2012313-加減一陰煎對血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞增殖影響

1/12012313_加減一陰煎對血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞增殖影響加減一陰煎對血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞增殖的影響中山大學(xué)醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)系2001級鄭躍陳惠國羅杰鴻摘要目的：

探討中藥制劑加減一陰煎對培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞增殖的影響及其機制。

方法：

以中藥復(fù)方水煎液對新西蘭大白兔灌胃一周，在無菌條件下取血制備血清藥，在培養(yǎng)血管內(nèi)皮和平滑肌細胞中加入不同劑量的血清藥，通過細胞計數(shù)研究藥血清對它們增殖的影響及其機制。

結(jié)果：

與空白組和純血清組對比，平滑肌細胞數(shù)目減少，內(nèi)皮細胞數(shù)目大幅度增加，并有劑量依賴性。

結(jié)論：

加減一陰煎對血管平滑肌細胞增殖有一定的抑制作用，而對血管內(nèi)皮細胞有觸增殖的作用。

關(guān)鍵詞加減一陰煎血管平滑肌細胞血管內(nèi)皮細胞血清藥研究表明許多植物中含有植物雌激素，如異黃酮、－谷甾醇等，它們既有擬雌激素樣的作用，同時還具有心血管保護作用，以明代《景岳全書》中名方一陰煎為主方的加減一陰煎主要由生地、熟地、白芍、麥冬、黃精、知母、地骨皮、牛膝和炙甘草組成，滋陰補血，活血逐瘀的功效，用于治療治療婦女的月經(jīng)不調(diào)的疾病，現(xiàn)代有人將它用于中藥人工周期來治療卵巢功能早衰繼發(fā)性閉經(jīng)[1]，表明加減一陰煎具有恢復(fù)卵巢功能的作用，具有擬雌激素樣的作用。

而加減一陰煎是否具有心血管保護作用還未見報道。

因此本實驗從從中醫(yī)養(yǎng)陰補血理論出發(fā)，運用生理、生化和分子生物學(xué)的方法從細胞水平探討加減一陰煎抗AS的機制，使之能對絕經(jīng)期婦女AS防治有所幫助。

材料與方法一材料1．動物：

健康成年新西蘭大白兔(2.0-2.5kg)和SD大鼠(150-250g)均由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心提供。

小牛主動脈內(nèi)皮細胞，由廣州市奶牛研究所提供。

2．主要藥物和試劑：

加減一陰煎（主要由生地、熟地、白芍、麥冬、黃精、知母、地骨皮、牛膝和炙甘草組成），胰蛋白酶，血管緊張素Ⅱ、PBS溶液、無血清的DMEN和含血清含DMEM培養(yǎng)液、3.主要實驗儀器:CO2培養(yǎng)箱（德國HERAEUAS）二臺，Revco超低溫冰箱一臺，冷凍離心機（德國EPPENDORF）一臺，超凈工作臺二臺，倒置顯微鏡一臺，各種水浴箱，天平，自動煎藥煲和普通冰箱二方法(一)藥血清的制備方劑成分的含量：

生地15g、熟地20g、白芍15g、麥冬15g、黃精15g、知母15g、牛膝15g、丹參15g、川芎15g、地骨皮12g、和炙甘草6g。

每劑藥加水750ml并煎至250ml。

選擇健康成年新西蘭大白兔，每天用中藥復(fù)方水煎液定時灌胃二次，每次60ml，持續(xù)一周.最后一次灌胃后2小時，在無菌局麻條件下行兔頸總動脈插管放血，離心取血清，56℃、30min滅活補體，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對照組灌等量生理鹽水，同法制備對照血清。

