β-細辛醚對谷氨酸所致PC12細胞損傷的保護作用

1/1β-細辛醚對谷氨酸所致PC12細胞損傷的保護作用-細辛醚對谷氨酸所致PC12細胞損傷的保護作用作者：

陳奕芝,方永奇,梁毅,王綺雯,何玉萍【摘要】目的研究-細辛醚對谷氨酸所誘導的PC12細胞損傷的保護作用,并探討其作用機理。

方法用谷氨酸造成PC12細胞損傷模型,觀察-細辛醚對其細胞形態(tài)、損傷程度、存活力、鈣離子濃度和細胞凋亡的影響。

結(jié)果10mmol/L谷氨酸作用PC12細胞16h,出現(xiàn)明顯損傷,凋亡率和死亡率升高,培養(yǎng)上清液中LDH含量增加；7.5、15、30g/mL-細辛醚可有效改善谷氨酸損傷引起的PC12細胞形態(tài)改變,提高細胞存活力,減少乳酸脫氫酶滲漏；15、30g/mL-細辛醚能明顯降低谷氨酸引起的PC12細胞內(nèi)鈣離子濃度和細胞凋亡率。

結(jié)論-細辛醚對谷氨酸所致PC12細胞損傷具有保護作用,其作用機制可能與鈣拮抗作用有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】PC12細胞；谷氨酸；鈣；-細辛醚Abstract：

ObjectiveTostudytheprotectiveeffectsof-asaroneonPC12cellsdamageinducedbyGlutamate.MethodTheeffectsof-asaroneonPC12cellsafterGlutamateintoxicationonmorphology,extentofdamage,livability,intracellularcalciumconcentrationandapoptosisratiowereobserved.ResultMorphologicalchanges,LDHleakageandintracellularcalciumconcentrationincreasing,andcellsurvivaldecreasingwereobservedinPC12cellsexposuredtoGlutamate.7.5,15,30g/mL-asaronecanincreasecellsurvival,decreaseLDHleakage.15,30g/mL-asaronecanreduceintracellularcalciumconcentrationandapoptosisratio.Conclusion-asaronepreventsthetoxicityofGlutamate,anditmaybeattributetoitseffectofanticalcium.Keywords：

PC12cells；Glutamate；Ca2+；-asarone本實驗采用體外培養(yǎng)PC12細胞方法,用谷氨酸(Glu)造成損傷模型,觀察-細辛醚對PC12細胞形態(tài)學、細胞活力、乳酸脫氫酶(LDH)活性、細胞內(nèi)游離鈣和細胞凋亡率的影響。

1實驗材料1.1細胞、藥物和試劑高分化PC12細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所。

Glu為Amresco產(chǎn)品；高糖DMEM粉劑培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清、0.25%胰酶均為GIBCO產(chǎn)品；噻唑藍(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品；磷酸緩沖液(PBS)、二甲基亞砜(DMSO)為北京鼎國產(chǎn)品；Annexinv-FITC試劑盒購自晶美生物工程有限公司；Fluo-3/AM為BiotiumInc產(chǎn)品；LDH試劑盒購自南京建成生物工程研究所；細胞培養(yǎng)板為CORNING產(chǎn)品。

-細辛醚的制備由本中心完成,純度99.44%。

臨用前稱取適量-細辛醚與吐溫-80及甘油,以1∶1∶1充分混勻后加滅菌雙蒸水配成終濃度為10mg/mL-細辛醚溶液,用時培養(yǎng)基稀釋至所需終濃度。

1.2主要儀器設(shè)備CO2培養(yǎng)箱(NUAIK)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)；BIO-RAD550型酶標儀；ALTRAEPICS流式細胞儀(BECKMANCOULTER)；6010紫外可見分光光度計(惠普上海分析儀器有限公司)。

2實驗方法2.1造模復蘇后的PC12細胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)液為含5%馬血清、5%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

待細胞長滿單層,0.25%胰酶消化,用含血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化并調(diào)細胞密度為5104個/mL,接種在96孔培養(yǎng)板(棄去四周邊孔),每孔100L,四周邊孔每孔加入等體積PBS溶液,待細胞貼壁生長交叉成網(wǎng)后用于實驗。

實驗分為正常對照組、Glu(0.3～76.8mmol/L)損傷組,繼續(xù)培養(yǎng)16h后觀察細胞形態(tài)改變,并用MTT法檢測細胞活力。

2.2藥物保護實驗PC12細胞接種于96孔(每孔100L)及24孔培養(yǎng)板(每孔1mL),培養(yǎng)條件同上,待細胞鋪滿單層,吸棄原培養(yǎng)基,用PBS液洗1次,隨機分為6組。

