Proposal ProteomeLab LI溶液中蛋白質(zhì)相互作用分析2

/美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司溶液中蛋白質(zhì)相互作用分析系統(tǒng)溶液中蛋白質(zhì)相互作用分析系統(tǒng)美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司溶液中蛋白質(zhì)相互作用分析系統(tǒng)美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司推出的溶液中蛋白質(zhì)相互作用分析系統(tǒng)采用專利的分析超速離心(,)技術(shù)，是目前唯一一種利用物理學(xué)原理在模擬生理狀態(tài)下研究溶液中蛋白質(zhì)存在狀態(tài)的經(jīng)典技術(shù)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、生物制藥和高分子科學(xué)等研究領(lǐng)域，及之相關(guān)的論文已大量發(fā)表，并且國(guó)際上很多高水平的期刊往往要求提供分析超離表征蛋白特性的數(shù)據(jù)作為證據(jù)。分析系統(tǒng)主要應(yīng)用于以下領(lǐng)域：蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)相互作用：分析系統(tǒng)可用于研究溶液中蛋白質(zhì)間作用及否及其親和力，蛋白質(zhì)復(fù)合物不同組分的比例等；蛋白質(zhì)及小分子/核酸間的相互作用：分析系統(tǒng)可以幫助分析小分子及靶蛋白間的結(jié)合及蛋白質(zhì)及核酸間的結(jié)合；蛋白質(zhì)本身或其復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)：分析系統(tǒng)可測(cè)定蛋白質(zhì)的摩擦系數(shù)比()，進(jìn)而推斷蛋白質(zhì)本身或其復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)；蛋白質(zhì)修飾對(duì)空間結(jié)構(gòu)及相互作用的影響：通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)分子的沉降系數(shù)及擴(kuò)散系數(shù)，分析系統(tǒng)可用于分析蛋白質(zhì)在經(jīng)修飾后其空間結(jié)構(gòu)有無(wú)變化；不同條件下，蛋白質(zhì)亞基比例的測(cè)定（2或A2B4）：分析系統(tǒng)可測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)而擬合得到蛋白質(zhì)亞基的比例。僅能提供分子比，而不能鑒定真正的亞單位比例；蛋白質(zhì)在不同溶液條件下的自聚集現(xiàn)象：通過(guò)測(cè)定沉降系數(shù)、分子量及平衡常數(shù)，分析系統(tǒng)可用于分析不同溶液條件下的蛋白質(zhì)自聚集現(xiàn)象。只限于不同蛋白質(zhì)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，不能用于分子內(nèi)自我結(jié)合的研究；多種分子間的共同作用：分析系統(tǒng)可用于分析多種分子間的相互作用，并能檢測(cè)不同分子結(jié)合的比例；蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選：分析系統(tǒng)可檢測(cè)不同的值、離子濃度、溫度等條件下蛋白質(zhì)的存在狀態(tài)，從而確定有利于蛋白質(zhì)結(jié)晶的溶液條件；蛋白質(zhì)藥物的配方研究：分析系統(tǒng)可用于測(cè)定不同藥物配方中蛋白質(zhì)藥物的存在狀態(tài)，從而應(yīng)用于藥物的配方研究。溶液中蛋白質(zhì)相互作用分析系統(tǒng)基本原理分析系統(tǒng)備有紫外/可見(jiàn)光檢測(cè)系統(tǒng)和瑞利（）干涉光學(xué)系統(tǒng)，既保證了在低濃度條件下工作的靈敏度和建立在樣品最大光吸收基礎(chǔ)上優(yōu)化檢測(cè)的選擇性，又能夠測(cè)量由于樣品濃度改變導(dǎo)致的折射率的變化。這不僅提高了檢測(cè)精度，同時(shí)還可以對(duì)更多種類的樣品進(jìn)行更大濃度范圍的檢測(cè)。在高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的強(qiáng)大的離心力作用下，分子量或構(gòu)型不同的分子在溶液中的沉降系數(shù)不同。的控制系統(tǒng)會(huì)實(shí)時(shí)掃描分子的沉降過(guò)程，并根據(jù)掃描所取得的數(shù)據(jù)計(jì)算出分子的特性。分析超離的分析方法主要有沉降速率（）和沉降平衡（）兩種。沉降速率是一項(xiàng)流體動(dòng)力學(xué)技術(shù)。