RNA干擾技術(shù)抑制人內(nèi)皮細(xì)胞非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA（MYH9）表達(dá)的研究

1/1RNA干擾技術(shù)抑制人內(nèi)皮細(xì)胞非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA（MYH9）表達(dá)的研究RNA干擾技術(shù)抑制人內(nèi)皮細(xì)胞非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA（MYH9）表達(dá)的研究作者：

黃婭琳,寇俊萍,宋佳希,余伯陽(yáng)【摘要】目的:構(gòu)建人MYH9（非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA）的siRNA表達(dá)體系,抑制原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）MYH9基因的表達(dá)。

方法:針對(duì)人MYH9基因序列,構(gòu)建siRNA表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)酶切和測(cè)序鑒定確定其序列正確性。

分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGCsiMYH91/2/3至HUVEC細(xì)胞,通過(guò)半定量RTPCR和蛋白質(zhì)印跡,分別檢測(cè)在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72hMYH9在mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)的變化。

結(jié)果:在構(gòu)建的3種重組質(zhì)粒中,pGCsiMYH92、pGCsiMYH93在轉(zhuǎn)染后24h均表現(xiàn)出一定的干擾作用,轉(zhuǎn)染后48h干擾作用最強(qiáng),轉(zhuǎn)染后72h干擾作用減弱;pGCsiMYH93的干擾作用最明顯,轉(zhuǎn)染后48h,能明顯下調(diào)HUVEC的MYH9蛋白表達(dá),抑制率平均可達(dá)71.2%,此時(shí)MYH9基因mRNA轉(zhuǎn)錄明顯減少,抑制率為86.5%。

結(jié)論:在轉(zhuǎn)染后48hpGCsiMYH93可明顯抑制HUVEC細(xì)胞內(nèi)源MYH9的表達(dá),為進(jìn)一步研究MYH9在相關(guān)疾病中的功能奠定基礎(chǔ)。

AIM:ToconstructtheexpressionvectorofsmallhairpinRNA(shRNA)andtoinvestigateitsefficacyinsilencingnonmusclemyosinheavychainⅡA(MYH9)gene.METHODS:AccordingtotheMYH9cDNAsequenceinGenBank,threeshRNAexpressionvectorstargetingMYH9genewereconstructedandwereconfirmedbydigestionwithrestrictionenzymesandDNAsequencing.TherecombinantplasmidsweretransfectedintoHUVECcells.TheexpressionofMYH9wasdeterminedbysemiquantitativeRTPCRatmRNAlevelandbywesternblottingatproteinlevelat24h,48hand72haftertransfection.RESULTS:ThedecreaseofMYH9expressionatmRNAandproteinlevelsgraduallybecamemoreevidentfrom24hto48h,andachievedthemaximaldegreeat48h,thenbecameweakenedandrestoredat72h.TheefficiencyofpGCsiMYH93wasthebestamongthesethreeplasmids.TheintroductionofpGCsiMYH93wasshowedtoefficientlyandspecificallyinhibittheexpressionofMYH9withinhibitoryrateat71.2%accordingtoresultsofWesternblot.RTPCRresultsshowedthatmRNAtranscriptionofMYH9genewasreducedby86.5%at48hafterintroductionofpGCsiMYH93.CONCLUSION:PlasmidpGCsiMYH93couldinhibitMYH9expressioninHUVECcellssuccessfullyandeffectively,whichpromiseditsfurtherapplicationinrelatedfunctionanalysisofMYH9.【關(guān)鍵詞】RNA干擾;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）;非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA（MYH9）非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA（nonmusclemyosinheavychainⅡA,NMHCⅡA,MYH9）是一種由人第22號(hào)染色體上的MYH9基因編碼的蛋白,它廣泛分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞,與胞質(zhì)分裂［1］、腫瘤轉(zhuǎn)移［2,3］、血小板活化和血栓形成［4］、血管收縮［5］等密切相關(guān)。

