煙草及煙草制品 果膠的測(cè)定

《煙草及煙草制品果膠的測(cè)定離子色譜法》研究報(bào)告安徽中煙工業(yè)公司2009年8月果膠測(cè)定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)研究報(bào)告關(guān)鍵字：煙草果膠離子色譜果膠酶摘要：比較了酸解法、酶解法、酸化酶解結(jié)合法三種前處理方法對(duì)煙草果膠水解的影響，采用離子色譜法測(cè)定水解物中的半乳糖醛酸的含量（果膠含量以半乳糖醛酸計(jì)），結(jié)果顯示酸化酶解結(jié)合法可以有效水解煙草中的果膠，相對(duì)于酸解法和酶解法該法水解煙草果膠更為徹底，而且不破壞水解產(chǎn)物半乳糖醛酸。離子色譜法測(cè)定半乳糖醛具有靈敏度高、分離度好等優(yōu)點(diǎn)，方法的線性相關(guān)系數(shù)為1，回收率94%～101%，RSD為0.91%。四家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了方法比對(duì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果令人滿意。果膠是煙草中一種復(fù)雜的高分子聚合物，其基本結(jié)構(gòu)是半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵聚合形成的聚半乳糖醛酸。不同種類的煙草中果膠含量是不同的，通常含量在6％-12％之間，是煙草中含量較大的一類生物大分子物質(zhì)[1]。煙草中的果膠類物質(zhì)含量過(guò)高時(shí)會(huì)使煙草在燃吸時(shí)燃燒不完全，對(duì)煙草吸味有負(fù)面影響，同時(shí)果膠在分解時(shí)還能產(chǎn)生有毒物質(zhì)甲醇，對(duì)卷煙的安全性不利[2]。與此同時(shí)果膠又對(duì)煙草保濕能力和柔韌性有著重要作用，因此果膠含量已成為煙草品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，準(zhǔn)確測(cè)定煙葉中的果膠含量對(duì)于煙草品質(zhì)有著重要的意義[3、4]。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)果膠測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)有:GB/T10742-1989造紙?jiān)瞎z含量測(cè)定、NY146.11-1988果汁的測(cè)定和NY82.11-1988果膠測(cè)定。這三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)制定時(shí)間比較早，三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)都是先采用乙醇溶液回流除去小分子糖，再使用硫酸溶液水解果膠，咔唑比色法測(cè)定水解液中的還原糖，方法對(duì)半乳糖醛酸的選擇性差，操作較為復(fù)雜且靈敏度也不高，而國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織ISO以及CORESTA也沒(méi)有制定果膠測(cè)定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。目前果膠測(cè)定方法主要有兩大類，一類是直接測(cè)定果膠酸含量，果膠含量以果膠酸計(jì)；一類是通過(guò)酸解或者酶解將果膠水解，采用現(xiàn)代分析儀器測(cè)定水解產(chǎn)物半乳糖醛酸含量，果膠含量以半乳糖醛酸計(jì)。第一類方法中，以重量法、容量法[5]為主，通過(guò)對(duì)果膠皂化處理，使果膠轉(zhuǎn)化為果膠酸，使用氯化鈣沉淀或者EDTA滴定果膠酸，測(cè)定果膠酸含量。這類方法操作步驟復(fù)雜且重復(fù)性差，目前已較少采用。第二類方法中，主要有比色法、色譜法等，其中比色法主要有咔唑比色法[6]、間-羥基聯(lián)苯比色法[7]，其原理是在強(qiáng)酸條件下將果膠水解成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸進(jìn)一步降解，通過(guò)咔唑或間-羥基聯(lián)苯與半乳糖醛酸降解產(chǎn)物衍生化反應(yīng)，進(jìn)行比色測(cè)定半乳糖醛酸含量。雖然比色法對(duì)半乳糖醛酸有一定的選擇性，但是中性糖對(duì)測(cè)定結(jié)果有干擾[8]。除了中性糖的干擾之外，游離態(tài)或結(jié)合態(tài)半乳糖醛酸與顯色劑之間的反應(yīng)也存在差異，結(jié)果導(dǎo)致采用比色法測(cè)定半乳糖醛酸的含量結(jié)果偏高[9-11]。