β-細(xì)辛醚對(duì)谷氨酸所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

1/1β-細(xì)辛醚對(duì)谷氨酸所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用-細(xì)辛醚對(duì)谷氨酸所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用作者：

陳奕芝,方永奇,梁毅,王綺雯,何玉萍【摘要】目的研究-細(xì)辛醚對(duì)谷氨酸所誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,并探討其作用機(jī)理。

方法用谷氨酸造成PC12細(xì)胞損傷模型,觀察-細(xì)辛醚對(duì)其細(xì)胞形態(tài)、損傷程度、存活力、鈣離子濃度和細(xì)胞凋亡的影響。

結(jié)果10mmol/L谷氨酸作用PC12細(xì)胞16h,出現(xiàn)明顯損傷,凋亡率和死亡率升高,培養(yǎng)上清液中LDH含量增加；7.5、15、30g/mL-細(xì)辛醚可有效改善谷氨酸損傷引起的PC12細(xì)胞形態(tài)改變,提高細(xì)胞存活力,減少乳酸脫氫酶滲漏；15、30g/mL-細(xì)辛醚能明顯降低谷氨酸引起的PC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和細(xì)胞凋亡率。

結(jié)論-細(xì)辛醚對(duì)谷氨酸所致PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與鈣拮抗作用有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】PC12細(xì)胞；谷氨酸；鈣；-細(xì)辛醚Abstract：

ObjectiveTostudytheprotectiveeffectsof-asaroneonPC12cellsdamageinducedbyGlutamate.MethodTheeffectsof-asaroneonPC12cellsafterGlutamateintoxicationonmorphology,extentofdamage,livability,intracellularcalciumconcentrationandapoptosisratiowereobserved.ResultMorphologicalchanges,LDHleakageandintracellularcalciumconcentrationincreasing,andcellsurvivaldecreasingwereobservedinPC12cellsexposuredtoGlutamate.7.5,15,30g/mL-asaronecanincreasecellsurvival,decreaseLDHleakage.15,30g/mL-asaronecanreduceintracellularcalciumconcentrationandapoptosisratio.Conclusion-asaronepreventsthetoxicityofGlutamate,anditmaybeattributetoitseffectofanticalcium.Keywords：

PC12cells；Glutamate；Ca2+；-asarone本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞方法,用谷氨酸(Glu)造成損傷模型,觀察-細(xì)辛醚對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞活力、乳酸脫氫酶(LDH)活性、細(xì)胞內(nèi)游離鈣和細(xì)胞凋亡率的影響。

1實(shí)驗(yàn)材料1.1細(xì)胞、藥物和試劑高分化PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

Glu為Amresco產(chǎn)品；高糖DMEM粉劑培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清、0.25%胰酶均為GIBCO產(chǎn)品；噻唑藍(lán)(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品；磷酸緩沖液(PBS)、二甲基亞砜(DMSO)為北京鼎國產(chǎn)品；Annexinv-FITC試劑盒購自晶美生物工程有限公司；Fluo-3/AM為BiotiumInc產(chǎn)品；LDH試劑盒購自南京建成生物工程研究所；細(xì)胞培養(yǎng)板為CORNING產(chǎn)品。

-細(xì)辛醚的制備由本中心完成,純度99.44%。

臨用前稱取適量-細(xì)辛醚與吐溫-80及甘油,以1∶1∶1充分混勻后加滅菌雙蒸水配成終濃度為10mg/mL-細(xì)辛醚溶液,用時(shí)培養(yǎng)基稀釋至所需終濃度。

1.2主要儀器設(shè)備CO2培養(yǎng)箱(NUAIK)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)；BIO-RAD550型酶標(biāo)儀；ALTRAEPICS流式細(xì)胞儀(BECKMANCOULTER)；6010紫外可見分光光度計(jì)(惠普上海分析儀器有限公司)。

2實(shí)驗(yàn)方法2.1造模復(fù)蘇后的PC12細(xì)胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)液為含5%馬血清、5%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

待細(xì)胞長滿單層,0.25%胰酶消化,用含血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化并調(diào)細(xì)胞密度為5104個(gè)/mL,接種在96孔培養(yǎng)板(棄去四周邊孔),每孔100L,四周邊孔每孔加入等體積PBS溶液,待細(xì)胞貼壁生長交叉成網(wǎng)后用于實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、Glu(0.3～76.8mmol/L)損傷組,繼續(xù)培養(yǎng)16h后觀察細(xì)胞形態(tài)改變,并用MTT法檢測細(xì)胞活力。

2.2藥物保護(hù)實(shí)驗(yàn)PC12細(xì)胞接種于96孔(每孔100L)及24孔培養(yǎng)板(每孔1mL),培養(yǎng)條件同上,待細(xì)胞鋪滿單層,吸棄原培養(yǎng)基,用PBS液洗1次,隨機(jī)分為6組。

