血友病的基因診斷

1血友病的基因診斷2背景血友病A10～20/10萬，絕對患病數(shù)約13～26萬（中國）無完整的診斷體系，誤診、漏診、病死率高替代治療：傳播疾病，經(jīng)濟負擔重感染HCV，HBV，HIV，$14萬/年/人（美國)致死（殘）率極高

遺傳后代3FVIII(Xq28)FIX(Xq27)qpX染色體血友病A、B4內(nèi)含子22倒位5結(jié)果（1）

內(nèi)含子22倒位檢測結(jié)果6內(nèi)含子1倒位機制7內(nèi)含子1倒位檢測方法2Kb1.5Kb2Kb1.5Kb8血友病攜帶者和產(chǎn)前診斷流程PCR擴增外周血DNA抽提（攜帶者）直接核酸測析間接聯(lián)鎖分析明確診斷長鏈PCR檢測內(nèi)含子1,22倒位血友病A①、②、③羊水DNA抽提（胎兒）①③②間接基因診斷血友病A10

第一代標志

F8基因內(nèi)的BclⅠRFLPF8基因內(nèi)兩個STR位點F8基因外的St14VNTR11

家系15BclIRFLP位點多態(tài)性連鎖分析12家系13st14位點VNTR多態(tài)的基因連鎖分析13內(nèi)含子13中STR多態(tài)位點用于家系12基因連鎖分析146個與F8緊密連鎖的STR位點：

DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073和DXS1108距F81.5Mb內(nèi)1個F8內(nèi)的STR位點(F8Civs13)性別位點為牙釉蛋白基因（Amelogeningene）終產(chǎn)物X染色體102bp，Y染色體108bp第二代標志15第三代位點的開發(fā)對象：69名正常女性、31個血友病A家系（120名相關(guān)成員）方法：在人類基因組數(shù)據(jù)庫中選擇了位于F8基因兩端0.5CM內(nèi)的三個STR位點（5_226、5_147及3_486），F(xiàn)8基因內(nèi)的1個STR位點（INTRON25）及距離F8基因2CM內(nèi)的DXS8069位點，以多重熒光PCR法檢測5個微衛(wèi)星位點的多態(tài)性16F8CA22DXS1073G6PDDXS9901DXS15DXS1108ST14F8Civs13F8Intron25DXS10735-226F8Civs133-4865-147DXS806917Marker雜合度多態(tài)性單獨可診斷率5_22672.46%1280.65%5_14749.27%654.84%DXS806972.46%664.52%3_48649.27%658.06%INTRON2531.88%341.94%聯(lián)合5個STR位點可對所有要求做攜帶者及產(chǎn)前診斷的血友病A家系提供遺傳連鎖分析結(jié)果且與F8基因直接檢測結(jié)果相符結(jié)果與討論187重熒光PCR技術(shù)降低重組發(fā)生率未見漏診和誤診診斷率和準確率100％F8Intron25DXS10735-226F8Civs133-4865-147DXS8069結(jié)果與討論特殊血友病A家系的基因診斷

20先證者自幼皮膚、頭顱撞傷后及拔牙及手術(shù)后有出血難止，曾發(fā)生過顱內(nèi)出血BT、PT正常APTT延長，F(xiàn)VIII:C2%輸注全血或抗血友病球蛋白治療有效先證者已故21FVIII:C

2%22直接基因測序結(jié)果：直接測序未檢測出突變。原因：據(jù)文獻報道FVIII直接基因測序有1%-10%的患者查不到基因突變（HumMutat.2002Oct;20(4):267-74）突變可能在內(nèi)含子中可能存在大的缺失