(二)研究藥血清影響VSMC增殖的方法1.VSMC的培養(yǎng)利用組織塊貼壁法進行VSMC培養(yǎng).取150-250g大鼠,頸椎脫臼法處死,迅速打開胸腔,無菌條件下取出胸主動脈,放入無菌的PBS平衡液中,清除血塊和外周結(jié)締組織,去除內(nèi)皮,用眼科剪剪成1mm3組織塊,均勻分散于培養(yǎng)瓶中,放入37oC二氧化碳培養(yǎng)箱孵育,待組織塊貼壁后,加入含20%小牛血清的無酚紅的DMEN液中繼續(xù)培養(yǎng),七天后細胞從組織塊邊沿長出,待細胞張滿瓶底后可傳代.倒去培養(yǎng)液,用PBS洗滌,加入0.125%的胰蛋白酶于37oC消化細胞,倒置顯微鏡下觀察,待細胞收縮變圓,立即傾倒消化液,加入含10%小牛血清的無酚紅的DMEN液終止反應(yīng),1:2的比例進行分瓶傳代.實驗用4-6代細胞.2.加入藥血清培養(yǎng)和細胞計數(shù)VSMC以4X105個細胞/ml密度0.5ml接種于24孔板,當(dāng)細胞長至亞融合狀態(tài),用無血清DMEM液培養(yǎng)24h;加入不同濃度的藥血清及對照血清,1h后加入終濃度為10-7mol/L的血管緊張素Ⅱ,培養(yǎng)18h,倒去培養(yǎng)液,用PBS洗滌,加入0.125%的胰蛋白酶于37oC消化細胞,倒去胰酶,加入0.5mlPBS,吹打使全部細胞懸浮,用滴管滴入計數(shù)板,計數(shù).每孔細胞數(shù)目=每計數(shù)板細胞50003.實驗分組分為三組：

空白組Ⅰ；對照組Ⅱ(每孔加10-50ul的對照血清)；藥血清組（分別加：

10ul、20ul、30ul、50ul、80ul、100ul、120ul和150ul藥血清）。

每組設(shè)4個復(fù)管.(三)研究藥血清影響血管內(nèi)皮增殖的方法1.新生小牛主動脈內(nèi)皮細胞(BAECs)的培養(yǎng)和細胞計數(shù)在無菌條件下取新生小牛胸主動脈,按常規(guī)方法分離,培養(yǎng)BAECs,原代BAECs呈鋪路石狀,Ⅷ因子染色陽性.實驗采用傳代培養(yǎng)第3-5代的細胞,培養(yǎng)液為含100ml/L小牛血清的無酚紅的DMEN,處理前24h換用無血清加入轉(zhuǎn)鐵蛋白等補充營養(yǎng)的無酚紅的DMEN.每孔細胞數(shù)目=每計數(shù)板細胞50002.實驗分組血管內(nèi)皮細胞以3105個細胞/ml密度0.5ml接種于24孔板，分為三大組：

