大鼠頸動(dòng)脈再狹窄模型的建立以及P27靶向治療支架內(nèi)再狹窄在體研究

1/1大鼠頸動(dòng)脈再狹窄模型的建立以及P27靶向治療支架內(nèi)再狹窄在體研究華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文大鼠頸動(dòng)脈再狹窄模型的建立以及P27靶向治療支架內(nèi)再狹窄的在體研究姓名：

談寶珍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：

碩士專業(yè)：

內(nèi)科學(xué)（心血管）指導(dǎo)教師：

呂家高2010-04華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文大鼠頸動(dòng)脈再狹窄模型的建立以及P27靶向治療支架內(nèi)再狹窄的在體研究中文摘要目的：

成功建立頸動(dòng)脈再狹窄的大鼠模型，并觀察慢病毒介導(dǎo)組織特異性啟動(dòng)子SM22alpha驅(qū)動(dòng)p27基因?qū)?dòng)物模型的血管平滑肌增殖的抑制效果。

方法：

使用球囊法損傷大鼠頸總動(dòng)脈，HE染色觀察頸總動(dòng)脈血管內(nèi)皮的平滑肌細(xì)胞增殖情況。

將SM22alpha驅(qū)動(dòng)的p27重組慢病毒轉(zhuǎn)入動(dòng)物模型，對(duì)照組術(shù)后注射紫杉醇。

運(yùn)用HE染色和免疫組化的方法觀察并對(duì)比二者術(shù)后的血管內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞的增殖情況。

結(jié)果：

HE染色顯示，球囊損傷7、14、28天的大鼠頸動(dòng)脈上均有新生內(nèi)膜形成，并伴有平滑肌細(xì)胞增生。

且三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血管中膜內(nèi)膜比和狹窄率有顯著性差異（p0.05）。

感染p27重組慢病毒的大鼠血管內(nèi)膜下平滑肌細(xì)胞增生極少，僅從光鏡下可見細(xì)微的增生情況。

p27重組慢病毒轉(zhuǎn)染的大鼠血管內(nèi)膜中膜比和狹窄率與陽性對(duì)照紫杉醇組有明顯差異。

結(jié)論：

采用球囊擴(kuò)張的方法可使大鼠頸動(dòng)脈形成明顯的狹窄，其病理過程與支架內(nèi)再狹窄相似，可用于再狹窄的形成機(jī)制和藥物治療研究。

SM22alpha驅(qū)動(dòng)的p27重組慢病毒能順利感染頸動(dòng)脈再狹窄的動(dòng)物模型，并特異性抑制了血管平滑肌細(xì)胞的增殖。

關(guān)鍵詞：

支架內(nèi)再狹窄；大鼠；頸動(dòng)脈再狹窄；p27；血管平滑肌細(xì)胞；增殖2華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文StudyonModelEstablishmentofCarotidRestenosisinRatsandTargetedTharepiesofIn-stentRestenosisAbstractObjective:Toestablishtheratsmodelofcarotidrestenosis,andinvestigatetheinhibitioneffectsofp27genespecificitydrivenbySM22alphagene(Lenti-SM22alpha-p27)promoterontheproliferationofvascularsmoothmusclecells(VSMCs).Methods:Injuriedthecarotidofratsbyballoon,observedtheproliferationofVSMCsinintima.InfectedanimalswithLenti-SM22alpha-p27,andcontrasttheproliferationofVSMCstotheratsinjectedbyTaxolatthesametime.Results:Therewereallneointimaformedinballooninjuriedcartiods,andwouldbethickerwhentimegoesonin28days.theratstreatedbyp27havefewVSMCsproliferationandsignificantlydifferentfromratscuredbytaxol.Conclusion:Thepathophysiologyappearedinballooninjuriedratswassimilartoin-stentrestenosis(ISR),canbeusedforthestudiesofISR.TheLenti-SM22alpha-p27caninfectVSMCssuccessfullyandover-expressedp27tohaveasignificantinhibitionofproliferlationtoVSMCs.Keywords:ISR;rat;carotidrestenosis;p27;VSMCs;proliferlation3華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文英文縮寫詞表AbbreviationsCHDCDKCDKDESECFVIIIISRPCIcoronaryarteryheartdiseasecyclindependentkinasecyclindependentkinasedrug-elutingstentendothelialcellAnti-factorVIIIin-stentrestenosisPercutaneouscoronaryintervention冠心病細(xì)胞周期依賴酶細(xì)胞周期依賴酶藥物洗脫支架內(nèi)皮細(xì)胞VIII因子相關(guān)抗原抗體支架內(nèi)再狹窄經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療PTCApercutaneoustransluminalcoronary經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成angioplasty，形術(shù)SPFVSMCSpecificpathogensFreevascularsmoothmusclecell1無特定病原體血管平滑肌細(xì)胞獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明，本學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果的總結(jié)。

