蛋白質理化性質

關于蛋白質理化性質1.蛋白質第一節(jié)蛋白質的理化性質第二節(jié)蛋白質的測定第2頁,共49頁，星期六，2024年，5月第3頁,共49頁，星期六，2024年，5月ProteinsProteinsarenotjustpolypeptides-Theyarepolypeptidesofdefinedsequence.Eachproteinhasadefinedorderofaminoacidresidues.Aswithnucleicacids,thissequenceisreferredtoasthePRIMARYSTRUCTUREoftheprotein.第4頁,共49頁，星期六，2024年，5月PrimaryStructureProteinsarelongpolypeptides.Proteinsequencescanvaryamongspeciesandstillperformthesamefunction.Proteinsevolve,andtheyevolvebychangesintheiraminoacidsequences.Conservativechanges,e.g.DforENonconservativechanges,e.g.DforA第5頁,共49頁，星期六，2024年，5月TheGeneticCodeEveryoneshouldatleastbefamiliarwithhowtoreadthefollowingtableandconvertagenesequencetoaproteinsequence.threenucleotidescodeforoneaminoacidinaprotein(43=64),sothereisroomforredundancyinthegeneticcodemRNAcodonwritten5′to3′第6頁,共49頁，星期六，2024年，5月

蛋白質的理化性質（一）蛋白質的相對分子量蛋白質是生命大分子物質，其分子量很大，從一萬到幾百萬或更大。利用測小分子法不可能。第7頁,共49頁，星期六，2024年，5月一、由化學組成測定最低分子量如血紅蛋白：55.84（Fe)×（100/0.34）(含量）×4（個數(shù)）＝67000第8頁,共49頁，星期六，2024年，5月二、物化法測定蛋白質分子量：測擴散系數(shù)、滲透壓、光散射、沉降超離心、凝膠過濾、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。第9頁,共49頁，星期六，2024年，5月最準確可靠的方法是超離心法（Svedberg于1940年設計）：蛋白質顆粒在25~50*104g離心力作用下從溶液中沉降下來。沉降系數(shù)（s）：單位（cm）離心場里的沉降速度。

s=————vω2xv=沉降速度（dx/dt）ω=離心機轉子角速度（弧度/s）

x=蛋白質界面中點與轉子中心的距離（cm）沉降系數(shù)的單位常用S，1S=1×10-13（s）第10頁,共49頁，星期六，2024年，5月原理：－－顆粒：沉降－擴散，大顆粒沉降快，小顆粒慢，分離，檢測。第11頁,共49頁，星期六，2024年，5月蛋白質分子量（M）與沉降系數(shù)（s）的關系M=——————RTsD（1－Vρ）R——氣體常數(shù)（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T——絕對溫度D——擴散常數(shù)（蛋白質分子量很大，離心機轉速很快，則忽略不計）V——蛋白質的微分比容（m3·g-1）ρ——溶劑密度（20℃，g·ml-1）

s——沉降系數(shù)第12頁,共49頁，星期六，2024年，5月

由于蛋白質分子中氨基酸殘基的側鏈上存在游離的氨基和游離的羧基，因此蛋白質與氨基酸一樣具有兩性解離的性質，因而也具有特定的等電點。？等電點兩性解離比氨基酸復雜：可解離的側鏈R基；對結合蛋白質，輔基部分含可解離基團。（二）蛋白質的兩性電離及等電點蛋白質在其等電點偏酸溶液中帶正電荷，在偏堿溶液中帶負電荷，在等電點pH時為兩性離子。第13頁,共49頁，星期六，2024年，5月第14頁,共49頁，星期六，2024年，5月膠體定義：質點分散系統(tǒng)蛋白質分子的顆粒直徑已達1－100nm，處于膠體顆粒的范圍。因此，蛋白質具有親水溶膠的性質。穩(wěn)定蛋白質親水溶膠的兩個重要因素：－蛋白質分子表面的水化膜（分子表面極性R基而結合的一層水分子）－表面電荷（同樣pH下，電荷相排斥）－－－蛋白質不會聚集沉淀（三）蛋白質的膠體性質第15頁,共49頁，星期六，2024年，5月布郎運動、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過半透膜，具有吸附能力蛋白質溶液穩(wěn)定的原因：1）表面形成水膜（水化層）；