同時(shí),血管內(nèi)皮細(xì)胞在上述生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用,但有關(guān)MYH9在血管內(nèi)皮活化中的作用,尚未得到有效闡明。

而利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)可以較容易地制備特定基因缺失表型的個(gè)體,表達(dá)shRNA片段的RNAi載體可以在體內(nèi)外特異性高效抑制相關(guān)基因,方便快捷地研究該基因的功能［6-8］。

因此,本研究旨在構(gòu)建針對(duì)人MYH9基因的shRNA表達(dá)載體,篩選出抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）MYH9表達(dá)的最佳轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間,為進(jìn)一步研究MYH9的功能提供技術(shù)手段,為深入闡釋MYH9在血管內(nèi)皮細(xì)胞活化相關(guān)的心腦血管疾病、腫瘤轉(zhuǎn)移等重大疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法1.1材料M199培養(yǎng)基、胎牛血清、TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自Gibco公司。

pGCsilencerTMU6/neo/GFP/RNAi表達(dá)質(zhì)粒載體、陰性對(duì)照質(zhì)粒pGCsi.U6/neo/GFPNON、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒GAPDH/homo(H1/neo/GFP)均購(gòu)于上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)公司。

shRNA插入模板寡核苷酸由TaKaRa公司合成。

限制性內(nèi)切酶、連接酶、DNAMarker、PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自TaKaRa公司。

脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、DNA片段純化試劑盒、OPTIMEMI培養(yǎng)基、質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自Invitrogen公司。

內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ECGS）、兔抗人MYH9多抗購(gòu)自Sigma公司,其余抗體均購(gòu)自博士德公司。

BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天公司。

ECL試劑盒購(gòu)自Pierce公司。

1.2方法1.2.1MYH9shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建針對(duì)GenBank中MYH9基因的已知序列(NM_002473),選擇特異性shRNA靶位點(diǎn)序列,分別設(shè)計(jì)并合成3條shRNA插入模板寡核苷酸（表1）,退火后形成雙鏈的shRNA插入模板寡核苷酸。

分別將這3條shRNA寡核苷酸克隆到pGCsilencerTMU6/neo/GFP/RNAi表達(dá)載體,構(gòu)建成干擾質(zhì)粒pGCsiMYH91、pGCsiMYH92、pGCsiMYH93,分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5,用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提、純化,并用BamHI、HindⅢ雙酶切、測(cè)序鑒定。

表1MYH9基因的shRNA序列信息（略）Tab1SequencesofshRNAofMYH9gene1.2.2人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離、鑒定參照文獻(xiàn)［9］方法,分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,以添加200mL/L胎牛血清,40U/mL肝素,100U/mL青霉素,100mg/L鏈霉素及ECGS的M199培養(yǎng)基,37℃、50mL/LCO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟,采用Ⅷ因子免疫熒光染色、顯色,置熒光顯微鏡下觀察鑒定。

1.2.3干擾質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染將第2代HUVEC細(xì)胞按3105個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,當(dāng)細(xì)胞80%融合時(shí),參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū),按1∶2(g/L)比例,分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGCsiMYH91、pGCsiMYH92、pGCsiMYH93以及陰性對(duì)照質(zhì)粒pGCsi.U6/neo/GFPNON和干擾GAPDH表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒GAPDH/homo(H1/neo/GFP),37℃孵育6～7h后棄去培養(yǎng)基,用PBS洗滌細(xì)胞后,加入含血清和抗生素的M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4RTPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MYH9mRNA表達(dá)轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h,分別提取細(xì)胞RNA,并用Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄得cDNA。

利用MYH9和Actin特異引物（表2）擴(kuò)增cDNA條帶,PCR條件:94℃變性30s,55℃退火45s,72℃延伸45s,共30個(gè)循環(huán)。

擴(kuò)增產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,并利用GENEGENUS凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描,比較轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的細(xì)胞的MYH9基因在mRNA水平上的表達(dá)差異。