盡我所知，除文中已經(jīng)標(biāo)明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。

對(duì)本文的研究做出貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。

本人完全意識(shí)到本人將承擔(dān)本聲明引起的一切法律后果。

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月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：

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本論文屬于不保密□。

（請(qǐng)?jiān)谝陨戏娇騼?nèi)打）學(xué)位論文作者簽名：

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月日年月日華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文前言冠心病（coronaryarteryheartdisease,CHD），是一種最常見的心臟病，是指因冠狀動(dòng)脈狹窄、供血不足而引起的心肌機(jī)能障礙和(或)器質(zhì)性病變，也是全世界發(fā)病率最高的疾病之一。

目前治療冠心病最有效的方法是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneouscoronaryintervention，PCI）。

自1977年發(fā)明經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)（percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，PTCA）以來，冠心病的介入治療已進(jìn)入支架時(shí)代。

雖然近年來支架置入成功率較高，可達(dá)90%以上，但是仍然有20-55%的患者在術(shù)后形成支架內(nèi)再狹窄（in-stentrestenosis，ISR）,嚴(yán)重影響預(yù)后。

目前對(duì)ISR的研究顯示，IRS的形成由多種因素參與而促成，其中大量研究表明，血管內(nèi)膜的增厚和血管重建是發(fā)生IRS的主要原因。

血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelialcell，EC）在正常狀態(tài)下能分泌生長(zhǎng)抑制因子和NO，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖。

同時(shí)完整的血管內(nèi)皮能隔絕多種生長(zhǎng)因子（如纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板生長(zhǎng)因子等）以減輕其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞（vascularsmoothmusclecell,VSMC）的刺激，使平滑肌細(xì)胞穩(wěn)定在靜息狀態(tài)。

介入治療不可避免的會(huì)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷，從而使平滑肌細(xì)胞接觸到各種生長(zhǎng)因子而可能發(fā)生不受控制的增殖。

目前針對(duì)冠脈內(nèi)細(xì)胞增殖的有關(guān)治療如局部放療、藥物涂層支架等已廣泛應(yīng)用于臨床，并產(chǎn)生了一定的療效，尤其是雷帕霉素，紫杉醇等藥物，通過抑制細(xì)胞周期依賴酶（cyclindependentkinase，CDK）抑制細(xì)胞周期，顯著降低了ISR的發(fā)生率。

但是也存在一定缺陷，由于這些藥物無靶向性，同時(shí)抑制了平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，延遲了內(nèi)膜修復(fù)，有導(dǎo)致遲發(fā)性血栓的危險(xiǎn)。

另一方面，血管內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，對(duì)平滑肌細(xì)胞的接觸抑制功能喪失，促進(jìn)了平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。

因此，選擇具有靶向性控制平滑肌細(xì)胞增殖的藥物作為支架的涂層成為目前心血管疾病介入治療研究的熱點(diǎn)。

隨著利用抑癌基因在抑制腫瘤細(xì)胞增生方面研究的深入，利用抑癌基因負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)已成為研究治療細(xì)胞增生性疾病的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

p27是最重要的抑癌基因之一，是廣譜的細(xì)胞周期依賴酶抑制劑。

已有大量研究證實(shí)，p27可通過連接不同的細(xì)胞周期蛋白-細(xì)胞周期依賴激酶復(fù)合物如cyclinD-CDK4、4華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文cyclinD-CDK6、cyclinE-CDK2、cyclinA-CDK2等，進(jìn)而廣泛的抑制CDKs的活性，在真核細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控中起關(guān)鍵作用。

本研究擬模仿PCI術(shù)后再狹窄的原理，使用球囊損傷大鼠頸總動(dòng)脈，建立大鼠頸總動(dòng)脈再狹窄模型，并將由SM22alpha啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的p27重組慢病毒導(dǎo)入由球囊損傷的大鼠頸動(dòng)脈再狹窄模型中。