2）帶相同電荷。++++++第16頁,共49頁，星期六，2024年，5月（四）蛋白質的沉淀反應1.加高濃度鹽類（鹽析）：加鹽使蛋白質沉淀析出。分段鹽析：調節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質溶液中的幾種蛋白質分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)2SO4)。2.加有機溶劑3.加重金屬鹽第17頁,共49頁，星期六，2024年，5月穩(wěn)定是暫時有條件的。在某些物理或化學因素的作用下，蛋白質嚴格的空間結構被破壞（不包括肽鍵的斷裂），從而引起蛋白質若干理化性質和生物學性質的改變，稱為蛋白質的變性。（五）蛋白質的變性和凝固第18頁,共49頁，星期六，2024年，5月第19頁,共49頁，星期六，2024年，5月

天然蛋白質受物理或化學因素的影響，其共價鍵不變，但分子內部原有的高度規(guī)律性的空間排列發(fā)生變化，致使其原有性質發(fā)生部分或全部喪失，稱為蛋白質的變性。

變性蛋白質主要標志是生物學功能的喪失。溶解度降低，易形成沉淀析出，結晶能力喪失，分子形狀改變，肽鏈松散，反應基團增加，易被酶消化。第20頁,共49頁，星期六，2024年，5月第21頁,共49頁，星期六，2024年，5月

蛋白質分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀。變性后的蛋白質由于疏水基團的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白質不一定都是變性后的蛋白質。加熱使蛋白質變性并凝聚成塊狀稱為凝固。(變性蛋白質分子互相凝集為固體的現(xiàn)象稱凝固。)因此，凡凝固的蛋白質一定發(fā)生變性。沉淀和凝固第22頁,共49頁，星期六，2024年，5月引起蛋白質變性的因素有：

①物理因素：高溫、高壓、紫外線、電離輻射、超聲波等；②化學因素：強酸、強堿、有機溶劑、重金屬鹽等。第23頁,共49頁，星期六，2024年，5月①物理性質：溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化學性質：官能團反應性增加，易被蛋白酶水解。③生物學性質：原有生物學活性喪失，抗原性改變。第24頁,共49頁，星期六，2024年，5月

蛋白質變性的可逆性：－－蛋白質在體外變性后，絕大多數(shù)情況下是不能復性的；－－如變性程度淺，蛋白質分子的構象未被嚴重破壞；或者蛋白質具有特殊的分子結構，并經特殊處理則可以復性。第25頁,共49頁，星期六，2024年，5月核糖核酸酶的變性與復性

第26頁,共49頁，星期六，2024年，5月（六）紫外吸收性質可采用紫外分分光度法測定蛋白質的含量。原理第27頁,共49頁，星期六，2024年，5月組成天然蛋白質分子的20種氨基酸，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸對紫外光有光吸收。其吸收峰在280nm左右。各種蛋白質中這幾種氨基酸含量差別小。？含量特別，核酸干擾：280/260nm吸收差法第28頁,共49頁，星期六，2024年，5月（八）成鹽反應R—CH—COOH+HClNH2R—CH—COOHNH2·HCl（九）?；蜔N基化反應R—CH—COOH+RX′NH2R=?；驘N基′R—CH—COOH+HX′NHRX=鹵素（Cl、F）第29頁,共49頁，星期六，2024年，5月反應名稱試劑顏色反應有關基團有此反應的蛋白質或氨基酸雙縮脲反應NaOH、CuSO2紫色或粉紅色二個以上肽鍵所有蛋白質米倫反應HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物紅色

Tyr黃色反應濃HNO3及NH3黃色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反應(Hopking-Cole反應)乙醛酸試劑及濃H2SO4紫色