表2RTPCR引物序列（略）Tab2SequencesofprimersforRTPCR1.2.5Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MYH9蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h收集細(xì)胞,裂解,用BCA法蛋白定量后進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)［10］,取80g蛋白,經(jīng)100g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜條件:MYH9（100V恒壓轉(zhuǎn)膜70～80min）;Actin（100V恒壓轉(zhuǎn)膜50min）。

封閉液封閉后,分別用MYH9和Actin一抗4℃孵育過(guò)夜后,相應(yīng)二抗孵育2h,再用ECL試劑盒檢測(cè)。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SAS8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用方差分析各實(shí)驗(yàn)組之間的差別。

2結(jié)果2.1MYH9基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒的鑒定重組后的pGCsiMYH9表達(dá)質(zhì)粒同時(shí)具有限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ的酶切位點(diǎn),用BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后,電泳顯現(xiàn)約1.8kb和4.6kb的2條帶（圖1）,與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的模板寡核苷酸長(zhǎng)度相符。

質(zhì)粒用針對(duì)插入片段的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并測(cè)定PCR產(chǎn)物的DNA序列,測(cè)序結(jié)果（未附）與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的模板寡核苷酸序列相符,表明MYH9基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

而未重組對(duì)照質(zhì)粒由于只含有BamHⅠ單酶切位點(diǎn),不含HindⅢ酶切位點(diǎn),經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后,僅被BamHⅠ切成線性（圖1）。

圖1MYH9shRNA表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定（略）Fig1AGEanalysisofrecombinantplasmidpGCsiMYH9digestedwithBamHⅠandHindⅢM:DL2000DNAmarker;1:MYH9shRNAexpressionplasmid;2:MYH9shRNAexpressionplasmiddigestedbyBamHⅠandHindⅢ;3:UnrecombinantcontrolplasmiddigestedbyBamHⅠandHindⅢ.2.2干擾質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率初步檢測(cè)由于所用的表達(dá)質(zhì)粒帶有綠色熒光蛋白（GFP）基因,因此在檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞MYH9基因mRNA及蛋白表達(dá)水平之前,利用熒光顯微鏡觀察各轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率（以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組為對(duì)照）,有綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞陽(yáng)性率可達(dá)80%,表明干擾及對(duì)照質(zhì)粒可大量有效地進(jìn)入HUVEC細(xì)胞（圖2）。

圖2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞后48h的熒光顯微鏡觀察（略）Fig2ObservationofHUVECcellstransfectedwithrecombinationplasmidbyfluorescencemicroscope(48haftertransfection,200)2.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MYH9基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)以Actin為內(nèi)參,半定量RTPCR擴(kuò)增出MYH9基因特異條帶（圖3）。

光密度掃描結(jié)果表明,陰性對(duì)照質(zhì)粒pGCsi.U6/neo/GFPNON、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒GAPDH/homo(H1/neo/GFP)、干擾質(zhì)粒pGCsiMYH91與未轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞MYH9基因的mRNA表達(dá)量之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明pGCsiMYH91無(wú)效。

而在轉(zhuǎn)染后24h、48h,pGCsiMYH92、pGCsiMYH93對(duì)MYH9mRNA表達(dá)均有一定的抑制作用,其中pGCsiMYH93在48h時(shí)作用最強(qiáng)。

與陰性對(duì)照質(zhì)粒pGCsi.U6/neo/GFPNON轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染后48hpGCsiMYH93對(duì)MYH9基因mRNA表達(dá)的抑制率平均可達(dá)86.5%。

轉(zhuǎn)染后72h,MYH9基因mRNA表達(dá),與正常細(xì)胞的MYH9基因表達(dá)量之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4MYH9基因蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)圖4為蛋白印跡結(jié)果。