色譜法測(cè)定半乳糖醛酸的方法主要有氣相色譜法[12、13]、液相色譜法[14、15]離子色譜法[16、17]等。其中氣相色譜法測(cè)定需要衍生化，操作復(fù)雜，采用的較少；高效液相色譜法雖然解決了選擇性問(wèn)題，但是只能采用示差折光檢測(cè)器或者蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)半乳糖醛酸，靈敏度不高；離子色譜法采用離子色譜柱分離半乳糖醛酸，帶金電極的電化學(xué)檢測(cè)器測(cè)定，方法選擇性好，靈敏度高。在本研究報(bào)告中，將采用離子色譜測(cè)定果膠水解產(chǎn)物半乳糖醛酸，并對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化。果膠水解目前主要有三種方法，酸法[18-21]、酶法[22-24]以及酸化酶解結(jié)合法[16、25]，酸法水解需要較高濃度的酸和足夠長(zhǎng)的時(shí)間才能將果膠完全水解，酸解產(chǎn)物半乳糖醛酸一經(jīng)釋放就有降解趨勢(shì)，形成內(nèi)酯類物質(zhì)[16,26]，因此采用酸法水解果膠定量測(cè)定半乳糖醛酸含量這種方法不是一種理想的方法[27]。酶法水解果膠是一種較好的技術(shù)，處理過(guò)程中不存半乳糖醛酸的降解，但是酶法水解需要不同類型活性的酶，包括聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶、半纖維素酶，這些酶的綜合作用才能有效水解果膠[13,22,23,27]。Haikel[16]比較了酸法和酶法分別水解蘋果果膠，結(jié)果顯示酶法水解果膠半乳糖醛酸產(chǎn)率達(dá)66%，而酸法不過(guò)35%左右，表明酶法比酸法對(duì)果膠聚半乳糖醛酸鏈有更高的解聚作用。作者還采用文獻(xiàn)[25]方法比較了采用酶法和酸化酶解結(jié)合法測(cè)定蘋果果膠、柑橘果膠、甜菜根果膠和菊苣果膠，結(jié)果顯示除甜菜根果膠外，其它測(cè)定結(jié)果兩種方法沒(méi)明顯差異。本研究報(bào)告將分別比較三種水解方法對(duì)煙草果膠測(cè)定的影響，優(yōu)化煙草果膠水解方法。1、材料與方法1.1儀器與試劑ICS3000離子色譜系統(tǒng)、ED3000電化學(xué)檢測(cè)器(美國(guó)Dionex公司),CarboPacPA-10(2mm×50mm)保護(hù)柱,CarboPacPA-10(2mm×250mm)分析柱；CSM-I旋風(fēng)式樣品磨（配40目篩，北京一輕研究所）；AG204分析天平，（瑞士梅特勒公司，感量0.1mg）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);HH4數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）；FD240鼓風(fēng)式烘箱（德國(guó)Binder公司）；SHA-BA型水浴恒溫振蕩器（金壇榮華儀器制造有限公司），Milli-Q-Academic超純水發(fā)生器(法國(guó)MILLIPORE公司)半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品（含1個(gè)結(jié)晶水，≥97%，Sigma公司）；超純水（電阻率≥18MΩ?cm）；50%氫氧化鈉溶液(美國(guó)Fisher公司)；無(wú)水乙酸鈉（優(yōu)級(jí)純，美國(guó)戴安公司）；無(wú)水乙醇、乙酸、三水乙酸鈉、鹽酸、苯甲酸皆為分析純(上海國(guó)藥集團(tuán))。固體果膠酶（Ruibio，酶活30u/mg，來(lái)源：Aspergillusniger，1個(gè)酶活力單位（u）定義為可在pH3.5、55℃下每小時(shí)水解果膠生成1mg半乳糖醛酸1.2試劑配制1.2.10.1mol/L乙酸/乙酸鈉緩沖溶液，pH4.0；1.2.20.05、0.1、0.2、0.5、2、4、6mol/L鹽酸溶液；1.2.3果膠酶溶液，300u/mL，乙酸/乙酸鈉緩沖溶液配制；1.2.480%乙醇溶液；1.2.5標(biāo)準(zhǔn)溶液半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稱取30mg（精確至0.1mg）半乳糖醛酸，0.1%苯甲酸溶液溶解并定容至100mL容量瓶中，定為半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于4C半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別移取50L、100L、250L、1.2.6流動(dòng)相超純水作為流動(dòng)相A。