23攜帶者診斷結(jié)果攜帶者及待檢者F8內(nèi)含子22倒位均為陰性

24間接診斷結(jié)果

BclI酶切圖

III-1表姐：

-/-II-2舅媽：-/-II-3母親：+/-II-4父親：+/+III-2待檢者：+/+M25BclI酶切圖測序圖BclI酶切識別位點T/GATCA圖a待檢者測序圖，含BclI酶切位點圖b表姐測序圖，不含BclI酶切位點ab26間接診斷結(jié)果

ca13基因掃描III-1表姐：144/144III-2待檢者：142/142II-3母親：142/144II-2舅媽：140/144II-4父親：142/-27間接診斷結(jié)果

ca22基因掃描III-1表姐：79/79III-2待檢者：79/83II-3母親：83/79II-2舅媽：79/79II-4父親：79/-28血友病A攜帶者間接診斷結(jié)果分析表姐舅媽父親母親待檢者綜合A13、CA22及BclI信息，待檢者與其表姐有不同的X染色體。舅舅女性血友病A的基因及產(chǎn)前診斷30標本來源

先證者（II-1），女，21歲，漢族，自幼有踝關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)有自發(fā)出血，臨床診斷為血友病A，冷沉淀及濃縮FVIII輸注有效，因懷孕要求作基因診斷及產(chǎn)前診斷？？APTTsPTsTTsFgg/LvWF%FVIII：C%I-128.911.317.73.3141121I-227.21018.62.4124118II-175.212.117.72.11212.1II-23911.518.82.8142107II-340.112.520.651.916411931基因檢測結(jié)果F8內(nèi)含子22倒位F8內(nèi)含子1倒位先證者陽性（攜帶者）陰性胎兒陰性陰性其他人陰性陰性先證者F8基因所有外顯子及其側(cè)翼序列擴增測序（-）32遺傳連鎖分析319218150282340172374323212150282346172365319218150282340172374325220150280340172374325220150280340172374319218150282340172374325220150280340172374323212150282346172365325220150280340172374HA患者正常男性胎兒正常女性先證者圖2家系多態(tài)性位點遺傳連鎖分析圖IIIIII121234132521213028034017237432521213028034017237433X染色體隨機滅活模式檢測

先證者來自母系的X染色體大部分被滅活，而來自父系的X染色體保留活性家系其他成員及胎兒為X染色體隨機滅活家系成員HpaII酶切前HpaII酶切后SizeHeightSizeHeight父I-131074483104083母I-2298/3041502/1183298/304285/135先證者II-1304/3102543/2424304/3101233/49妹II-2298/3106054/5233298/3103208/2166弟II-33047122304917胎兒III-1307/3106475/6024307/3101337/216334發(fā)病機制先證者一條X染色體發(fā)生了F8基因內(nèi)含子22倒位，而未檢測到其它F8基因相關(guān)突變遺傳連鎖分析發(fā)現(xiàn)該女性患者的兩條X染色體分別遺傳自其父母，排除其為單親二倍體先證者的X染色體滅活呈非隨機性滅活，其遺傳自父親的X染色體大部分保留了活性35女性血友病A

女性血友?。?FVIII:C3.4%,FVIII:Ag4.2%Leu1975Pro

和3637-3638insA父親：(FVIII:C6.9%,FVIII:Ag7.4%),Leu1975PromutationJThrombosisandhaemostasis2006363637-3638insA突變是如何產(chǎn)生的?PCR擴增患者的cDNA（2809bp，exon14toexon19），該片段含上述兩種突變，產(chǎn)物進行TA克隆測序測序結(jié)果顯示該突變來自患者的母親父親的等位基因母親的等位基因373637-3638insA突變是如何產(chǎn)生的?母親外周血DNA的F8基因沒有檢測到基因突變母親不同組織的DNAF8基因檢測也沒有檢測到突變，說明母親不是體細胞的嵌和體表明女性血友病患者3637-3638insA是一種自發(fā)突變（denovo）38框移突變(3637-3638insA)定量

RT-PCR顯示：患者的FVIIImRNA減少結(jié)論：女性血友病A患者是其F8基因中來自父親的Leu1975Pro突變和自發(fā)突變

3637-3638insA，雙重雜合突變導致的39一個血友病家系，父親為血友病A，兒子為血友病B同時存在HA和HB患者家系的基因診斷HAHB40FVIII(Xq28)FIX(Xq27)qp染色體X血友病A、B＋41ResultofphynotypedetectionFamilymember