空白組Ⅰ；對照組Ⅱ（每孔加不同量的對照血清）；藥血清組Ⅲ（10ul、20ul、30ul、50ul、80ul、100ul、120ul和150ul八個藥血清）。

每組設(shè)6個復(fù)管。

四統(tǒng)計學(xué)處理：

所有數(shù)據(jù)均以meanSD表示,組間及組內(nèi)均數(shù)的比較用方差分析(ｑ檢驗)。

結(jié)果一藥血清對VSMC增殖的影響：

圖一示與空白組和對照組比較，不同量的藥血清對VSMC增殖有一定的抑制作用，并有一定的劑量依賴性，抑制作用的最適濃度為80ul。

當(dāng)藥血清量80ul時，其抑制作用呈降低趨勢。

圖一：

藥血清對VSMC增殖的影響(10ul藥血清組P0.05,其余組P0.05)二藥血清對血管內(nèi)皮細胞增殖的影響：

圖二示與對照組相比，藥血清對血管內(nèi)皮細胞有明顯的觸增殖作用，有一定的劑量依賴性，在30ul增殖最強。

{觸增殖率=（每個劑量的計數(shù)結(jié)果－空白組計數(shù)結(jié)果）/空白組計數(shù)結(jié)果}平滑肌細胞計數(shù)結(jié)果010203040506070空白對照1020405080100120150藥血清量(ul)細胞數(shù)(5000)中藥觸發(fā)內(nèi)皮增殖對照組(104)對照組觸增率藥血清組(104)藥血清組觸增率10ul13.331.080.8216.584.341.2620ul23.001.702.1438.177.104.2330ul23.672.272.2333.003.833.5050ul10.921.460.4933.754.223.6280ul18.251.720.9237.674.272.96120ul24.921.391.6241.587.613.38150ul24.583.011.5948.422.224.10圖二中藥觸發(fā)內(nèi)皮增殖討論研究表明雌激素具有廣泛的心血管保護作用雌激素可保護內(nèi)皮功能和抑制血管平滑肌細胞的增殖[1，8]，臨床上使用雌激素替代療法可有效的減少絕經(jīng)期婦女的AS的發(fā)病率。

但雌激素的長期使用但也會帶來如子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌等嚴重副作用。

如何在發(fā)揮雌激素的保護作用同時，減少它的副作用是急需解決的問題。

目前臨床上用于治療AS的中藥方劑主要集中藥觸發(fā)內(nèi)皮增殖012345671020305080120150加入血清（ul)增殖率藥血對照中在活血化瘀藥和里氣、補氣藥上[2]，而對養(yǎng)陰補血方面研究甚少。

對于廣大絕經(jīng)期婦女而言，往往有陰虛內(nèi)熱之癥，加減一陰煎主要通過其滋陰補血的功效來治療治療婦女的月經(jīng)不調(diào)的疾病，現(xiàn)代有人將它用于中藥人工周期來治療卵巢功能早衰繼發(fā)性閉經(jīng)[3]，這種類似雌激素的作用對臨床上使用雌激素替代療法來抗AS是一個很好的補充，可通過與加減一陰煎的合用來減少雌激素的用量，這對緩解雌激素的副作用大有裨益，有助于廣大絕經(jīng)期婦女AS的防治。

同時通過對加減一陰煎的作用機制的深入研究，有望尋找到一種新的有效的抗AS藥物，使之對廣大男性患者也有效。

大量研究證實，血管內(nèi)皮細胞（VECs）和血管平滑肌細胞（VSMC）的增殖、遷移是AS形成過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9]，血管內(nèi)皮細胞在血管創(chuàng)傷修復(fù)、止血、血栓形成等一系列生理病理過程中起重要作用[4]，VECs的損傷和VSMC的異常增殖導(dǎo)致血管腔狹窄和痙攣是多種疾病（高血壓、AS、等）發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，加減一陰煎在兔體內(nèi)經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化后，在血清中產(chǎn)生有效成分，能促進血管內(nèi)皮細胞增殖，維持內(nèi)皮的完整性，又能抑制VSMC增殖，可見其具有血管的保護作用，但其對平滑肌增殖的抑制和對血管內(nèi)皮的觸增殖作用的途徑和機制尚不清楚，有待進一步的研究。

在抑制平滑肌增殖實驗中，當(dāng)藥血清量80ul時，其抑制增殖的作用降低。

其原因可能是由于80ul血清已經(jīng)發(fā)揮最大的抑制增殖作用，同時由于血清本身對平滑肌細胞有營養(yǎng)增殖作用（由表二和圖二，血清對照組結(jié)果表明血清也有血管觸增殖作用），抵消了藥血清有效成分的抑制作用。

本實驗采用藥血清法研究體外培養(yǎng)細胞的增值。

復(fù)方中藥體外實驗主要有兩種方法，一種是將中藥粗提物直接添加(如水煎液)作為作用細胞的處理因素，另一種是制成含藥血清來作用細胞用于作用機理的研究。

兩者方法各有優(yōu)缺點[5]，大致認為直接添加有三方面缺點：

a.缺乏復(fù)方的體內(nèi)代謝物或機體反應(yīng)物等實際有效成分，引起假陰性；b.機體非吸收物質(zhì)的體外作用，造成假陽性；c.粗提物理化性質(zhì)如雜質(zhì)、酸堿度、滲透壓、pH值等對離體系的干擾。

