義翹講堂《穩(wěn)定細(xì)胞株開發(fā)及工藝優(yōu)化策略》

孫可欣技術(shù)支持北京義翹神州科技股份有限公司穩(wěn)定細(xì)胞株開發(fā)

及工藝優(yōu)化策略抗體藥物開發(fā)流程

義翹神州01義翹神州抗體藥物開發(fā)流程抗原制備及免疫抗體篩選制備抗體優(yōu)化ADC\雙抗等結(jié)構(gòu)組合雜交瘤（傳統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因小鼠）抗體庫（噬菌體展示）單B細(xì)胞克隆技術(shù)（流式、Beacon）鼠、兔、羊羊駝、其他親和力成熟成藥性改造抗體人源化特異性、溶解度、構(gòu)象穩(wěn)定性、電荷異質(zhì)性、功能活性、片段化有效性初步評價（藥效學(xué)）安全性初步評價（毒理學(xué)、藥代動力學(xué)）成藥性評估動物模型評估最終序列抗體開發(fā)-分子序列確認(rèn)臨床前研究-IND申報臨床試驗(yàn)-新藥上市抗體表達(dá)-功能驗(yàn)證義翹神州基因合成及密碼子優(yōu)化載體構(gòu)建抗體表達(dá)抗體純化QC分析交付克隆至表達(dá)載體質(zhì)粒測序質(zhì)粒制備抗體序列或質(zhì)粒哺乳動物瞬時表達(dá)系統(tǒng)（HEK293/CHO)SDS、UVSEC-HPLC、內(nèi)毒素（可選）ELISA、親和力（可選）抗體開發(fā)-分子序列確認(rèn)臨床前研究-IND申報4.臨床試驗(yàn)-新藥上市純化抗體、質(zhì)檢報告（CoA）克隆于商業(yè)表達(dá)載體的質(zhì)粒、細(xì)胞培養(yǎng)上清（可選）抗體純化親和層析法蛋白A/G臨床試驗(yàn)-新藥上市抗體藥物開發(fā)流程抗體表達(dá)-功能驗(yàn)證瞬時表達(dá)培養(yǎng)基SMM-293TIIHEK293F細(xì)胞密度和細(xì)胞活率更好Fc融合蛋白和重組抗體的產(chǎn)量更高SMMCHO-TII、SMMCHOT3ExpiCHO-S細(xì)胞在CHO-TII培養(yǎng)基中細(xì)胞狀態(tài)良好細(xì)胞密度和蛋白產(chǎn)量隨培養(yǎng)時間的變化義翹神州穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建

瞬時轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建原理

優(yōu)點(diǎn)能夠快速生產(chǎn)得到微量至中量的重組蛋白實(shí)驗(yàn)成本低一個宿主可以帶有多個拷貝，表達(dá)效率高能夠長期穩(wěn)定生產(chǎn)目的蛋白得到穩(wěn)轉(zhuǎn)株之后后續(xù)生產(chǎn)蛋白的成本大大降低能夠?qū)蜻M(jìn)行基因插入、基因敲除等編輯操作缺點(diǎn)無法長期生產(chǎn)得到重組蛋白實(shí)驗(yàn)成本高、周期長、操作難度大應(yīng)用場景基因產(chǎn)物短期表達(dá)、蛋白質(zhì)的小規(guī)模合成長期藥理學(xué)研究、遺傳調(diào)控機(jī)制研究及大規(guī)模的蛋白質(zhì)合成義翹神州抗體藥物開發(fā)流程獲得臨床默示許可臨床試驗(yàn)申請（IND）穩(wěn)定性研究分析方法驗(yàn)證工藝放大確認(rèn)中試原液生產(chǎn)放行中試成品生產(chǎn)放行結(jié)構(gòu)確認(rèn)及表征分析穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建工藝開發(fā)UPB、EOPB細(xì)胞庫檢定病毒清除驗(yàn)證毒理學(xué)評價藥代動力學(xué)抗體開發(fā)-分子序列確認(rèn)臨床前研究-IND申報臨床試驗(yàn)-新藥上市義翹神州抗體表達(dá)-功能驗(yàn)證抗體藥物開發(fā)流程IND批件抗體純化臨床IV期，上市銷售工藝優(yōu)化PO商業(yè)化生產(chǎn)MFG持續(xù)性驗(yàn)證CPV抗體開發(fā)-分子序列確認(rèn)臨床前研究-IND申報臨床試驗(yàn)-新藥上市工藝鑒定PC工藝驗(yàn)證PV新藥上市申請NDA/BLA義翹神州臨床I期臨床II期臨床III期抗體表達(dá)-功能驗(yàn)證穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建流程02

