(nèi)毒素含量高于對(duì)照組（P0.05）；腹水及血培養(yǎng)中都培養(yǎng)出了腸道常見(jiàn)定植需氧及厭氧細(xì)菌。

結(jié)論二氧化碳?xì)飧勾龠M(jìn)了腹膜炎大鼠的腸道內(nèi)毒素和細(xì)菌移位，并且隨壓力和時(shí)間的增加而升高。

二氧化碳?xì)飧弓h(huán)境促進(jìn)了腹水細(xì)菌的生長(zhǎng)，以厭氧細(xì)菌的增加為主，總的細(xì)菌數(shù)量比無(wú)氣腹的環(huán)境明顯增加。

腹腔鏡手術(shù)目前正在全球范圍內(nèi)迅速普及，從最初的膽囊切除術(shù)逐漸擴(kuò)展至其他學(xué)科領(lǐng)域，其中包括了很多感染性疾病在內(nèi)，如化膿性闌尾炎、急性膽囊炎、重癥急性膽管炎、結(jié)核性腹膜炎、胃腸道穿孔等。

相比開(kāi)放性手術(shù)，腹腔鏡手術(shù)具有創(chuàng)傷小、全身反應(yīng)輕、恢復(fù)快、美容等優(yōu)勢(shì)。

二氧化碳是目前較常用的創(chuàng)建氣腹的氣體，其對(duì)機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)以及炎癥反應(yīng)影響的研究也較多，但對(duì)腹膜炎的影響并沒(méi)有達(dá)成一致的共識(shí)。

腹腔鏡手術(shù)的微創(chuàng)性，能更好的保護(hù)機(jī)體的全身免疫系統(tǒng)，減輕全身的炎癥反應(yīng)，但同時(shí)，二氧化碳?xì)飧挂矔?huì)導(dǎo)致局部腹膜免疫功能的抑制[1]。

有不少實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了二氧化碳?xì)飧乖黾恿司Y的發(fā)生幾率[2]，但同時(shí)也在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到，相比開(kāi)放性手術(shù)，氣腹組在腹腔感染模型中顯著延長(zhǎng)了大鼠的生存率[3]。

臨床資料研究也對(duì)氣腹使腹腔感染擴(kuò)散的推論予以否定，許多感染性疾病也通過(guò)腹腔鏡手術(shù)得到了很好的治療，并沒(méi)有見(jiàn)到這些感染性疾病出現(xiàn)感染加重或并發(fā)癥的情況[4]。

本實(shí)驗(yàn)，將在大鼠腹膜炎模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)形成不同時(shí)間及不同壓力的CO2氣腹，研究氣腹壓力對(duì)腹膜炎細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖和移位的影響，確定是否二氧化碳?xì)飧乖黾恿藬⊙Y的發(fā)生幾率。

材料與方法一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用SD大鼠（由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌雄不限，體重范圍在200-250之間。

二、主要試劑及器材Stryker全自動(dòng)氣腹機(jī)（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供），梅里埃VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀，龐通公司處購(gòu)入哥倫比亞血瓊脂平板和麥康凱培養(yǎng)平板，金山川公司提供MB80微生物動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)和革蘭陰性菌脂多糖檢測(cè)試劑盒。

三、建立急性腹膜炎模型將大鼠禁食禁水12小時(shí)，將大鼠上腹部處備皮，碘伏消毒皮膚，以1%戊巴比妥鈉30ml/kg腹腔注射麻醉動(dòng)物，麻醉成功后將大鼠平臥固定在木板上，再分別用腹腔注射法接種1ml的ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌懸液（108CFU／ml），建立腹膜炎大鼠模型。

四、實(shí)驗(yàn)方法將SD大鼠隨機(jī)分為六組，實(shí)驗(yàn)組①15mmhg，60min，②5mmhg，60min，③15mmhg，180min，④5mmhg，180min，⑤對(duì)照60min組，⑥對(duì)照180min組。