觀察慢病毒中的外源性p27是否能靶向性轉(zhuǎn)染至大鼠受損的血管平滑肌細(xì)胞并控制其增殖，抑制血管內(nèi)膜的增生，為p27作為基因治療PCI術(shù)后再狹窄的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

5成的血管彈性回縮和血管重建。

本實(shí)驗(yàn)擬通過模擬PTCA的手術(shù)方式對(duì)大鼠行華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文第一部分大鼠頸動(dòng)脈再狹窄模型的建立經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)（PTCA）是目前治療冠心病最有效的方法之一。

但其術(shù)后高發(fā)的支架內(nèi)再狹窄（ISR）率嚴(yán)重影響了PTCA的療效。

對(duì)PTCA術(shù)后發(fā)生的支架內(nèi)再狹窄的研究成為目前介入治療冠心病的重大熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn):發(fā)生ISR的主要機(jī)制為血管內(nèi)膜的過度增生以及擴(kuò)張血管后造[1]頸總動(dòng)脈球囊擴(kuò)張術(shù),建立與ISR病理特征相似的大鼠頸總動(dòng)脈再狹窄模型，為研究和治療ISR提供可靠的動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1材料和方法1.1主要材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重300-400gSPF級(jí)雄性Wistar大鼠15只由同濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中學(xué)提供。

許可證號(hào)：

SCXK(鄂)2008-00051.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備單人雙目手術(shù)顯微鏡（10x）1.1.3實(shí)驗(yàn)藥品中科院光電技術(shù)研究所科奧達(dá)公司碘伏消毒液6%水合氯醛合劑10%中性緩沖福爾馬林青霉素注射劑160萬單位裝低分子肝素鈉注射劑4000單位：

0.4毫升1.1.4實(shí)驗(yàn)器材AvionPlus球囊擴(kuò)張導(dǎo)管1.25F手術(shù)器械若干醫(yī)用縫合針（角1/2?。?同濟(jì)醫(yī)院藥劑科（自制）同濟(jì)醫(yī)院藥劑科（自制）同濟(jì)醫(yī)院藥劑科（自制）華北制藥廠賽諾菲安萬特中國(guó)集團(tuán)購于同濟(jì)醫(yī)院器材科購于同濟(jì)醫(yī)院器材科購于同濟(jì)醫(yī)院器材科華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文醫(yī)用縫合線（3號(hào)）醫(yī)用球囊擴(kuò)張壓力泵實(shí)驗(yàn)動(dòng)物固定板1.1.4主要試劑HE染色試劑VIII因子相關(guān)抗原抗體（FVIII）購于同濟(jì)醫(yī)院器材科同濟(jì)醫(yī)院心導(dǎo)管室提供自制上海滬峰化工有限公司美國(guó)Abcm公司1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1手術(shù)器械消毒采用高壓蒸汽滅菌法將手術(shù)器械，棉球消毒。

球囊擴(kuò)張導(dǎo)管和球囊擴(kuò)張壓力泵用75%消毒酒精浸泡。

1.2.2稱重，麻醉，固定1.2.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重將盛放大鼠用的容器放在稱重臺(tái)上清零，抓住實(shí)驗(yàn)用大鼠尾部中段提起，輕輕放入容器中，將容器放入稱重臺(tái)，待稱重臺(tái)讀數(shù)顯示穩(wěn)定后讀取大鼠重量。

1.2.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉，固定1．根據(jù)大鼠重量按5ml/kg計(jì)算6%水合氯醛注射量。

將水合氯醛溶液中的沉淀搖勻后，用注射器抽取相應(yīng)劑量水合氯醛溶液備用。

2．左手抓住鼠尾中段提起大鼠，置于鼠籠或?qū)嶒?yàn)臺(tái)向后拉，在其向前爬行時(shí)，用拇指和食指捏住鼠耳后面的皮膚，余下三指緊捏鼠背皮膚，置于左掌心中，使其腹部向上。

大鼠性情比較兇猛，抓取過程中一定要佩戴帆布手套，以免咬傷。

左手盡可能多的捏緊大鼠耳后的皮膚和背部的皮膚，以防被大鼠回頭咬手。

如果大鼠體積較大或左手力量較小，可用右手固定大鼠，左手操作。

3.右（左）手將注射針頭于大鼠左（或右）下腹部刺入皮下，使針頭向前推0.5～1.0cm，再以45度角穿過腹肌，固定針頭，緩緩注入藥液，為避免傷及內(nèi)臟，可使動(dòng)物處于頭低位，使內(nèi)臟移向上腹。