義翹神州

穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建流程電轉(zhuǎn)染細(xì)胞成像篩選篩選擴(kuò)增擴(kuò)增Top3minipool單克隆60個PDL傳代穩(wěn)定性測試PCB義翹神州1.工業(yè)細(xì)胞株

OrignalCHOlineCHO-K1CHOZNGS-/-CHOZNDHFR-/-Sigma-AldrichCHODXB11ATCCCHOK1SVGS-KOLonzaCHO-DG44CHO-ScGMPCHO-SThermoFisherExpiCHO-SThermoFisherFreeStyleCHO-SThermoFisher義翹神州

細(xì)胞來源

產(chǎn)品名稱CHO-K1品牌英國衛(wèi)生局細(xì)胞類型貼壁細(xì)胞形態(tài)特征含血清培養(yǎng)液中-貼壁-上皮樣-梭形，懸浮培養(yǎng)描述和說明CHO-K1細(xì)胞是源自成年中國倉鼠卵巢深入活體組織切片的CHO細(xì)胞的亞克隆完整的運(yùn)送追蹤支持文件合規(guī)完整的實(shí)驗(yàn)報告和原始記錄義翹神州

2.轉(zhuǎn)染

載體轉(zhuǎn)染方法義翹神州轉(zhuǎn)染方法和試劑作用力優(yōu)勢缺點(diǎn)電穿孔電場通用性強(qiáng)效率高適用于小規(guī)模操作...細(xì)胞損傷大非特異傳遞對儀器要求高不易放大...陽離子聚合物靜電吸引蛋白產(chǎn)量高反應(yīng)快通用性強(qiáng)分子量范圍大細(xì)胞毒性較小...對雜質(zhì)敏感需要摸索最優(yōu)條件...SinofectionCat:STF02

穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建流程電轉(zhuǎn)染篩選擴(kuò)增Top3minipool60個PDL傳代穩(wěn)定性測試細(xì)胞成像篩選擴(kuò)增單克隆PCB義翹神州3.加壓篩選

FolicacidTetrahydrofolate(FH4)MTXfolateco-enzymesPurinesDNA&RNADHFRATPADP+PiNH4++GlutamateGlutamineMethioninesulphoximine[MSX]篩選標(biāo)記篩選試劑濃度范圍代謝型篩選標(biāo)記二氫葉酸還原酶(DHFR)甲氨蝶呤(MTX)25nM-1000nM谷氨酰胺合成酶(GS)氨基亞砜蛋氨酸(MSX)25μM-500μM抗生素篩選標(biāo)記嘌呤霉素抗性(Puromycinacetyltransferase)嘌呤霉素(Puromycin)10μg/ml-50μg/ml氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(Aminoglycosidephosphotransferase)新霉素(NeomycinorG418)200μg/ml-700μg/ml谷氨酰胺合成酶(GS)篩選二氫葉酸還原酶(DHFR)篩選義翹神州

Top3minipool4.有限稀釋-細(xì)胞擴(kuò)增與表達(dá)評估1-2萬個cells/孔生長培養(yǎng)基生長培養(yǎng)基表達(dá)量評估0.5個cells/孔克隆培養(yǎng)基克隆培養(yǎng)基克隆培養(yǎng)基補(bǔ)料表達(dá)量評估細(xì)胞成像篩選擴(kuò)增單克隆60個PDL傳代穩(wěn)定性測試PCB義翹神州表達(dá)量評估表達(dá)量評估電轉(zhuǎn)染篩選擴(kuò)增MSX加壓MSX加壓表達(dá)量評估表達(dá)量評估

5.建庫（PCB）

檢測項(xiàng)目檢測方法細(xì)菌、真菌檢查直接接種法支原體檢查培養(yǎng)法、PCR法內(nèi)外源病毒污染檢查特定病毒檢查鼠細(xì)小病毒檢查PCR法表達(dá)量其他檢測項(xiàng)目義翹神州6.PCB穩(wěn)定性預(yù)測試和細(xì)胞株建庫PDL0PDL4~15批次補(bǔ)料培養(yǎng)篩選PDL25~30PDL35~45先導(dǎo)細(xì)胞株P(guān)DL50~60PDL0PDL30PDL60細(xì)胞計(jì)數(shù)3批中試生產(chǎn)穩(wěn)定性預(yù)測試批次補(bǔ)料培養(yǎng)10-30細(xì)胞株3-6細(xì)胞株WCBMCB搖瓶培養(yǎng)評估搖瓶培養(yǎng)優(yōu)化批次補(bǔ)料培養(yǎng)傳代穩(wěn)定性生長密度，細(xì)胞活率，表達(dá)量，基因測序基因拷貝數(shù)等特征的穩(wěn)定性義翹神州