而含藥血清法具有兩大優(yōu)勢：

a.體現(xiàn)復(fù)方藥物的體內(nèi)生化轉(zhuǎn)化效應(yīng)；b.克服藥物本身理化性質(zhì)對實驗的直接干擾。

當(dāng)然，含藥血清也有其無法克服的缺點：

藥物血清材料可來自各種不同生理病理狀態(tài)的個體，會出現(xiàn)含藥血清差異；而且經(jīng)過體內(nèi)反應(yīng)，藥物含量進一步被稀釋，成分更加復(fù)雜，增加了質(zhì)控難度。

血清中部分物質(zhì)已是藥物作用機體細胞的反應(yīng)，如果細胞存在反饋機制，血清二次重復(fù)作用于細胞，將可能掩蓋藥物血清的實際作用。

含藥血清對離體系統(tǒng)同樣也有干擾，如血清本身對體外酶活性的影響等。

［6，7］但與直接加藥法相比，血清藥研究仍有很大的優(yōu)越性。

參考文獻1．談智、王庭槐、楊丹等，17-雌二醇抑制內(nèi)皮素誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖作用。

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9．RossR.,etal.Cellbiologyofatherosclerosis.Annu.Rev.physiol.1995,57:791-804.三嚴三實開展以來，我認真學(xué)習(xí)了習(xí)近平總書記系列講話，研讀了中央、區(qū)、市、縣關(guān)于黨的群眾路線教育實踐活動有關(guān)文件和資料。

我對個人四風(fēng)方面存在的問題及原因進行了認真的反思、查擺和剖析，找出了自身存在的諸多差距和不足，理出了問題存在的原因，明確了今后努力的方向和整改措施。

現(xiàn)將對照檢查情況報告如下，不妥之處，敬請各位領(lǐng)導(dǎo)和同志們批評指正。

一、存在的突出問題一是學(xué)習(xí)深度廣度不夠。

學(xué)習(xí)上存在形式主義，學(xué)習(xí)的全面性和系統(tǒng)性不強，在抽時間和擠時間學(xué)習(xí)上還不夠自覺，致使自己的學(xué)習(xí)無論從廣度和深度上都有些欠缺。

學(xué)習(xí)制度堅持的不好，客觀上強調(diào)工作忙、壓力大和事務(wù)多，有時不耐心、不耐煩、不耐久，實則是缺乏學(xué)習(xí)的鉆勁和恒心。

學(xué)用結(jié)合的關(guān)系處理的不夠好，寫文章、搞材料有時上網(wǎng)拼湊，求全求美求好看，結(jié)合本單位和實際工作的實質(zhì)內(nèi)容少，實用性不強。

比如，每天對各級各類報紙很少及時去閱讀。

因而，使自己的知識水平跟不上新形勢的需要，工作標準不高，唱功好，做功差，忽視了理論對實際工作的指導(dǎo)作用。

二是服務(wù)不深入不主動。

工作上有時習(xí)慣于按部就班，習(xí)慣于常規(guī)思維，習(xí)慣于憑老觀念想新問題，在統(tǒng)籌全局、分工協(xié)作、圍繞中心、協(xié)調(diào)方方面面上還不夠好。

存在著為領(lǐng)導(dǎo)服務(wù)、為基層服務(wù)不夠到位的問題，參謀和助手作用發(fā)揮得不夠充分。

比如，到鄉(xiāng)鎮(zhèn)、部門、企業(yè)了解情況，有時浮皮潦草，不夠全面系統(tǒng)。

與基層群眾談心交流少，沒有真正深入到群眾當(dāng)中了解一線情況，掌握的第一手資料不全不深，書到用時方恨少，不能為領(lǐng)導(dǎo)決策提供更好的服務(wù)。