沉降速率實(shí)驗(yàn)中，樣品被高速旋轉(zhuǎn)，溶質(zhì)分子向樣品池底部移動(dòng)，通過(guò)記錄的數(shù)據(jù)來(lái)測(cè)定溶質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的速率。運(yùn)動(dòng)速率用沉降系數(shù)表示，它取決于分子量、分子形狀或構(gòu)象。對(duì)于不同組分的樣品，根據(jù)不同的沉降系數(shù)檢測(cè)每個(gè)組分。沉降平衡是一項(xiàng)熱力學(xué)技術(shù)。沉降平衡試驗(yàn)在較低的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行，當(dāng)沉降作用及擴(kuò)散作用達(dá)到平衡時(shí)測(cè)定分子平衡濃度的分布。在平衡狀態(tài)下，濃度的分布只決定于質(zhì)量而及分子的形狀無(wú)關(guān)。溶液中蛋白質(zhì)相互作用分析系統(tǒng)技術(shù)特點(diǎn)獨(dú)一無(wú)二的在溶液中鑒定蛋白質(zhì)的方法：由于是將蛋白質(zhì)放在相互作用而不是孤立的狀態(tài)中進(jìn)行研究，通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)的構(gòu)象（折疊或伸展）、聚集的可逆性（相互作用系統(tǒng)）、化學(xué)計(jì)量學(xué)（解離狀態(tài)）和異質(zhì)性（聚合狀態(tài)），更接近測(cè)定真實(shí)生理狀態(tài)下的蛋白質(zhì)；不需要標(biāo)準(zhǔn)品：的測(cè)量建立在熱力學(xué)和流體動(dòng)力學(xué)第一定律基礎(chǔ)上，不需要標(biāo)準(zhǔn)品或校正；非破壞性：樣品無(wú)需添加任何化學(xué)品，離心技術(shù)對(duì)樣品的聚集狀態(tài)及構(gòu)象沒(méi)有破壞性；可檢測(cè)真正的亞單位比例：及方法僅能提供分子比不同，可以鑒定2及A2B4（兩者同樣是1:2）間的差別；多種不同條件的檢測(cè)：可在不同的值、離子濃度、溫度等條件下檢測(cè)，而()的檢測(cè)受緩沖溶液的限制，樣品需溶于高鹽或有機(jī)溶劑，以消除蛋白質(zhì)及介質(zhì)間的非特異結(jié)合；實(shí)驗(yàn)成本極低：實(shí)驗(yàn)中不需要任何其他試劑或消耗品；實(shí)時(shí)在線檢測(cè)：生物分子在相互作用發(fā)生時(shí)即被檢測(cè)并采取數(shù)據(jù)；認(rèn)可方法：蛋白質(zhì)聚集是產(chǎn)品產(chǎn)生免疫性的主要原因，已成為檢測(cè)蛋白質(zhì)藥物非共價(jià)聚集的“金標(biāo)準(zhǔn)”。溶液中蛋白質(zhì)相互作用分析系統(tǒng)技術(shù)指標(biāo)轉(zhuǎn)速精度為20，精度最多樣品分離數(shù)量（同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）：21個(gè)樣品池選擇：2/6/8孔最少進(jìn)樣量：0.025最大產(chǎn)熱量少于1.0.(3,400.)計(jì)算機(jī)軟件控制，全自動(dòng)檢測(cè)數(shù)據(jù)收集及分析可提供多種沉降速率及沉降平衡實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析方法自動(dòng)計(jì)算樣品的分子量，沉降系數(shù)，分子結(jié)合/解離常數(shù)，擴(kuò)散系數(shù)，濃度等溶液中蛋白質(zhì)相互作用分析系統(tǒng)應(yīng)用舉例異結(jié)合系統(tǒng)研究a)蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)相互作用分析超離是研究溶液中蛋白質(zhì)間相互作用的重要檢測(cè)方法，通過(guò)追蹤生物大分子在離心場(chǎng)中的沉降，可檢測(cè)生物大分子在溶液狀態(tài)下的流體動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)，而無(wú)需將蛋白質(zhì)標(biāo)記或進(jìn)行其他化學(xué)修飾。沉降速率（）和沉降平衡（）實(shí)驗(yàn)均可用于研究蛋白質(zhì)間的相互作用，沉降平衡還可檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的親和力，測(cè)定的結(jié)合/解離常數(shù)范圍為10-3-10-8M。中科院生物物理所利用分析超離研究神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(3)及其受體P75(p75)間的相互作用。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（）是一類對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育、存活和凋亡起重要作用的蛋白質(zhì)，是治療神經(jīng)損傷等疾病的潛在藥物標(biāo)靶。