蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

關于蛋白質(zhì)理化性質(zhì)1.蛋白質(zhì)第一節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定第2頁,共49頁，星期六，2024年，5月第3頁,共49頁，星期六，2024年，5月ProteinsProteinsarenotjustpolypeptides-Theyarepolypeptidesofdefinedsequence.Eachproteinhasadefinedorderofaminoacidresidues.Aswithnucleicacids,thissequenceisreferredtoasthePRIMARYSTRUCTUREoftheprotein.第4頁,共49頁，星期六，2024年，5月PrimaryStructureProteinsarelongpolypeptides.Proteinsequencescanvaryamongspeciesandstillperformthesamefunction.Proteinsevolve,andtheyevolvebychangesintheiraminoacidsequences.Conservativechanges,e.g.DforENonconservativechanges,e.g.DforA第5頁,共49頁，星期六，2024年，5月TheGeneticCodeEveryoneshouldatleastbefamiliarwithhowtoreadthefollowingtableandconvertagenesequencetoaproteinsequence.threenucleotidescodeforoneaminoacidinaprotein(43=64),sothereisroomforredundancyinthegeneticcodemRNAcodonwritten5′to3′第6頁,共49頁，星期六，2024年，5月

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（一）蛋白質(zhì)的相對分子量蛋白質(zhì)是生命大分子物質(zhì)，其分子量很大，從一萬到幾百萬或更大。利用測小分子法不可能。第7頁,共49頁，星期六，2024年，5月一、由化學組成測定最低分子量如血紅蛋白：55.84（Fe)×（100/0.34）(含量）×4（個數(shù)）＝67000第8頁,共49頁，星期六，2024年，5月二、物化法測定蛋白質(zhì)分子量：測擴散系數(shù)、滲透壓、光散射、沉降超離心、凝膠過濾、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。第9頁,共49頁，星期六，2024年，5月最準確可靠的方法是超離心法（Svedberg于1940年設計）：蛋白質(zhì)顆粒在25~50*104g離心力作用下從溶液中沉降下來。沉降系數(shù)（s）：單位（cm）離心場里的沉降速度。

s=————vω2xv=沉降速度（dx/dt）ω=離心機轉(zhuǎn)子角速度（弧度/s）

x=蛋白質(zhì)界面中點與轉(zhuǎn)子中心的距離（cm）沉降系數(shù)的單位常用S，1S=1×10-13（s）第10頁,共49頁，星期六，2024年，5月原理：－－顆粒：沉降－擴散，大顆粒沉降快，小顆粒慢，分離，檢測。第11頁,共49頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)分子量（M）與沉降系數(shù)（s）的關系M=——————RTsD（1－Vρ）R——氣體常數(shù)（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T——絕對溫度D——擴散常數(shù)（蛋白質(zhì)分子量很大，離心機轉(zhuǎn)速很快，則忽略不計）V——蛋白質(zhì)的微分比容（m3·g-1）ρ——溶劑密度（20℃，g·ml-1）

s——沉降系數(shù)第12頁,共49頁，星期六，2024年，5月

由于蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈上存在游離的氨基和游離的羧基，因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離的性質(zhì)，因而也具有特定的等電點。？等電點兩性解離比氨基酸復雜：可解離的側(cè)鏈R基；對結(jié)合蛋白質(zhì)，輔基部分含可解離基團。（二）蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點蛋白質(zhì)在其等電點偏酸溶液中帶正電荷，在偏堿溶液中帶負電荷，在等電點pH時為兩性離子。第13頁,共49頁，星期六，2024年，5月第14頁,共49頁，星期六，2024年，5月膠體定義：質(zhì)點分散系統(tǒng)蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑已達1－100nm，處于膠體顆粒的范圍。因此，蛋白質(zhì)具有親水溶膠的性質(zhì)。穩(wěn)定蛋白質(zhì)親水溶膠的兩個重要因素：－蛋白質(zhì)分子表面的水化膜（分子表面極性R基而結(jié)合的一層水分子）－表面電荷（同樣pH下，電荷相排斥）－－－蛋白質(zhì)不會聚集沉淀（三）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)第15頁,共49頁，星期六，2024年，5月布郎運動、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過半透膜，具有吸附能力蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因：1）表面形成水膜（水化層）；