對(duì)照組不經(jīng)過(guò)氣腹處理。

實(shí)驗(yàn)組用空針針頭于大鼠下腹部穿刺，連接軟質(zhì)塑料管和Stryker氣腹機(jī)，按照不同要求設(shè)定壓力、流速檔位。

五、標(biāo)本的采集按照設(shè)定的時(shí)間氣腹處理后，分別用實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的大鼠進(jìn)行剖腹處理，在無(wú)菌條件下取腹水、門靜脈血液各自標(biāo)號(hào)待檢，對(duì)其分別進(jìn)行需氧和厭氧細(xì)菌的定量培養(yǎng)和菌種鑒定。

再對(duì)抽取的門靜脈血進(jìn)行內(nèi)毒素測(cè)定。

六、觀測(cè)指標(biāo)1腹水細(xì)菌CFU計(jì)數(shù)采取倍比稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法，取各濃度100ul接種于麥康凱瓊脂平板上，分別做需氧和厭氧的細(xì)菌培養(yǎng)，厭氧細(xì)菌的培養(yǎng)是將培養(yǎng)基放入?yún)捬醮兄萌敕跸渑囵B(yǎng)，每個(gè)濃度做3個(gè)平板，對(duì)需氧和厭氧培養(yǎng)平板的細(xì)菌菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

計(jì)算公式細(xì)菌含量（cfu/ml）=（需氧+厭氧）菌落數(shù)*稀釋度/體積2血培養(yǎng)細(xì)菌陽(yáng)性率處死動(dòng)物后打開(kāi)腹腔，取門靜脈血0.5ml,用一定量無(wú)菌生理鹽水稀釋，分別取100ul接種在血平板上進(jìn)行需氧和厭氧培養(yǎng)，有肉眼可見(jiàn)細(xì)菌菌落生長(zhǎng)則為陽(yáng)性，如果平板培養(yǎng)3天以后仍沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)，則為陰性。

3內(nèi)毒素的測(cè)定按照革蘭陰性菌脂多糖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用微生物快速動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)血漿中內(nèi)毒素含量。

七、統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料都以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（MSD）表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)都采用SPSS13.0軟件完成數(shù)據(jù)分析。

結(jié)果1腹水細(xì)菌CFU培養(yǎng)不同壓力及氣腹作用時(shí)間下對(duì)腹水進(jìn)行細(xì)菌定量培養(yǎng)，其細(xì)菌濃度用CFU表示，如表1，表1不同壓力及氣腹作用時(shí)間下腹水細(xì)菌CFU計(jì)數(shù)(105cfu/ml)時(shí)間氣腹壓力60min180min高氣腹組15mmhg5.390.966.940.49低氣腹組5mmhg4.910.876.451.05對(duì)照組4.620.535.550.96氣腹3小時(shí)后各組之間的腹水細(xì)菌CFU/ml的含量有顯著性差異，P0.05，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，低氣腹組和高氣腹組細(xì)菌含量沒(méi)有差異，P0.05，而高氣腹組與對(duì)照組，低氣腹組與對(duì)照組相比有顯著性差異，P0.05。

對(duì)照組兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腹水細(xì)菌濃度，按=0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P0.05，1h和3h兩個(gè)對(duì)照組之間有顯著性差異，說(shuō)明大鼠誘發(fā)急性化學(xué)性腹膜炎后3h腹水細(xì)菌的濃度呈進(jìn)行性增高。

說(shuō)明在15mmhg和5mmhg二氧化碳?xì)飧固幚?h后，細(xì)菌在腹腔的定植量有顯著增高，但氣腹壓力的增高并沒(méi)有使細(xì)菌的濃度有差異性的增高。

2血培養(yǎng)結(jié)果各組動(dòng)物血培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表2，各組都發(fā)生了細(xì)菌移位。

對(duì)照組中，1h和3h組之間的血培養(yǎng)陽(yáng)性率無(wú)顯著性差異（P0.05），故認(rèn)為各組時(shí)間的不同對(duì)血培養(yǎng)的陽(yáng)性率的影響并無(wú)差異，所以將1h和3h組合并，分為高氣腹組、低氣腹組和對(duì)照組。

高氣腹組血培養(yǎng)陽(yáng)性率高于對(duì)照組（P0.05），氣腹組血培養(yǎng)陽(yáng)性率與對(duì)照組和高氣腹組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。