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有兩種不同的膜蛋白受體，分別為P75和酪氨酸激酶受體()。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò)及這兩種受體相互作用調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育及凋亡。分析超離的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3、神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其受體p75以2:2的方式結(jié)合。3及p752:2的結(jié)合方式揭示了神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中375相互作用的活性狀態(tài)，有助于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及受體識(shí)別及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究，也為以神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為標(biāo)靶的藥物開(kāi)發(fā)提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。p75,3,,p75,3,,.a,p75;b,3;c,;d,375;e,75;f,p75b)小分子及蛋白質(zhì)相互作用分析超離（）可以幫助分析一個(gè)小分子是否及靶蛋白結(jié)合。廈門大學(xué)生命科學(xué)院分析（B）及孤核受體77的相互作用。核受體在許多生物過(guò)程（如：細(xì)胞增殖、分化、凋亡、新陳代謝及發(fā)育等）中起重要作用。孤核受體77、1和1屬于核受體亞家族4A(4A)，作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控靶基因的表達(dá)，但還未發(fā)現(xiàn)77的生理性配體。沉降平衡試驗(yàn)的結(jié)果顯示在320處有光吸收，由于分子量很小，不能沉降；如果結(jié)合到一個(gè)蛋白質(zhì)上，則在321波長(zhǎng)的吸收隨著被結(jié)合蛋白質(zhì)在對(duì)應(yīng)的分子量處沉降而下降。圖中及77混合物的吸收?qǐng)D有顯著的彎曲，說(shuō)明可及77相結(jié)合。該研究表明作為77的激動(dòng)劑，可特異性地結(jié)合到77的配基結(jié)合區(qū)并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄活性?？赡軙?huì)成為一種新的癌癥和低血糖癥的治療藥物，并為77的功能研究提供一種新的思路和方法。分析超離在潛在小分子藥物的研發(fā)中起重要作用。7777c)核酸及蛋白質(zhì)相互作用(R)是一種受干擾素誘導(dǎo)的激酶，在病毒感染初期的免疫反應(yīng)中起重要作用。真核起始因子2（2）的a亞基為的底物，2a的51位絲氨酸磷酸化阻滯了2的和結(jié)合狀態(tài)的循環(huán)，從而抑制蛋白質(zhì)合成的起始。因此，在病毒感染周期中產(chǎn)生的會(huì)激活，以此來(lái)抑制病毒和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成。研究分子，對(duì)于了解宿主抗病毒免疫信號(hào)通路的分子機(jī)制具有重要意義。下圖為利用沉降速率檢測(cè)20及不同濃度的結(jié)合情況：在加入后，沉降系數(shù)增大，且及蛋白質(zhì)濃度呈正相關(guān)，表明及蛋白質(zhì)相結(jié)合形成復(fù)合物。分析超離在研究蛋白質(zhì)及核酸的非特異性結(jié)合方面具有很大優(yōu)勢(shì)。g()1(),g()1(),0.5.(),1.(),2.()..2.自結(jié)合系統(tǒng)研究-分子內(nèi)相互作用沉降平衡或沉降速率實(shí)驗(yàn)均可用于檢測(cè)分子的自結(jié)合（）。分析超離可用于檢測(cè)分子在溶液狀態(tài)下的存在方式是否及晶體結(jié)構(gòu)一致。()是家族的成員，在調(diào)控細(xì)胞功能中起重要作用。沉降平衡試驗(yàn)結(jié)果顯示在溶液中的存在狀態(tài)主要是單體和二聚體，而未檢測(cè)到三聚體。在10μM濃度下，的單體和二體等量存在；而在低濃度(<1μM)下，主要以單體的形式存在，二聚體的存在比例及濃度相關(guān)（如下圖）。該研究表明，聚合狀態(tài)的轉(zhuǎn)換可能參及受體信號(hào)通路的調(diào)控。分析超速離心技術(shù)是在真正的液相中進(jìn)行檢測(cè)的方法，該技術(shù)還可檢測(cè)方法難以檢測(cè)到的分子復(fù)合物間弱的自聚合(）。.