光密度掃描結(jié)果表明,陰性對(duì)照質(zhì)粒pGCsi.U6/neo/GFPNON、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒GAPDH/homo(H1/neo/GFP)、干擾質(zhì)粒pGCsiMYH91與未轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞的MYH9表達(dá)量之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

而干擾質(zhì)粒pGCsiMYH92和pGCsiMYH93在24h和48h時(shí)均對(duì)MYH9表達(dá)有一定的干擾作用,其中pGCsiMYH93在48h時(shí)干擾作用最強(qiáng),對(duì)MYH9表達(dá)的抑制率平均值可達(dá)71.2%,與半定量RTPCR所得的結(jié)論類似。

轉(zhuǎn)染后72h,pGCsiMYH93對(duì)MYH9表達(dá)的抑制率降為20%,仍高于轉(zhuǎn)染后72h的mRNA水平的抑制率,表明蛋白水平干擾效應(yīng)的消失稍滯后于mRNA水平。

3討論近年來(lái),國(guó)內(nèi)外大量研究表明MYH9（非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA）與細(xì)胞黏附［11,12］、細(xì)胞遷移［13］、腫瘤轉(zhuǎn)移［2,3］、動(dòng)脈粥樣硬化［14］、血小板黏附、血栓形成［4］等有著密切關(guān)系。

例如:Huang等發(fā)現(xiàn)MYH9可將病理狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞中的核仁素遷移到細(xì)胞表面,有助于核仁素在內(nèi)皮遷移和血管新生中發(fā)揮作用［2］。

Kohlstedt等發(fā)現(xiàn)MYH9能結(jié)合血管緊張素轉(zhuǎn)移酶（ACE）,并影響其磷酸化,從而調(diào)節(jié)血管收縮與舒張［5］。

Gachet等發(fā)現(xiàn)MYH9缺陷可引起血小板減少,MYH9在血小板黏附及血栓形成中發(fā)揮著重要作用［4］。

此外,Rho激酶介導(dǎo)的心血管疾病常常與MYH9磷酸化相關(guān)［15］,MYH9還介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等等［16］,但很多機(jī)制尚未完全闡明。

因此,剔除或降低其內(nèi)源性表達(dá),對(duì)進(jìn)一步深入研究MYH9的功能具有重要意義。

圖3pGCsiMYH91/2/3及對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞后RTPCR檢測(cè)（略）Fig3DeterminationofMYH9mRNAexpressionbysemiquantitativeRTPCRinHUVECcellstransfectedwithRNAiplamidsandtheircontrolplasmidsa,b:24haftertransfection;c,d:48haftertransfection;e,f:72haftertransfection.b,d,f:DataareshownasmeansSDforthreeseparateexperiments.*Plt;0.01significantlydifferentfromthenegativecontrolgroup.C:Fromcellsuntransfected;N:FromcellstransfectedwithnegativecontrolplasmidpGCsi.U6/neo/GFPNON;M1,M2,M3:FromcellstransfectedwithpGCsiMYH91,pGCsiMYH92,pGCsiMYH93,respectively;P:FromcellstransfectedwithpositivecontrolplasmidGAPDH/homo(H1/neo/GFP).圖4pGCsiMYH91/2/3轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞后的Westernblot分析（略）Fig4DeterminationofMYH9expressioninHUVECcellstransfectedwithRNAiplasmidsusingWesternblota:24haftertransfection;b:48haftertransfection;c:72haftertransfection.d:DataareshownasmeansSDforthreeseparateexperiments.*Plt;0.05,**Plt;0.01significantlydifferentfromtheM1group.M1,M2,M3:fromcellstransfectedwithpGCsiMYH91,pGCsiMYH92,pGCsiMYH93,respectively.RNAi是指在生物體內(nèi),外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA引起與其同源的mRNA特異性降解,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默。

由于RNAi技術(shù)具有高效、特異、簡(jiǎn)單易行、資金消耗少等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于蛋白功能的研究［6-8］。