Trp坂口反應(Sakaguchi反應)α-萘酚、NaClO紅色胍基Arg酚試劑反應(Folin-Cioculteu反應)堿性CuSO4及磷鎢酸-鉬酸藍色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反應茚三酮藍色自由氨基及羧基α-氨基酸

（七）蛋白質的顏色反應—OHN第30頁,共49頁，星期六，2024年，5月（十）成酯反應R—CH—COOH+C2H5OHNH2R—CH—COOC2H5NH2HCl氣當羧基變成乙酯后，羧基的化學性質就被掩蔽了，而氨基的化學性質就突出地顯示出來。（十一）酰氯化反應Y—NH—CRH—COOH+PCl5?；被醂—NH—CRH—COCl酰化氨基酰氯使氨基酸的羧基活化，易于另一氨基酸的氨基結合，在合成肽的工作上常用。第31頁,共49頁，星期六，2024年，5月（十二）成酰胺反應H2N—CHR—COOC2H5+HNH2體外無水H2N—CHR—CONH2+C2H5OH氨基酸酰胺有機體內：Asp（Glu）+NH4+Asn（Gln）Asn（Gln）合成酶ATP（十三）脫羧反應H2N—CHR—COOH脫羧酶CO2+RCH2NH2胺第32頁,共49頁，星期六，2024年，5月（十四）迭氮反應H2N-CHR-COOHYHN-CHR-COOH?；被醂HN-CHR-COOCH3酰化氨基酸甲酯NH2NH2（-CH3OH）YHN—CHR—CO—NH—NH2?；被岬碾卵苌颒NO2YHN—CHR—CON3+2H2O?；被岬?3頁,共49頁，星期六，2024年，5月

蛋白質的分析測定目的蛋白質含量蛋白質純度分子量方法凱氏定氮法電泳電泳雙縮脲法質譜凝膠色譜

Folin-phenol法色譜質譜

UV吸收法

Coomassieblue法

第34頁,共49頁，星期六，2024年，5月第35頁,共49頁，星期六，2024年，5月第36頁,共49頁，星期六，2024年，5月原理：消化氮--無機氮—測氮—計算蛋白含量操作：蛋白質+H2SO4

（消化）---

NH4

+加上OH-,蒸餾出NH3

收集到非揮發(fā)性的標準酸中,然后返滴定凱氏定氮法(1883)

第37頁,共49頁，星期六，2024年，5月優(yōu)點:對所有蛋白質的測量都是一致的(幾乎全部)消化樣品不要可溶缺點:裝置需要大量的樣品.耗時,繁瑣.不是檢測蛋白質–而是檢測N(核酸和硫酸銨鹽是嚴重的污染物).由于缺乏專一性需要校正。

(假定蛋白質含16%的氮,沒有其它NH4

+的主要來源物存在)第38頁,共49頁，星期六，2024年，5月雙縮脲法（1935）原理:

兩個或者以上的肽鍵(雙縮脲是一種兩個尿素分子共用一個氮原子形成的化合物–與二價銅離子形成紫紅色絡合物)

操作：肽+Cu2+(堿性條件下)

肽*Cu++-紅色.在A540/560nm測量。繪制標準曲線，計算。第39頁,共49頁，星期六，2024年，5月顏色反應原理實例雙縮脲反應是兩分子尿素經加熱放出一分子NH3而得到的產物。凡含有兩個或以上肽鍵結構的化合物都具有此反應。第40頁,共49頁，星期六，2024年，5月優(yōu)點:簡便，快速專一不受蛋白質特異性影響缺點:靈敏度較低必須繪制標準曲線所需樣品量大

(0.2—1.7mg/ml)第41頁,共49頁，星期六，2024年，5月Folin-phenol法(Lowry,1951)原理:

肽*Cu++---在堿性條件下被磷鎢酸/磷鉬酸催化氧化--變成藍色（鎢藍和鉬藍），藍色的深淺與蛋白質的含量成正比。操作：配試劑