()()()a––(15,25,33K,).()(),(),().3．分子構(gòu)象的研究.()()()a––(15,25,33K,).()(),(),().分析超離是檢測(cè)生物分子在溶液中構(gòu)象發(fā)生改變的有效方法。下圖為利用分析超離研究和的結(jié)合對(duì)70.1構(gòu)象的影響。70.1分別及和結(jié)合后的沉降系數(shù)分析，70.1的沉降系數(shù)為4.40±0.03S；在存在的條件下，70.1的沉降系數(shù)為4.53±0.05S；存在的條件下，其沉降系數(shù)為4.72±0.03S。該結(jié)果表明，在及結(jié)合后，70.1的沉降系數(shù)有5%的增加（其他實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該變化并非由蛋白質(zhì)聚集引起）。因此，及相比，對(duì)70.1的構(gòu)象有較大影響。進(jìn)一步的研究表明結(jié)合引起的構(gòu)象變化是和相對(duì)位置改變的結(jié)果。沉降速率實(shí)驗(yàn)可通過(guò)測(cè)定沉降系數(shù)用以分析蛋白質(zhì)以及相互作用的生物大分子的形狀及構(gòu)象的變化。s20.s20,,as020.70.14.40±0.03S,70.14.72±0.02S70.14.53±0.05S.4.結(jié)合比例研究檢測(cè)生物大分子的化學(xué)計(jì)量學(xué)是研究其功能的基礎(chǔ)，目前已有大量通過(guò)分析超離研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)-核酸相互作用的化學(xué)計(jì)量學(xué)報(bào)道。高電壓激活的鈣離子通道（1s和2s）通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子的進(jìn)入?yún)⒓盎蛘{(diào)控、激素釋放及突觸傳遞等過(guò)程。受一系列反饋機(jī)制的調(diào)節(jié)，其中鈣離子-鈣調(diào)蛋白質(zhì)(2)起中心作用。沉降平衡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2–1.2–復(fù)合物以2:1的比率結(jié)合(A)；在較寬的濃度范圍(15-100μM)和不同的速度下(9000-13000)，結(jié)合比率仍為2:1(B)。研究表明，和間的結(jié)合可調(diào)控的功能。分析超離可以準(zhǔn)確測(cè)定生物分子的分子量，根據(jù)生物分子復(fù)合物的分子量進(jìn)而擬合得到其結(jié)合的比例。(A)1002–1.2–11000.41C293.()()21.21:1(),2:1(),2:2(),4:2().a.(B)(A)1002–1.2–11000.41C293.()()21.21:1(),2:1(),2:2(),4:2().a.(B)2–1.2–.2:1(42.8)4:2(85.6).蛋白質(zhì)聚集是生物制藥中關(guān)注的一個(gè)重要方面，存在于藥物生產(chǎn)、配方研發(fā)及存儲(chǔ)的各個(gè)階段，它可能影響藥物的活性，免疫原性及藥代動(dòng)力學(xué)。下圖是利用來(lái)分析單克隆抗體聚集情況的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。軟件用于分析蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)。從本圖中可以看出，在40℃放置了6個(gè)月的抗體出現(xiàn)兩個(gè)降解峰和幾個(gè)聚集峰。?70oC(—)40oC()6.40oC()6．蛋白質(zhì)藥物的配方研究分析超離也可用于藥物配方的研發(fā)。下圖為一抗體樣品在各種溶液中的穩(wěn)定性分析。結(jié)果表明，在不同的溶液中，抗體的存在狀態(tài)有明顯的差異。國(guó)內(nèi)用戶應(yīng)用文獻(xiàn)[1]Crystal.X,Z,S,A,H,Z,Y,M,H,Z.J,2010,396(4):1012-1024.[2]1p2a.S,ET,W,K,Y,P,Y,M,KY,Z.J,2010,285(12):9211-9220.[3]1(U)1.H,H,H,Z,X,Y,Y,L,M.J,2010,171(3):291-297.[4].J,S,Y,Y,H,T,K,B,K.J,2010.[5]411.X,L,Z,H,J,X,Y,S.J,2010,285(33):25506-25515.[6]30:A.X,Z,X,W,Y,B,Y,J,W,M,X,Z.J,2009,390(3):530-537.[7]().Z,G.JB,2009,113(37):12462-12465.[8]1.X,L,Y,X,G,XC,X,Z.,2009,75(1):1-11.[9]2a.Q,C,M,Z,Z,FJ,M.,2009,30(5):866-872.