2）帶相同電荷。++++++第16頁,共49頁，星期六，2024年，5月（四）蛋白質(zhì)的沉淀反應1.加高濃度鹽類（鹽析）：加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出。分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)2SO4)。2.加有機溶劑3.加重金屬鹽第17頁,共49頁，星期六，2024年，5月穩(wěn)定是暫時有條件的。在某些物理或化學因素的作用下，蛋白質(zhì)嚴格的空間結(jié)構被破壞（不包括肽鍵的斷裂），從而引起蛋白質(zhì)若干理化性質(zhì)和生物學性質(zhì)的改變，稱為蛋白質(zhì)的變性。（五）蛋白質(zhì)的變性和凝固第18頁,共49頁，星期六，2024年，5月第19頁,共49頁，星期六，2024年，5月

天然蛋白質(zhì)受物理或化學因素的影響，其共價鍵不變，但分子內(nèi)部原有的高度規(guī)律性的空間排列發(fā)生變化，致使其原有性質(zhì)發(fā)生部分或全部喪失，稱為蛋白質(zhì)的變性。

變性蛋白質(zhì)主要標志是生物學功能的喪失。溶解度降低，易形成沉淀析出，結(jié)晶能力喪失，分子形狀改變，肽鏈松散，反應基團增加，易被酶消化。第20頁,共49頁，星期六，2024年，5月第21頁,共49頁，星期六，2024年，5月

蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀。變性后的蛋白質(zhì)由于疏水基團的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白質(zhì)不一定都是變性后的蛋白質(zhì)。加熱使蛋白質(zhì)變性并凝聚成塊狀稱為凝固。(變性蛋白質(zhì)分子互相凝集為固體的現(xiàn)象稱凝固。)因此，凡凝固的蛋白質(zhì)一定發(fā)生變性。沉淀和凝固第22頁,共49頁，星期六，2024年，5月引起蛋白質(zhì)變性的因素有：

①物理因素：高溫、高壓、紫外線、電離輻射、超聲波等；②化學因素：強酸、強堿、有機溶劑、重金屬鹽等。第23頁,共49頁，星期六，2024年，5月①物理性質(zhì)：溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化學性質(zhì)：官能團反應性增加，易被蛋白酶水解。③生物學性質(zhì)：原有生物學活性喪失，抗原性改變。第24頁,共49頁，星期六，2024年，5月

蛋白質(zhì)變性的可逆性：－－蛋白質(zhì)在體外變性后，絕大多數(shù)情況下是不能復性的；－－如變性程度淺，蛋白質(zhì)分子的構象未被嚴重破壞；或者蛋白質(zhì)具有特殊的分子結(jié)構，并經(jīng)特殊處理則可以復性。第25頁,共49頁，星期六，2024年，5月核糖核酸酶的變性與復性

第26頁,共49頁，星期六，2024年，5月（六）紫外吸收性質(zhì)可采用紫外分分光度法測定蛋白質(zhì)的含量。原理第27頁,共49頁，星期六，2024年，5月組成天然蛋白質(zhì)分子的20種氨基酸，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸對紫外光有光吸收。其吸收峰在280nm左右。各種蛋白質(zhì)中這幾種氨基酸含量差別小。？含量特別，核酸干擾：280/260nm吸收差法第28頁,共49頁，星期六，2024年，5月（八）成鹽反應R—CH—COOH+HClNH2R—CH—COOHNH2·HCl（九）?；蜔N基化反應R—CH—COOH+RX′NH2R=?；驘N基′R—CH—COOH+HX′NHRX=鹵素（Cl、F）第29頁,共49頁，星期六，2024年，5月反應名稱試劑顏色反應有關基團有此反應的蛋白質(zhì)或氨基酸雙縮脲反應NaOH、CuSO2紫色或粉紅色二個以上肽鍵所有蛋白質(zhì)米倫反應HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物紅色

Tyr黃色反應濃HNO3及NH3黃色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反應(Hopking-Cole反應)乙醛酸試劑及濃H2SO4紫色