利用RNAi技術(shù)抑制MYH9基因表達(dá)雖有個(gè)別文獻(xiàn)報(bào)道［2］,但未見(jiàn)詳細(xì)的抑制內(nèi)皮細(xì)胞MYH9表達(dá)的干擾質(zhì)粒載體的具體序列信息以及最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間等報(bào)道。

在本研究中,我們構(gòu)建了3種針對(duì)MYH9基因的siRNA表達(dá)體系,觀察其特異性抑制HUVEC細(xì)胞內(nèi)源目的基因MYH9的作用,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后24h,2號(hào)、3號(hào)干擾質(zhì)粒均表現(xiàn)出對(duì)MYH9表達(dá)一定的抑制作用。

隨后轉(zhuǎn)染效率逐漸增強(qiáng),在轉(zhuǎn)染后48h達(dá)到峰值,其中重組質(zhì)粒pGCsiMYH93干擾效果最強(qiáng),mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平抑制率分別為86.5%和71.2%,但隨后干擾作用逐漸降低,在轉(zhuǎn)染后72h,mRNA轉(zhuǎn)錄水平的干擾作用消失,但pGCsiMYH93在蛋白水平的干擾作用仍然有20%,表明蛋白水平干擾效應(yīng)的表現(xiàn)稍滯后于mRNA水平,提示在后續(xù)利用重組質(zhì)粒pGCsiMYH93沉寂MYH9基因,研究MYH9在相關(guān)疾病中的功能時(shí),應(yīng)該選用在干擾作用最強(qiáng)的48h左右進(jìn)行研究。

綜上所述,本研究成功構(gòu)建并篩選出了最佳干擾質(zhì)粒pGCsiMYH93,可明顯抑制HUVEC細(xì)胞中MYH9表達(dá),為進(jìn)一步研究MYH9在血管內(nèi)皮活化中的作用以及在心血管、腫瘤等相關(guān)疾病中的功能奠定了基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】［1］StraightAF,CheungA,LimouzeJ,etal.DissectingtemporalandspatialcontrolofcytokinesiswithamyosinIIInhibitor［J］.Science,2003,299(5613):1743-1747.［2］HuangYJ,ShiHB,ZhouH,etal.Theangiogenicfunctionofnucleolinismediatedbyvascularendothelialgrowthfactorandnonmusclemysion［J］.Blood,2006,107(9):3564-3571.［3］ObunguVH,BurnsAL,AgarwallSK,etal.Menin,atumorsuppressor,associateswithnonmusclemyosinⅡAheavychain［J］.Oncogene,2003,22(41):6347-6358.［4］LonC,EcklyA,HechlerB,etal.MegakaryocyterestrictedMYH9inactivationdramaticallyaffectshemostasiswhilepreservingplateletaggregationandsecretion［J］.Blood,2007,110(9):3183-3191.［5］KohlstedtK,KellnerR,BusseR,etal.SignalingviatheangiotensinconvertingenzymeresultsinthephosphorylationofthenonmusclemyosinheavychainⅡA［J］.MolPharmacol,2006,69(1):19-26.［6］閆歌,蒲丹,唐霓,等.RNA干擾技術(shù)對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)源survivin基因表達(dá)的影響［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2004,31(9):829-833.［7］吳元明,張曉楠,韓者藝,等.shRNA表達(dá)載體pWH1的構(gòu)建及用于HIF1基因的沉默［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2008,24(2):115-118.［8］杜昱蕾,尹芳,楊桂濤,等.MAD2RNA干擾載體的構(gòu)建及其對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2006,22（3）:290-292.［9］黃曉園,李科珍,莊亮,等.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及條件復(fù)制性腺病毒Adv5/dE1AAschk1對(duì)該細(xì)胞的殺傷作用［J］.癌癥,2007,26(9):977-982.［10］ZhuH,CaiC,ChenJ.SuppressionofPglycoproteingeneexpressioninHs578T/Doxbytheoverexpressionofcaveolin1［J］.