義翹平臺-抗體和蛋白類產(chǎn)品（以CHO為例）

檢測項(xiàng)目MCBWCBEOPC(3批)收獲液(3批)細(xì)胞鑒別★★★

細(xì)菌、真菌檢查★★★

★微限支原體檢查★★★★分枝桿菌檢查★★★

內(nèi)外源病毒污染檢查細(xì)胞形態(tài)觀察及血吸附試驗(yàn)★★★（★）體外不同細(xì)胞接種培養(yǎng)法人源MRC-5★★★★猴源VERO同種屬同組織類型細(xì)胞動物和雞胚體內(nèi)接種法雞胚★

★

（★）成鼠、乳鼠★

★

（★）豚鼠（新建細(xì)胞系）（★）

（★）

家兔（猴源細(xì)胞系）（★）

（★）

逆轉(zhuǎn)錄病毒檢查逆轉(zhuǎn)錄酶活★

★★電鏡法★

★★感染性病毒檢測-敏感細(xì)胞培養(yǎng)法★

★★種屬特異性病毒檢查鼠源病毒檢測★

其他特定病毒檢查鼠細(xì)小病毒檢查★

★★牛源性病毒檢查（傳代過程中使用牛源血清的情況下檢查）（★）（★）（★）

豬源性病毒的檢測（傳代過程中使用豬源胰酶的情況下檢查）（★）（★）（★）

義翹神州

穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建流程電轉(zhuǎn)染篩選擴(kuò)增擴(kuò)增Top3minipool試劑類——交付minipool擴(kuò)增MSX加壓MSX加壓支原體無菌補(bǔ)料PCB義翹神州

穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建流程試劑類——交付pool電轉(zhuǎn)染擴(kuò)增MSX加壓PCB義翹神州補(bǔ)料支原體無菌工藝開發(fā)與優(yōu)化策略03

義翹神州生長情況評估表達(dá)量評估蛋白質(zhì)量評估可放大性評估穩(wěn)定性評估目的：篩選穩(wěn)定高質(zhì)量的種子細(xì)胞1上游工藝2下游工藝義翹神州1.上游工藝開發(fā)和放大部分設(shè)備展示擁有完善的細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)平臺，通過DOE軟件對工藝開發(fā)方案輔助設(shè)計(jì)。有豐富的瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)工藝開發(fā)經(jīng)驗(yàn)。上游工藝開發(fā)豐富的原核、哺乳細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞的工藝放大經(jīng)驗(yàn)。成功實(shí)現(xiàn)多個單抗和融合蛋白類產(chǎn)品工藝放大。上游工藝放大INFORS震蕩培養(yǎng)箱Applikon8聯(lián)罐反應(yīng)器Applikon15L反應(yīng)器全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀生化分析儀義翹神州培養(yǎng)基的篩選關(guān)鍵工藝參數(shù)的開發(fā)實(shí)現(xiàn)不同表達(dá)系統(tǒng)的關(guān)鍵工藝參數(shù)的工藝開發(fā)DOE輔助設(shè)計(jì)采用DOE輔助設(shè)計(jì)，對工藝進(jìn)行優(yōu)化，提供穩(wěn)定性好的細(xì)胞培養(yǎng)工藝小試到中試的工藝放大成熟的培養(yǎng)工藝放大模型，實(shí)現(xiàn)2L-200L規(guī)模培養(yǎng)工藝放大；Non-GMP生產(chǎn)和GMP生產(chǎn)的技術(shù)轉(zhuǎn)移產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性的調(diào)整根據(jù)蛋白質(zhì)特性，優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)工藝，調(diào)整目的蛋白的質(zhì)量基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選、補(bǔ)料培養(yǎng)基優(yōu)化及篩選、培養(yǎng)基馴化1.上游工藝開發(fā)和放大義翹神州細(xì)胞培養(yǎng)工藝基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分碳源金屬離子氨基酸補(bǔ)料培養(yǎng)基Ⅲ培養(yǎng)環(huán)境Ⅱ培養(yǎng)模式Ⅳ培養(yǎng)過程Ⅰ培養(yǎng)基灌流培養(yǎng)濃縮灌流培養(yǎng)批次補(bǔ)料培養(yǎng)pH溫度滲透壓DOpCO2培養(yǎng)時間培養(yǎng)通氣接種密度培養(yǎng)攪拌目的：優(yōu)化工藝，產(chǎn)品產(chǎn)量最大化義翹神州不同規(guī)模的反應(yīng)器開發(fā)設(shè)備：小試規(guī)模到中試規(guī)模1L3L15L200L250L15mL250mL較大通量克隆篩選，工藝條件優(yōu)化克隆篩選以及工藝優(yōu)化中試規(guī)模生產(chǎn)物料生產(chǎn)以及工藝鎖定義翹神州無動物源性培養(yǎng)基貨號產(chǎn)品名稱無血清無抗生素?zé)o動物源無蛋白化學(xué)成分確定MCHOSISMMCHO-SI培養(yǎng)基√√√√