正常對照組和Glu損傷組加入無血清培養(yǎng)基,陽性對照組加入終濃度為10mol/L尼莫地平,-細辛醚設(shè)3個劑量組,分別為7.5、15、30g/mL,培養(yǎng)4h后,除正常對照組外,其余各組蕩洗后加入終濃度為10mmol/L的Glu繼續(xù)培養(yǎng)16h,用于各指標檢測。

2.3觀察指標細胞形態(tài)學觀察、存活力(MTT法)、培養(yǎng)上清液LDH活性(比色法)、凋亡率和胞內(nèi)鈣離子濃度(流式細胞儀熒光染色法)。

2.4統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)以xs表示,采用SPSS11.0軟件包分析,組間比較采用單因素方差分析。

3結(jié)果3.1谷氨酸對PC12細胞的損傷作用PC12細胞培養(yǎng)2h后完全貼壁,呈神經(jīng)細胞樣形態(tài),圓形,折光性較強,生長速度快,2d后生長成網(wǎng)狀。

PC12細胞經(jīng)不同濃度Glu作用16h后,0.3～4.8mmol/LGlu對PC12細胞形態(tài)學和細胞活力沒有明顯變化,而9.6～76.8mmol/LGlu則對PC12細胞有不同程度的損傷,表現(xiàn)為細胞變圓、皺縮,部分貼壁不良、脫落,裂解成碎片,折光度下降,細胞活力也明顯下降,且呈劑量依賴關(guān)系,故本實驗選用10mmol/LGlu為造模濃度(見表1)。

尼莫地平及-細辛醚預(yù)孵育4h,其細胞形態(tài)無明顯變化。

表1不同濃度Glu對PC12細胞活力的影響(略)注：

與正常對照組比較,*P0.001。

3.2-細辛醚對造模PC12細胞活力、谷氨酸的影響(見表2)表2-細辛醚對造模PC12細胞活力和LDH的影響（略）注：

與正常對照組比較,*P0.01,**P0.001；與Glu組比較,△P0.01,△△P0.001(下同)。

3.3-細辛醚對造模PC12細胞凋亡率、胞漿游離鈣的影響(見表3)表3-細辛醚對造模PC12細胞凋亡和細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響(略)4討論PC12細胞株來源于大鼠的腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞,生長迅速、穩(wěn)定,不易發(fā)生自動轉(zhuǎn)化,可建立能傳代的二倍體細胞系[1]。

其細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能皆類似于神經(jīng)細胞,成為近年來研究神經(jīng)細胞遞質(zhì)合成、儲存和釋放、離子通道規(guī)律及受體的細胞模型[2]。

Glu是一種中樞興奮性氨基酸遞質(zhì),過量的Glu可促使突觸前過量的蛋白激酶C(PKC)向細胞膜轉(zhuǎn)移并活化,從而過度激活突觸后膜的Glu受體NMDA受體,促使Ca2+內(nèi)流。

細胞內(nèi)Ca2+濃度上升又可激活細胞內(nèi)的硫蛋白酶(calpin-I),引起細胞內(nèi)骨架蛋白-fordrin降解,使膜上Glu結(jié)合位點數(shù)量明顯增加,導致胞內(nèi)Ca2+超載,出現(xiàn)遲發(fā)性損害[3]。

本實驗用Glu造成PC12細胞損傷,通過觀察和檢測細胞形態(tài)學、細胞存活力、LDH釋放量以及細胞凋亡和細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化,探討-細辛醚對PC12細胞Glu損傷的保護作用及其作用機理。

本研究結(jié)果表明,PC12細胞受到Glu損傷后,細胞存活率降低、LDH漏出率升高、細胞凋亡率和死亡率升高、細胞內(nèi)鈣離子濃度升高；-細辛醚能提高細胞存活率、降低LDH漏出率、抑制細胞凋亡和死亡、降低細胞內(nèi)鈣離子濃度。

-細辛醚與PC12細胞預(yù)溫育4h,可選擇性降低Glu引起的細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的異常升高,抑制細胞凋亡,這可能是-細辛醚能特異性且劑量依賴性地抑制Glu與其受體相結(jié)合,從而抑制受體門控鈣通道的開放,減少胞外游離鈣進入細胞內(nèi),減輕Glu的興奮性毒性有關(guān),從分子水平上初步闡明了-細辛醚對興奮性神經(jīng)毒的保護作用機制。

興奮性氨基酸對神經(jīng)細胞的損傷作用總是伴隨著鈣超載現(xiàn)象,筆者認為,-細辛醚對Glu引起的PC12細胞損傷的保護作用可能與其鈣拮抗作用有關(guān)。

【參考文獻】[1]張均田,張慶柱.神經(jīng)藥理學研究技術(shù)與方法[M].第2版.北京：

人民衛(wèi)生出版社,2005.9.[2]ShafterTJ,AtchisonWD.Transmitter,ionchannelandreceptorpropertiesofPC12cells：

amodelforneurotoxicologicalst