藥液注射完畢抽出針頭，將大鼠放7華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文回容器。

腹腔注射時(shí)入針位置應(yīng)在下腹并靠近腹部中線。

注射器針頭穿過腹肌時(shí)會(huì)有突破感，這時(shí)需將注射器回抽確定無血后才可將麻藥緩慢注入，以免麻藥注入腸道或腹腔臟器，造成大鼠死亡。

4.將失去行動(dòng)能力的大鼠腹部朝上放到固定板上，用橡皮筋分別固定四肢。

1.2.3分離頸外動(dòng)脈1.2.3.1備皮用粗剪刀剪去大鼠頸部被毛。

剪刀應(yīng)緊貼大鼠頸部皮膚，不可用手提起被毛，以免剪破皮膚。

剪下的毛應(yīng)集中放在一個(gè)有水容器內(nèi)，勿留在手術(shù)野和固定板周圍，以保證手術(shù)野的清潔和防止其他手術(shù)器械和注射器等夾毛。

1.2.3.2分離組織，暴露頸外動(dòng)脈手術(shù)顯微鏡下沿頸正中線剪開大鼠皮膚，沿頸正中線鈍性分離淺筋膜、甲狀腺等，暴露左側(cè)頸動(dòng)脈三角。

繼續(xù)鈍性分離頸動(dòng)脈三角，可見跳動(dòng)的頸總動(dòng)脈。

沿頸總動(dòng)脈向大鼠頭部方向?qū)ふ?，可以見頸總動(dòng)脈向上分為頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。

分別分離出頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈如（圖1-1），位于頸總動(dòng)脈分叉處上方的血管為頸外動(dòng)脈，下方為頸內(nèi)動(dòng)脈。

臨時(shí)結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈，將一尺寸裁剪合適的鋁箔片折疊后墊入頸外動(dòng)脈下方，如（圖1-2，1-3）。

鋁箔片可為后面頸外動(dòng)脈的剪開和導(dǎo)管的進(jìn)入提供受力點(diǎn)，在一定程度上防止剪開頸外動(dòng)脈時(shí)和插入導(dǎo)管過程中發(fā)生抖動(dòng)，減少流血，方便手術(shù)操作。

結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端。

注意事項(xiàng)：

1.鈍性分離外周組織時(shí)應(yīng)動(dòng)作輕柔，沿肌肉走向分離。

盡量少用銳器剪割淺筋膜和肌肉，以免流血過多影響手術(shù)視野。

2.鋁箔片應(yīng)折疊后將對(duì)折的一邊朝向頸總動(dòng)脈分叉處插入頸外動(dòng)脈下方，游離端比較鋒利，易將血管割傷。

3．結(jié)扎頸外動(dòng)脈后，應(yīng)檢查結(jié)扎處到頸總動(dòng)脈間的頸外動(dòng)脈段有無細(xì)小的動(dòng)脈分支，若有細(xì)小分支，應(yīng)結(jié)扎，否則球囊插入過程中會(huì)引起頸外8華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文動(dòng)脈開口處出血，影響手術(shù)操作。

1.2.4插入球囊導(dǎo)管，損傷血管內(nèi)膜連接球囊導(dǎo)管與壓力泵，檢查球囊有無破損，確定完好后抽出球囊內(nèi)空氣，放置一邊備用。

用動(dòng)脈夾將頸總動(dòng)脈夾閉，在顯微鏡視野下在盡量靠近頸外動(dòng)脈結(jié)扎處的血管壁上輕輕剪開一個(gè)破口擦去流出的血液。

將導(dǎo)管球囊端輕輕插入開口處，緩慢送入頸總動(dòng)脈如圖1-4。

球囊進(jìn)入頸總動(dòng)脈時(shí)會(huì)有輕微阻力，可緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)球囊并繼續(xù)向前，直到球囊到達(dá)動(dòng)脈夾處。

松開動(dòng)脈夾，迅速將球囊全部送入頸總動(dòng)脈段，壓力泵將球囊充氣，定壓到4bar，阻斷血流30秒，如圖1-3。

將球囊在頸總動(dòng)脈來回抽動(dòng)3-5次，抽出球囊結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端。