正常對(duì)照組和Glu損傷組加入無血清培養(yǎng)基,陽性對(duì)照組加入終濃度為10mol/L尼莫地平,-細(xì)辛醚設(shè)3個(gè)劑量組,分別為7.5、15、30g/mL,培養(yǎng)4h后,除正常對(duì)照組外,其余各組蕩洗后加入終濃度為10mmol/L的Glu繼續(xù)培養(yǎng)16h,用于各指標(biāo)檢測。

2.3觀察指標(biāo)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、存活力(MTT法)、培養(yǎng)上清液LDH活性(比色法)、凋亡率和胞內(nèi)鈣離子濃度(流式細(xì)胞儀熒光染色法)。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以xs表示,采用SPSS11.0軟件包分析,組間比較采用單因素方差分析。

3結(jié)果3.1谷氨酸對(duì)PC12細(xì)胞的損傷作用PC12細(xì)胞培養(yǎng)2h后完全貼壁,呈神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài),圓形,折光性較強(qiáng),生長速度快,2d后生長成網(wǎng)狀。

PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度Glu作用16h后,0.3～4.8mmol/LGlu對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞活力沒有明顯變化,而9.6～76.8mmol/LGlu則對(duì)PC12細(xì)胞有不同程度的損傷,表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、皺縮,部分貼壁不良、脫落,裂解成碎片,折光度下降,細(xì)胞活力也明顯下降,且呈劑量依賴關(guān)系,故本實(shí)驗(yàn)選用10mmol/LGlu為造模濃度(見表1)。

尼莫地平及-細(xì)辛醚預(yù)孵育4h,其細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。

表1不同濃度Glu對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響(略)注：

與正常對(duì)照組比較,*P0.001。

3.2-細(xì)辛醚對(duì)造模PC12細(xì)胞活力、谷氨酸的影響(見表2)表2-細(xì)辛醚對(duì)造模PC12細(xì)胞活力和LDH的影響（略）注：

與正常對(duì)照組比較,*P0.01,**P0.001；與Glu組比較,△P0.01,△△P0.001(下同)。

3.3-細(xì)辛醚對(duì)造模PC12細(xì)胞凋亡率、胞漿游離鈣的影響(見表3)表3-細(xì)辛醚對(duì)造模PC12細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響(略)4討論P(yáng)C12細(xì)胞株來源于大鼠的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞,生長迅速、穩(wěn)定,不易發(fā)生自動(dòng)轉(zhuǎn)化,可建立能傳代的二倍體細(xì)胞系[1]。

其細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能皆類似于神經(jīng)細(xì)胞,成為近年來研究神經(jīng)細(xì)胞遞質(zhì)合成、儲(chǔ)存和釋放、離子通道規(guī)律及受體的細(xì)胞模型[2]。

Glu是一種中樞興奮性氨基酸遞質(zhì),過量的Glu可促使突觸前過量的蛋白激酶C(PKC)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移并活化,從而過度激活突觸后膜的Glu受體NMDA受體,促使Ca2+內(nèi)流。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升又可激活細(xì)胞內(nèi)的硫蛋白酶(calpin-I),引起細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白-fordrin降解,使膜上Glu結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量明顯增加,導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+超載,出現(xiàn)遲發(fā)性損害[3]。

本實(shí)驗(yàn)用Glu造成PC12細(xì)胞損傷,通過觀察和檢測細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞存活力、LDH釋放量以及細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化,探討-細(xì)辛醚對(duì)PC12細(xì)胞Glu損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)理。

本研究結(jié)果表明,PC12細(xì)胞受到Glu損傷后,細(xì)胞存活率降低、LDH漏出率升高、細(xì)胞凋亡率和死亡率升高、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高；-細(xì)辛醚能提高細(xì)胞存活率、降低LDH漏出率、抑制細(xì)胞凋亡和死亡、降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。

-細(xì)辛醚與PC12細(xì)胞預(yù)溫育4h,可選擇性降低Glu引起的細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的異常升高,抑制細(xì)胞凋亡,這可能是-細(xì)辛醚能特異性且劑量依賴性地抑制Glu與其受體相結(jié)合,從而抑制受體門控鈣通道的開放,減少胞外游離鈣進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),減輕Glu的興奮性毒性有關(guān),從分子水平上初步闡明了-細(xì)辛醚對(duì)興奮性神經(jīng)毒的保護(hù)作用機(jī)制。

興奮性氨基酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用總是伴隨著鈣超載現(xiàn)象,筆者認(rèn)為,-細(xì)辛醚對(duì)Glu引起的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與其鈣拮抗作用有關(guān)。

【參考文獻(xiàn)】[1]張均田,張慶柱.神經(jīng)藥理學(xué)研究技術(shù)與方法[M].第2版.北京：

人民衛(wèi)生出版社,2005.9.[2]ShafterTJ,AtchisonWD.Transmitter,ionchannelandreceptorpropertiesofPC12cells：

amodelforneurotoxicologicalst