MCHO-SUPISMSCHO-S-SUPI加料液√√√√√MCHOGSISMMCHO-GSI培養(yǎng)基√√√√

MCHOGS-C3SMMCHOGS-C3培養(yǎng)基√√√√

MCHO-GS-SUPISMSCHO-GS-SUPI加料液√√√√√

配套使用加料液可延長細(xì)胞培養(yǎng)時間，增加重組蛋白表達(dá)量義翹神州無動物源，無蛋白，降低病毒污染的可能性部分設(shè)備展示具備完善的蛋白質(zhì)純化工藝開發(fā)技術(shù)平臺，多套國際一流的層析設(shè)備、中間檢測設(shè)備。下游工藝開發(fā)可提供小試工藝到中試放大工藝階段的技術(shù)服務(wù)，滿足客戶在藥物開發(fā)和產(chǎn)品申報各階段的需求。下游工藝放大AKTAAVANT150AKTApure150德國L?ser冰點(diǎn)滲透壓儀Thermo紫外檢測儀Thermo離心機(jī)2.下游工藝開發(fā)和放大義翹神州010205040306純化工藝開發(fā)澄清工藝、層析純化工藝、層析填料動態(tài)載量、超濾、過濾工藝、病毒滅活和病毒去除工藝開發(fā)關(guān)鍵工藝參數(shù)優(yōu)化純化工藝關(guān)鍵工藝參數(shù)的評價及優(yōu)化雜質(zhì)去除方案蛋白質(zhì)聚集體、降解產(chǎn)物及工藝相關(guān)雜質(zhì)去除的技術(shù)方案數(shù)據(jù)的合規(guī)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和可溯性，符合法規(guī)的要求小試到中試的放大成熟的純化工藝放大模型，實(shí)現(xiàn)小試到中試階段的工藝放大，Non-GMP生產(chǎn)和GMP生產(chǎn)的技術(shù)轉(zhuǎn)移符合注冊法規(guī)要求的研究如：填料清洗驗(yàn)證和使用壽命研究2.下游工藝開發(fā)和放大義翹神州純化工藝-雜質(zhì)來源雜質(zhì)來源雜質(zhì)類型原料輔料培養(yǎng)基氨基酸，胰島素，金屬離子，消泡劑，表面活性劑，生長素等純化過程殘留的ProteinA，容器析出物（袋子、膠管、濾器等）其他內(nèi)毒素、病毒CHO細(xì)胞細(xì)胞殘留DNA，HCP，脂類，細(xì)胞碎片其他病毒工藝相關(guān)工藝雜質(zhì)聚體、降解、氨基酸修飾，HCP類型改變，電荷異質(zhì)體等義翹神州3.中試生產(chǎn)抗體GMP生產(chǎn)控制要求義翹神州細(xì)胞株&細(xì)胞庫穩(wěn)定性制備、儲存、使用規(guī)范原輔料

質(zhì)量控制檢測其它微生物控制CQA、CPP、設(shè)計(jì)空間、控制策略中間產(chǎn)品穩(wěn)定性工藝開發(fā)的充分性與系統(tǒng)性對產(chǎn)品中的偏差和非關(guān)鍵工藝參數(shù)的控制符合新藥申報質(zhì)量要求無菌條件控制液體灌裝與凍干過程控制無菌條件控制對產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整批次間差異、OOS、NCE控制數(shù)據(jù)可靠性和完整性DP生產(chǎn)過程控制DS生產(chǎn)過程控制單抗藥物的生產(chǎn)特點(diǎn)：劑量大，規(guī)模大，成本高單抗生產(chǎn)設(shè)施目前有三類：基于不銹鋼系統(tǒng)的生產(chǎn)設(shè)施：設(shè)備復(fù)雜，投資大基于一次性系統(tǒng)的生產(chǎn)設(shè)施：投資低，轉(zhuǎn)型快混合型的生產(chǎn)設(shè)施：投資和建設(shè)周期適中

真核培養(yǎng)車間真核純化車間一條符合GMP要求的單抗生產(chǎn)線需要經(jīng)歷環(huán)評、廠房設(shè)計(jì)、潔凈車間建設(shè)、設(shè)備采購、廠房設(shè)施與設(shè)備的確認(rèn)和驗(yàn)證，投資很大，建設(shè)周期較長。中試生產(chǎn)平臺義翹神州

序號蛋白293

瞬轉(zhuǎn)(mg/L)穩(wěn)定株產(chǎn)量（mg/L）1KLK1160