沖洗球囊，檢查導(dǎo)管通暢性。

注意事項(xiàng)：

1.若剪開頸外動(dòng)脈后有連續(xù)性流血，應(yīng)壓迫開口處止血，并檢查頸總動(dòng)脈是否完全夾閉，頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈是否結(jié)扎緊，頸外動(dòng)脈段上是否有未結(jié)扎的細(xì)小分支，及時(shí)處理出血原因。

2.若球囊剛進(jìn)入頸外動(dòng)脈時(shí)就感覺有阻力，可能是球囊進(jìn)入血管外膜而未真正進(jìn)入管腔或抵在血管壁上。

此時(shí)不能使用蠻力繼續(xù)推進(jìn)，應(yīng)退出球囊重新進(jìn)入，或者調(diào)整方向稍稍轉(zhuǎn)動(dòng)球囊后再嘗試進(jìn)入。

3．松開動(dòng)脈夾時(shí)插管處會(huì)有大量血液涌出，應(yīng)盡快將球囊充氣止血，并擦凈流出血液。

時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致血凝塊在手術(shù)視野內(nèi)形成，影響操作。

1.2.5縫合，抗凝，抗感染松開頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎處，確定無出血后用青霉素溶液沖洗傷口，縫合。

皮下注射低分子肝素鈉溶液防止血栓生成，肌肉注射青霉素抗感染。

術(shù)后兩天繼續(xù)注射青霉素防止感染，正常飲食。

注意事項(xiàng)：

若使用抗凝藥物為一般肝素，應(yīng)在手術(shù)前注射。

低分子肝素鈉抗凝起效快，且效果優(yōu)于一般肝素，故可在術(shù)后使用以免術(shù)前使用引起手術(shù)過程中流血過多。

9華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文1.2.6取大鼠頸總動(dòng)脈手術(shù)后7日、14日和28日分別取大鼠手術(shù)側(cè)血管和未手術(shù)側(cè)血管作為手術(shù)組和對(duì)照組。

1.2.6.1麻醉，固定大鼠取術(shù)后大鼠，稱重，腹腔注射致死劑量6%水合氯醛溶液，待大鼠喪失行動(dòng)能力后腹部朝上放到固定板上，用橡皮筋分別固定四肢。

1.2.6.2分離組織，取出血管沿頸正中線剪開外皮，鈍性分離左側(cè)肌肉，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈。

剪開胸骨，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈。

分別結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和遠(yuǎn)心端，用鑷子夾住頸總動(dòng)脈，輕輕剪下頸總動(dòng)脈段。

再鈍性分離右側(cè)頸動(dòng)脈三角，結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈的近心端和遠(yuǎn)心端，剪下頸總動(dòng)脈段，作為對(duì)照組。

注意事項(xiàng)：

1.手術(shù)后大鼠頸動(dòng)脈三角的組織會(huì)發(fā)生粘連，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)模糊，不易找到頸總動(dòng)脈。

可在分離頸部淺層肌肉后尋找手術(shù)時(shí)留下的頸外動(dòng)脈結(jié)扎處的線頭，循結(jié)扎處向下分離，即可看見頸總動(dòng)脈。

2.結(jié)扎手術(shù)側(cè)頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端的位置應(yīng)在頸總動(dòng)脈分叉處，在距離分叉處大約一個(gè)球囊左右距離的地方結(jié)扎頸總動(dòng)脈。

距離太長(zhǎng)容易將球囊未損傷的頸動(dòng)脈段也剪下，影響對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。

3.手術(shù)側(cè)的頸總動(dòng)脈彈性較弱，用力牽拉會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈斷裂。

且動(dòng)脈周圍組織粘連較緊，分離動(dòng)脈時(shí)應(yīng)小心操作，輕柔剝離。

4.取材一定要迅速，應(yīng)在動(dòng)物處死后立即進(jìn)行解剖和切取組織材料，否則會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生死后變化（如組織自溶及腐敗現(xiàn)象等），進(jìn)而失去原有的結(jié)構(gòu)。

1.2.7組織的固定，切片，染色1.2.7.1組織石蠟包埋和切片1.將取下的動(dòng)脈段用0.9%生理鹽水沖洗后放入10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定24小時(shí)。

10華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文2.倒掉福爾馬林溶液，加pH7.4PBS,每隔8小時(shí)更換一次，4℃保存，換液3天。