表2不同壓力及時(shí)間血培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果（單位：

例數(shù)）時(shí)間氣腹壓力60min180min高氣腹組15mmhg56低氣腹組5mmhg34對(duì)照組123門靜脈內(nèi)毒素含量的結(jié)果不同壓力及氣腹作用時(shí)間下門靜脈內(nèi)毒素含量見(jiàn)表3，對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)股靜脈血內(nèi)毒素含量的t檢驗(yàn)結(jié)果P0.05，對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)門靜脈血內(nèi)毒素含量有顯著性差異，其門靜脈血內(nèi)毒素含量隨著感染時(shí)間的增加呈進(jìn)行性升高。

表3不同實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組門靜脈內(nèi)毒素含量（pg/ml）時(shí)間氣腹壓力60min180min高氣腹組15mmhg73.655.6092.936.48低氣腹組5mmhg68.774.1388.134.55對(duì)照組64.404.8381.983.89氣腹1小時(shí)各組門靜脈血內(nèi)毒素含量的方差分析，按=0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)，可以認(rèn)為三組大鼠股靜脈血的內(nèi)毒素含量有顯著性差別；進(jìn)一步兩兩比較，可以認(rèn)為高氣腹組和低氣腹組、高氣腹組和對(duì)照組之間門靜脈血內(nèi)毒素含量有差異，且高氣腹組內(nèi)毒素含量高于低氣腹組和對(duì)照組，而對(duì)照組與低氣腹組之間靜脈血內(nèi)毒素含量沒(méi)有差異（P0.05）。

氣腹3小時(shí)各組間門靜脈血內(nèi)毒素含量的方差分析與1小時(shí)類似，可以認(rèn)為三組之間門靜脈血內(nèi)毒素含量都有差別（P0.05），且高氣腹組內(nèi)毒素含量高于低氣腹組，低氣腹組內(nèi)毒素含量高于對(duì)照組（P0.05）。

討論腸道是人體最大的細(xì)菌及內(nèi)毒素貯存庫(kù)，其中定植了很多致病菌與益生菌，但在正常情況下機(jī)體并沒(méi)有感染致病菌，這主要是依賴于完整的腸道粘膜屏障功能。

正常人體腸道粘膜屏障是由正常腸道菌群、免疫屏障和機(jī)械屏障構(gòu)成的，任一部分的異常都能造成腸道通透性的增加，繼而發(fā)生腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素移位[5,6]。

二氧化碳?xì)飧乖斐赡c道細(xì)菌移位及菌血癥的具體機(jī)制尚在研究中，一定壓力的氣腹可能造成了腸道機(jī)械屏障的破壞，從而促進(jìn)了細(xì)菌的移位[7]。

完整的腸上皮粘膜細(xì)胞和緊密連接是構(gòu)成腸道機(jī)械屏障的重要組成部分[8]。

腸道局部的良好血液灌注及供氧是維持正常腸粘膜上皮細(xì)胞功能的重要因素。

Menconi等[9]研究發(fā)現(xiàn)酸中毒環(huán)境時(shí)，腸粘膜上皮細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，細(xì)胞間緊密連接變得松散，細(xì)胞代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致細(xì)胞跨膜路徑和細(xì)胞通道同時(shí)增加，腸粘膜通透性增高，并且與酸中毒程度呈正相關(guān)。

程君濤等[10]指出腹內(nèi)壓增高可引起的小腸血流量顯著降低，黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生急性缺血缺氧而導(dǎo)致其結(jié)果和功能的改變，損害的程度也與壓力的大小及作用時(shí)間有關(guān)。

而趙曉琴[11]等也證明了腹內(nèi)壓增高時(shí)，會(huì)造成小腸上皮細(xì)胞顯著損害和細(xì)胞間緊密連接(tightjunction)的疏松，導(dǎo)致腸粘膜通透性增高。

腸道的細(xì)菌和內(nèi)毒素更容易進(jìn)入血液和淋巴，造成遠(yuǎn)處器官細(xì)菌的播散。

大鼠腹膜炎本身就會(huì)導(dǎo)致腸道細(xì)菌的移位，這可能與炎癥反應(yīng)造成的腸粘膜屏障功能損害有關(guān)，且移位的細(xì)菌以厭氧菌為主[12]。