三是工作執(zhí)行力不強。

日常工作中與辦公室同志談心談話少，對干部思想狀態(tài)了解不深，疏于管理。

辦公室雖然制定出臺了公文辦理、工作守則等規(guī)章制度，但執(zhí)行的意識不強，有時流于形式。

比如，辦公場所禁止吸煙，這一點我沒有嚴格執(zhí)行，有時還在辦公室吸煙。

四是工作創(chuàng)新力不高。

有時工作上習(xí)慣于照貓畫虎，工作只求過得去、不求過得硬，存在著求穩(wěn)怕亂的思想和患得患失心理，導(dǎo)致工作上不能完全放開手腳、甩開膀子去干，缺少一種敢于負責(zé)的擔(dān)當(dāng)和氣魄。

比如，做協(xié)調(diào)工作，有時真成了傳話筒和二傳手，只傳達領(lǐng)導(dǎo)交辦的事項，缺乏與有關(guān)領(lǐng)導(dǎo)和同志共同商討如何把事情做得更好，創(chuàng)造性地開展工作。

五是深入基層調(diào)查研究不夠。

工作中，有時忙于具體事務(wù)，到基層一線調(diào)研不多，針對性不強，有時為了完成任務(wù)而調(diào)研，多了一些官氣、少了一些士氣。

往往是聽匯報的多，直接傾聽群眾意見的少；了解面上情況多，發(fā)現(xiàn)深層次問題少。

比如，對縣委提出的用三分之一時間下基層搞調(diào)研活動，在實際工作中卻沒有做到。

即使下基層，有時也是走馬觀花，蜻蜓點水，讓看什么看什么，讓聽什么聽什么。

在基層幫扶工作上，有時只注重出謀劃策，抓落實、抓具體的少，對群眾身邊的一些小事情、小問題關(guān)心少、關(guān)注不夠。

六是主觀能動性發(fā)揮不夠。

自認為在辦公室工作多年，已經(jīng)能夠勝任工作，有自滿情緒，缺乏俯下身子、虛心請教、不恥下問的態(tài)度。

對待新問題、新情況，習(xí)慣于根據(jù)簡單經(jīng)驗提出解決辦法，創(chuàng)新不足，主觀上存在滿足現(xiàn)狀，不思進取思想，主觀能動性發(fā)揮不夠。

七是對工作細節(jié)重視不夠。

作為辦公室負責(zé)人，存在抓大放小，不能做到知上、知下、知左、知右、知里、知外，有時在一些小的問題上、細節(jié)上沒有做好，導(dǎo)致工作落實不到位，出現(xiàn)偏差。

八是工作效率不是很高。

面對比較繁重的工作任務(wù)，工作有時拈輕怕重、拖拉應(yīng)付、不夠認真。

存在不推不動、不夠主動，推一推動一動、有些被動。

比如，文稿材料的撰寫，有時東拼西湊、生搬硬套、缺乏深入思考。

有時也存在著推諉扯皮現(xiàn)象，不能及時完成，質(zhì)量也難以保證。

對于領(lǐng)導(dǎo)交辦的事項，有時跟蹤、督導(dǎo)的不夠，不能及時協(xié)調(diào)辦理，缺乏應(yīng)有的緊迫感，缺乏開拓創(chuàng)新精神，致使工作效率不高。

二、產(chǎn)生問題的原因分析認真反思和深刻剖析自身存在的問題與不足，主要是自己沒有加強世界觀、人生觀、價值觀的改造，不注重提高自身修養(yǎng)，同時受社會不良風(fēng)氣的影響，在具體應(yīng)對上沒有很好地把握自己，礙于情面隨波逐流。