3.打開烘箱，調(diào)溫至62℃，融石蠟。

4.酒精梯度脫水（30％、50％、70％、80％、90％、95%、100％2），隔30分鐘更換一次。

5.50％酒精＋50％二甲苯30分鐘（過渡步驟）。

6.100％二甲苯，時(shí)刻觀察組織塊至透明。

7.放入烘箱中已經(jīng)預(yù)融的50％石蠟＋50％二甲苯中，30分鐘。

8.100％石蠟兩遍，每次2小時(shí)。

(若石蠟浸潤(rùn)不夠，仍有二甲苯，則包埋后的石蠟塊較脆，易分層、斷裂。

)9.100％石蠟紙盒內(nèi)凝固（先用蠟打底，再放入組織塊，澆上蠟包埋，放入4℃冰箱或水中冷凝，標(biāo)明組織塊放入方向），4℃存放備用。

10.修塊。

11.融化石蠟?zāi)ㄓ趬K底，貼在木塊上，壓實(shí)。

12.切片（5－10m）,將切片平展于平板上，光面朝上。

13.將光面朝下，將石蠟薄切片放于水面上（水溫40℃），使其伸展。

（時(shí)間勿太長(zhǎng)）14.將石蠟薄片貼在預(yù)先處理好的玻片上。

15.40℃烘烤過夜。

注意事項(xiàng)：

1.固定液應(yīng)充足，體積應(yīng)在所取標(biāo)本體積20倍以上。

2.組織塊在二甲苯中的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，使組織透明即可。

若較長(zhǎng)時(shí)間后透明度仍不好，應(yīng)檢查原因，如因脫水不充分，應(yīng)重新脫水。

3．烘箱中的溫度必須嚴(yán)格控制在60℃的范圍，不能超過60℃；浸蠟時(shí)間不宜過長(zhǎng)。

浸蠟溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng)使組織收縮過度收縮和脆變。

4.包埋操作要迅速，組織從浸蠟杯中取出置入包埋框中的時(shí)間應(yīng)盡量縮短。

5.包埋后的蠟塊應(yīng)呈均質(zhì)半透明狀，如果出現(xiàn)白色混濁狀，一般出現(xiàn)在組織11華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文周圍或組織的底部，應(yīng)考慮這樣幾個(gè)方面的問題：

a.脫水不徹底。

b.包埋蠟溫度低了，組織進(jìn)行包埋時(shí)，包埋框中的蠟已成凝結(jié)狀。

c.組織內(nèi)還殘留有較多的透明劑，d.石蠟不純。

6.包埋箱中的溫度必須保持恒定。

1.2.7.2石蠟切片脫蠟，HE染色1．脫蠟二甲苯I10分鐘二甲苯II5分鐘2．水化100%酒精I(xiàn)5分鐘100%酒精I(xiàn)I5分鐘95%酒精I(xiàn)5分鐘95%酒精I(xiàn)I5分鐘85%酒精3分鐘75%酒精2分鐘蒸餾水沖洗1分鐘3．染色蘇木精染色5分鐘自來水洗鹽酸酒精分化15秒自來水洗（鏡檢）自來水洗15分鐘0.5%伊紅染色1分鐘蒸餾水洗2分鐘75%酒精2分鐘85%酒精2分鐘95%酒精I(xiàn)5分鐘95%酒精I(xiàn)I5分鐘12華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文100%酒精I(xiàn)5分鐘100%酒精I(xiàn)I5分鐘二甲苯I5分鐘二甲苯II5分鐘4．封片上述處理好的玻片，取中性樹膠滴入載玻片的組織上，取蓋玻片從一端逐步蓋下去，避免發(fā)生氣泡注意事項(xiàng)：

1．染色之前一定要了解清楚所用的染色液的配制方法，不同的染色液染色后的處理是不一樣的。

2．染色過程中所用的時(shí)間要根據(jù)染色時(shí)的室內(nèi)溫度、染液的新鮮程度及實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況等靈活掌握。

在室溫高、切片、染色液又是新配制的，染色時(shí)間就要短，反之時(shí)間就長(zhǎng)。

3．伊紅有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，應(yīng)該在脫水前進(jìn)行染色，如果是醇溶的，應(yīng)使用與溶解伊紅等濃度的酒精開始脫水。

4．在二甲苯脫蠟之前可以先在60℃烤箱內(nèi)0.5~1小時(shí)，這樣可以使切片粘附更牢固不易脫片，也有利于脫蠟。

5．二甲苯在HE染色中有脫蠟、透明的作用。

二甲苯脫蠟的好壞主要取決于切片在二甲苯內(nèi)放置的時(shí)