Trp坂口反應(Sakaguchi反應)α-萘酚、NaClO紅色胍基Arg酚試劑反應(Folin-Cioculteu反應)堿性CuSO4及磷鎢酸-鉬酸藍色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反應茚三酮藍色自由氨基及羧基α-氨基酸

（七）蛋白質(zhì)的顏色反應—OHN第30頁,共49頁，星期六，2024年，5月（十）成酯反應R—CH—COOH+C2H5OHNH2R—CH—COOC2H5NH2HCl氣當羧基變成乙酯后，羧基的化學性質(zhì)就被掩蔽了，而氨基的化學性質(zhì)就突出地顯示出來。（十一）酰氯化反應Y—NH—CRH—COOH+PCl5酰化氨基酸Y—NH—CRH—COCl?；被Ｂ仁拱被岬聂然罨?，易于另一氨基酸的氨基結(jié)合，在合成肽的工作上常用。第31頁,共49頁，星期六，2024年，5月（十二）成酰胺反應H2N—CHR—COOC2H5+HNH2體外無水H2N—CHR—CONH2+C2H5OH氨基酸酰胺有機體內(nèi)：Asp（Glu）+NH4+Asn（Gln）Asn（Gln）合成酶ATP（十三）脫羧反應H2N—CHR—COOH脫羧酶CO2+RCH2NH2胺第32頁,共49頁，星期六，2024年，5月（十四）迭氮反應H2N-CHR-COOHYHN-CHR-COOH?；被醂HN-CHR-COOCH3酰化氨基酸甲酯NH2NH2（-CH3OH）YHN—CHR—CO—NH—NH2?；被岬碾卵苌颒NO2YHN—CHR—CON3+2H2O酰化氨基酸迭氮第33頁,共49頁，星期六，2024年，5月

蛋白質(zhì)的分析測定目的蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)純度分子量方法凱氏定氮法電泳電泳雙縮脲法質(zhì)譜凝膠色譜

Folin-phenol法色譜質(zhì)譜

UV吸收法

Coomassieblue法

第34頁,共49頁，星期六，2024年，5月第35頁,共49頁，星期六，2024年，5月第36頁,共49頁，星期六，2024年，5月原理：消化氮--無機氮—測氮—計算蛋白含量操作：蛋白質(zhì)+H2SO4

（消化）---

NH4

+加上OH-,蒸餾出NH3

收集到非揮發(fā)性的標準酸中,然后返滴定凱氏定氮法(1883)

第37頁,共49頁，星期六，2024年，5月優(yōu)點:對所有蛋白質(zhì)的測量都是一致的(幾乎全部)消化樣品不要可溶缺點:裝置需要大量的樣品.耗時,繁瑣.不是檢測蛋白質(zhì)–而是檢測N(核酸和硫酸銨鹽是嚴重的污染物).由于缺乏專一性需要校正。

(假定蛋白質(zhì)含16%的氮,沒有其它NH4

+的主要來源物存在)第38頁,共49頁，星期六，2024年，5月雙縮脲法（1935）原理:

兩個或者以上的肽鍵(雙縮脲是一種兩個尿素分子共用一個氮原子形成的化合物–與二價銅離子形成紫紅色絡合物)

操作：肽+Cu2+(堿性條件下)

肽*Cu++-紅色.在A540/560nm測量。繪制標準曲線，計算。第39頁,共49頁，星期六，2024年，5月顏色反應原理實例雙縮脲反應是兩分子尿素經(jīng)加熱放出一分子NH3而得到的產(chǎn)物。凡含有兩個或以上肽鍵結(jié)構的化合物都具有此反應。第40頁,共49頁，星期六，2024年，5月優(yōu)點:簡便，快速專一不受蛋白質(zhì)特異性影響缺點:靈敏度較低必須繪制標準曲線所需樣品量大

(0.2—1.7mg/ml)第41頁,共49頁，星期六，2024年，5月Folin-phenol法(Lowry,1951)原理:

肽*Cu++---在堿性條件下被磷鎢酸/磷鉬酸催化氧化--變成藍色（鎢藍和鉬藍），藍色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比。操作：配試劑