產(chǎn)生問題的原因主要有以下幾方面。

（一）自身放松了政治理論學(xué)習(xí)。

對政治理論學(xué)習(xí)的重要性認識不足，重視程度不夠。

尤其是在處理工作與學(xué)習(xí)關(guān)系方面，把工作當(dāng)成硬任務(wù)，把學(xué)習(xí)當(dāng)作軟指標，對政治理論學(xué)習(xí)投入的心思和精力不足，缺乏自覺學(xué)習(xí)的主動性和積極性。

（二）宗旨意識有所淡化。

由于鄉(xiāng)鎮(zhèn)工作比較辛苦，從基層回到機關(guān)工作后，產(chǎn)生了松口氣的念頭，有時不自覺產(chǎn)生了優(yōu)越感和驕傲自滿的情緒。

聽?wèi)T了來自各方面的贊譽之聲，深入基層少，對群眾的呼聲、疾苦、困難了解不夠，沒有樹立較強的大局意識和責(zé)任意識，使得自己有時會片面地認為只要做好本職工作，完成領(lǐng)導(dǎo)交辦的任務(wù)就行了，而未能完全發(fā)揮自身的主觀能動性，缺乏做好工作應(yīng)有的責(zé)任心和緊迫感。

（三）憂患意識不強。

只是片面看到了自身工作生活環(huán)境的變化，吃苦耐勞的精神有些缺乏，開拓進取、奮發(fā)有為、敢于沖鋒、勇于擔(dān)當(dāng)?shù)匿J氣有所弱化。

有做太平官的意識，身處領(lǐng)導(dǎo)崗位，求新、求發(fā)展意識薄弱，表率作用發(fā)揮得不夠好，忽視了工作的積極性、主動性和創(chuàng)造性。

（四）勤政廉潔意識有所弱化。

隨著自身經(jīng)濟條件的改善，降低了約束標準，勤儉節(jié)約的傳統(tǒng)美德有些淡化，對奢靡之風(fēng)的極端危害性認識不足，沒有引起高度重視。

誠然，造成自身存在問題的原因遠不止這些，還有很多，如自身的固化思維方式，缺乏居安思危的深層次思考等。

三、今后的努力方向和改進措施查擺問題，剖析根源，關(guān)鍵在于洗澡治病、解決問題。

本人決心從黨性原則出發(fā)，端正態(tài)度、認真對待，在今后的工作中采取強有力措施，立行立改，取得實效。

（一）求真務(wù)實辦公室主任作為承上啟下、協(xié)調(diào)全局、溝通內(nèi)外的重要角色，要立足發(fā)展、改革的新形勢、新情況，以務(wù)實的作風(fēng)和良好的品質(zhì)做出表率。

一是增強大局意識。

要站在全局高度想問題，立足本職崗位做工作。

要注重換位思考，真正做到想領(lǐng)導(dǎo)之所想、謀領(lǐng)導(dǎo)之所謀，及早提出比較成熟的意見和建議，供領(lǐng)導(dǎo)決策參考。

要善于從紛繁復(fù)雜的事務(wù)性工作中解脫出來，理清思路，明確目標，發(fā)揮自己應(yīng)有的作用。

二是增強超前意識。

要認真研究領(lǐng)會組織意圖和領(lǐng)導(dǎo)思路，圍繞領(lǐng)導(dǎo)關(guān)心的重大問題進行廣泛深入的調(diào)查研究，為領(lǐng)導(dǎo)決策提供真實情況和可靠依據(jù)。

要廣泛搜集資料，研究各鄉(xiāng)鎮(zhèn)、機關(guān)單位的新情況、新經(jīng)驗、新做法，借他山之石來攻玉，為領(lǐng)導(dǎo)提出決策預(yù)案。

因此，在想問題、辦事情時，要趕前不趕后，盡可能早半拍、快半拍，提高敏感性，增強主動性。

唯其如此，才能變被動為主動，參謀才能參在點子上，助手才