APTT（s）PT（s）TT（s）Fg（g/L）FⅧ:C（%）FⅨ:C（%）I-337.312.316.82.8149.0104.7I-442.514.017.04.3128.094.4II-139.512.116.42.5154.078.3II-340.612.517.02.5145.068.4II-688.012.215.33.20.398.3II-739.912.519.82.198.082.2II-836.611.616.32.8139.098.1III-790.012.016.22.375.81.9Referencerange

35±1013±317±32.0-4.050-15050-15042基因診斷結(jié)果

F8INV22：父親（＋）其他成員（－）

F8INV1：所有成員（－）F9測序:兒子mutation(32772A→T，Ser365Cys),

母親同位置雜合子阿姨、外公（－）父親（－）43

Resultoflinkageanalysis

399340208166313365399340208166313365399340208166313365399340208166313365389336210164313358395350212180313358395350212180313358395350212180313358ⅠⅡⅢ346789107？？＋：FIX基因缺陷＋＋__44外周血細胞、組織細胞外公體細胞、生殖細胞嵌合體外公

阿姨Peripheralbloodbuccalcavitycells

Enqomphesisrate:14.1%嵌合體檢測

45凝血因子V和VIII聯(lián)合缺陷；常染色體隱性遺傳性疾病；發(fā)病率為1/100萬，男女均可發(fā)病致病基因并非F5，F(xiàn)8基因，而是與蛋白轉(zhuǎn)運相關(guān)受體的編碼基因突變導致：LMAN1（70%），MCFD2（30%）分子發(fā)病機制研究F5F8D家系基因診斷46F5F8D家系基因診斷先證者1：10歲女孩，口腔粘膜反復出血患者母親懷孕要求做產(chǎn)前診斷47二、F5F8D家系基因診斷先證者2：50歲女性，貧血，凝血功能不佳，長期痔瘡出血先證者3：47歲女性，凝血功能不佳48二、F5F8D家系基因診斷先證者4：50歲男性，平時無明顯的凝血功能異?，F(xiàn)象，因痔瘡出血難止于術(shù)前進行凝血功能篩查49先證者APTTsPTsFV:C%FVIII:C%182.219.69.124.2271.622.17.625374.618.314.519.6470.318.29.415.7F5F8D家系實驗室檢測結(jié)果50F5F8D家系基因檢測結(jié)果先證者1：LMAN1：Exon8nt925-933insA305frameshift編碼20個氨基酸后終止LMAN1：Exon11nt1387C>CT(X71661.1)456Arg>Stop母親父親產(chǎn)前診斷：胎兒女性，且攜帶了來自父親的突變51先證者2、3：MCFD2：Exon4nt501T>C，導致第136位氨基酸錯義突變，136Ile>Thr

F5F8D家系基因檢測結(jié)果52F5F8D家系基因檢測結(jié)果先證者4：LMAN1：Exon5nt636C>T，導致202R>Stop先證者4之子（雜合子）：LMAN1：Exon5nt636C>CT間接診斷中的基因重組54HA家系情況先證者II-3為重型血友病A患者，F(xiàn)8C<1.0%II-5要求作攜帶者診斷?55HA家系檢測結(jié)果22倒位：均為陰性1倒位：先證者（II-3）為陽性，女性（II-5）為攜帶者。2Kb1.5Kb2Kb1.5Kb56HA家系遺傳連鎖分析的結(jié)果5A1542032031241568086C1542032031241568496B1541951951281568086ⅠⅡ123B1541951951281568086C1542032031281568086A1542032031241568086？F8F8F8F857HA家系診斷結(jié)果內(nèi)含子1倒位是該家系HA發(fā)生的致病機制，II-5為內(nèi)含子1倒位攜帶者遺傳連鎖分析發(fā)現(xiàn)II-5在ST14，DXS15，DXS9901，G6PD與DXS1073，F(xiàn)8Civs13，CA22，DXS1108間發(fā)生染色體的同源重組58結(jié)論

在應用間接診斷進行HA家系攜帶者及產(chǎn)前診斷時，不能僅使用單一的位點進行診斷，必須聯(lián)合應用多