[10]B77.Y,X,H,J,B,D,G,Q,M,BC,D,Z,L,Q,S,Z,S,Y,Z,W,SC,Y,Q.,2008,4(9):548-556.[11]G.H,L,J,M,Y.,2008,25(1):58-71.[12]3p75.Y,P,HJ,T.,2008,454(7205):789-793.[13]15.G,J,J,JS,B,N,S,X,Z,G,XC.J,2007,26(14):3484-3493.[14]()a.N,C,W,J,J,XY,S,J,Z,BC,ZJ.,2007,746.[15],13-1.C,H,W,T.(),2007,39(8):617-623.[16]a.YZ,KQ,CJ,ZJ,WB,L,KQ,ZY.,2007,75(2):367-376.[17]a3.P,K,H,L,C,L,D,C,Y,A,L.,2006,339(3):865-872.[18]3aa.SJ,M,K,A.J,2006,139(5):813-820.[19]:a.SJ,XG,YY,H,CC.J,2006,281(10):6581-6588.[20]:a.H,S,J,GJ,CC.,2006,45(50):15100-15110.國(guó)外用戶應(yīng)用文獻(xiàn)[1](B)a.J,M,G,R,T,W,E,A,A,K,R,JY,M,J,V,M,U,B,B.,2010,465(7295):231-235.[2].SS,R,Z,L,MA,GF,C,SH,NL,NK,T,T,NP,DI,AW,MC,J,J.,2010,467(7317):844-848.[3].MA,S,SM,P,TA,DB,LW,J.J,2010,29(12):1988-2001.[4].T,N,E,Y,M,N,T,S,Y,A,J.,2010,467(7319):1123-1127.[5](2+)(V)1.2.EY,CH,F,RJ,F,ES,EY,DL,.J,2010,29(23):3924-3938.[6].BJ,RA,F,CH,KJ,C,EY.,2010,467(7319):1118-1122.[7]p120.N,SH,S,GY,MJ,LF,M.,2010,141(1):117-128.[8]A2(2).A,S,L,Y,E,LJ,J,C,M,AN,E,MP,T,AC,P.J,2010,29(7):1176-1191.[9].S,A,S,J,O,G,O.,2010,465(7297):502-506.[10].KD,CK,LS,T,A,SC.,2010,142(4):556-567.[11].JL.,2010,10(7):703-713.[12]H3.1H4.EI,J,G,H,P,WH,H,Z,LA,JF,D.,2010,17(11):1343-1351.[13]76.M,N,MH,N,O,A,H,JC,E,P,LE.J,2010,29(14):2315-2328.[14].JL,V,S,A,M,R,O,A,AJ,B,G,M,MF,C,AS,MD,LA,DM,MG,GP,AE,JA.,2009,459(7248):808-813.[15]C3a.SH,J,M,R,KL,A,D,JD,BJ,JA,P.,2009,10(7):721-727.[16].AJ,N,ML,YS,B,T,R,F,PJ,K,SA.,2009,136(3):485-495.[17]E1C7.CA,RF,DJ,A,CT,BA.J,2009,28(13):1953-1964.[18]A.T,M,M,F,M.,2009,461(7263):542-545.[19]a.LR,JG,N,PD,A,TJ,R,Y,GJ.,2009,462(7276):1016-1021.[20]3.EM,PH,JA,PM,G,NA.,2009,323(5920):1455-1458.[21].E,WA.,2009,138(5):923-934.[22]4.PG,HS,MA,Q,X,Z,D,H.J,2009,28(3):274-285.[23]1.HJ,L,ML,J,JL,MS,RE.,2009,137(7):1213-1224.[24]1.AV,PF,AA,J,C,KM,RM,P.,2009,457(7230):687-693.[25]2B.E,N,H.J,2009,28(24):3910-3920.[26]2.R,SK,S,H,AI,J,Y,E.J,2009,28(12):1812-1823.[27]:6a4.T,G,K,B,F,P,M,P,A,J.J,2009,28(18):2835-2845.[28]a.MK,C,C,R,MH,RM,H,C,Y.,2009,137(1):159-171.[29]AD8,.MJ,RH,LA,CE,TB,TA,AR,HP,MJ,DM,A.,2009,326(5958):1415-1418.[30].C,MC,P,C,ML.J,2009,28(10):1518-1530.[31]2.X,U,M,SB,M,TR,M,M,K.USA,2009,106(50):21121-21125.[32].AJ,E,WH,ON,P,I,P,NA,S,S.,2009,136(2):352-363.[33]a.TR,E,JJ,T,NV,DA,J,RL,M,I.,2009,459(7249):1015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