二氧化碳?xì)飧勾龠M(jìn)了腹膜炎大鼠的腸道內(nèi)毒素和細(xì)菌移位，并且隨壓力和時(shí)間的增加而升高。

即使在低壓氣腹?fàn)顟B(tài)下，長(zhǎng)時(shí)間的作用也能夠促進(jìn)腹膜炎大鼠內(nèi)毒素的移位。

由于實(shí)驗(yàn)大鼠最初通過(guò)腹腔注射大腸桿菌混懸液造成了急性細(xì)菌性腹膜炎，腹腔內(nèi)并無(wú)其它細(xì)菌感染，可知腹水培養(yǎng)出的細(xì)菌主要是由腸道細(xì)菌移位而來(lái)。

大腸桿菌和各種致病菌在合適的培養(yǎng)條件下，在對(duì)數(shù)期內(nèi)每隔20-30分鐘細(xì)菌數(shù)量就會(huì)成倍增長(zhǎng)，直至養(yǎng)分的消耗及代謝廢物的增加數(shù)量達(dá)到穩(wěn)定[13]。

而當(dāng)生長(zhǎng)條件改變時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)也會(huì)受到影響[14]。

盡管CO2可以通過(guò)碳酸氫鹽的形式影響細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的PH值繼而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[15]，但一些實(shí)驗(yàn)證明，二氧化碳本身可能也是一種細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制劑[16]。

但目前大部分的實(shí)驗(yàn)都是在CO2高壓或者體外環(huán)境下實(shí)現(xiàn)的，而CO2在腹腔感染情況下對(duì)各種細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖和各種毒力的影響鮮有報(bào)道。

Sare等[17]在腹腔注射大腸桿菌致腹膜炎氣腹模型中觀察到，CO2氣腹組腹腔細(xì)菌計(jì)數(shù)對(duì)比開(kāi)腹組和對(duì)照組有顯著升高，但他并沒(méi)有將需氧和厭氧細(xì)菌分開(kāi)檢測(cè)。

Mustafasar等[18]在兔的腹膜炎模型中證明了，CO2氣腹組刺激了厭氧細(xì)菌的增殖和降低了機(jī)體清除細(xì)菌的能力，最終導(dǎo)致了腹腔膿腫的形成和腹膜炎的擴(kuò)散，這可能是由于二氧化碳導(dǎo)致了缺氧環(huán)境引起的。

Matsumoto等[19]發(fā)現(xiàn)二氧化碳?xì)飧箍赡茉谝种凭植棵庖邞?yīng)答方面起重要作用，導(dǎo)致了機(jī)體清除細(xì)菌能力的降低。

但Armando等[20]卻觀察到二氧化碳?xì)飧共](méi)有改變腹膜清除細(xì)菌的能力，這需要更多的實(shí)驗(yàn)研究去解釋產(chǎn)生這一矛盾結(jié)論的原因。

二氧化碳?xì)飧勾龠M(jìn)細(xì)菌的增殖及移位，和降低腹膜細(xì)菌清除能力這三者之間的相互關(guān)系還需要進(jìn)一步探索。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)二氧化碳?xì)飧固幚?h后，細(xì)菌在腹腔的定植量有顯著增高，但氣腹壓力的增高并沒(méi)有使細(xì)菌的濃度有顯著性的增高。

結(jié)合之前氣腹促進(jìn)了細(xì)菌和內(nèi)毒素移位的結(jié)論，我們推測(cè)即使CO2抑制了需氧細(xì)菌例如大腸桿菌、腸球菌等的增殖，但同時(shí)也促進(jìn)了厭氧細(xì)菌例如類桿菌的增殖和降低了局部腹腔清除細(xì)菌的能力，使總的細(xì)菌CFU在氣腹處理后升高了，增加了敗血癥及全身感染擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。

所以，臨床上在進(jìn)行腹腔鏡手術(shù)時(shí)，在有效暴露手術(shù)視野的前提下，應(yīng)該盡量減少氣腹持續(xù)時(shí)間和壓力，甚至選用無(wú)氣腹腹腔鏡手術(shù)，力求將二氧化碳?xì)飧箤?duì)細(xì)菌性腹膜炎的不利影響降到最低，充分發(fā)揮腹腔鏡微創(chuàng)手術(shù)的優(yōu)勢(shì)。

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