移取50%氫氧化鈉溶液13.1mL，稀釋定容至1L，配制250mmol/L氫氧化鈉溶液，作為流動(dòng)相B；稱取無(wú)水乙酸鈉82g，溶解后定容至1.3樣品處理方法1.3.1酸解法將煙葉切絲，40℃下烘干，粉碎，過(guò)40目篩，置于樣品瓶中備用；準(zhǔn)確稱取1g（精確至0.1mg）煙末，置于150mL圓底燒瓶中,加入60mL無(wú)機(jī)酸溶液，在沸水水浴中回流水解，冷卻過(guò)濾，定容至100mL，取1.0mL至1001.3.2酶解法準(zhǔn)確稱取1g（精確至0.1mg）煙末，置于150mL磨口三角瓶中，加入100mL80%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇，沸水浴回流1h以除去水溶性糖[28-31]，趁熱抽濾，80%熱乙醇潤(rùn)洗三遍。將濾片放入150mL磨口三角瓶中，使用100mL乙酸/乙酸鈉緩沖溶液將殘留在布氏漏斗壁上的樣品殘?jiān)慈肴瞧恐?，加入果膠酶溶液，55℃水浴酶解，酶解結(jié)束后布氏漏斗真空抽濾，濾渣用蒸餾水洗滌3次，合并濾液定容至250mL，取1.0mL稀釋至250mL后過(guò)0.451.3.3酸化酶解結(jié)合法酸化準(zhǔn)確稱取1g（精確至0.1mg）煙末，置于150mL磨口三角瓶中,加入100mL80%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇，沸水浴回流1h以除去水溶性糖，趁熱抽濾，80%熱乙醇潤(rùn)洗三遍。將濾片放入150mL磨口三角瓶中，使用100mL0.05mol/L鹽酸溶液將殘留在布氏漏斗壁上的樣品殘?jiān)慈肴瞧恐校兴?h，趁熱布氏漏斗真空抽濾，熱水潤(rùn)洗三遍，濾液定容至250殘?jiān)杆鈱⑸鲜龀闉V樣品殘?jiān)D(zhuǎn)移至150mL磨口三角瓶中，加入100mL乙酸/乙酸鈉緩沖溶液和1mL果膠酶溶液，55℃水浴振蕩后布氏漏斗真空抽濾，濾液定容至250取1mL上述溶液A于100mL磨口三角瓶中，加入20mL乙酸/乙酸鈉緩沖溶液和1mL果膠酶溶液，55℃水浴振蕩后酶解液轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，加入1.0mL溶液B，以0.1%苯甲酸溶液定容，得溶液C，過(guò)0.451.4離子色譜測(cè)定方法色譜柱：CarboPacPA-10（2mm×250mm）柱溫：30℃；流速：0.25mL/min；進(jìn)樣量：25表1淋洗液梯度洗脫程序時(shí)間(min)流動(dòng)相A流動(dòng)相B流動(dòng)相C0.0025%60%15%15.0025%60%15%表2檢測(cè)器檢測(cè)電位波形時(shí)間(sec)電位(V)積分狀態(tài)0.000開(kāi)始0.400.10結(jié)束0.41-2.000.42-2.000.430.600.44-0.100.50-0.102、結(jié)果與討論2.1色譜條件的選擇糖類分子具有電化學(xué)活潑型及在強(qiáng)堿溶液中呈離子化狀態(tài)，Rocklin等[31]于1983年首先報(bào)導(dǎo)了采用陰離子交換色譜柱分離，脈沖安培檢測(cè)器測(cè)定糖的新方法。中性糖類是pKa在12-14之間的弱酸，在強(qiáng)堿溶液中會(huì)全部或者部分以陰離子形式存在，可以在陰離子交換柱上被保留并得到分離?？紤]到半乳糖醛酸上的羧基對(duì)酸性單糖在陰子分析柱上的洗脫，因此采取了淋洗強(qiáng)度較大的氫氧化納/醋酸鈉淋洗液體系[16,17,32]。圖1中的2張色譜圖分別為:(a)標(biāo)樣圖譜，(b)煙草水解樣品圖譜。由圖1中的(a)圖可以看出，半乳糖醛酸獲得了很好的分離效果，且分析速度快僅在12min內(nèi)就完成了分析。(b)圖是煙草水解樣品的色譜圖，水解液中的中性單糖大部分在4min之內(nèi)即完全出峰，且由于脈沖安培檢測(cè)器具有優(yōu)越的選擇性使干擾因素大大降低，提高了半乳糖醛酸測(cè)定的靈敏度和準(zhǔn)確度。(a)(b)圖1離子色譜法測(cè)定半乳糖醛酸色譜圖2.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、線性范圍及檢出限按照1.2.5方法配制半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，離子色譜分析，用半乳糖醛酸色譜峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，得線性回歸方程及其相關(guān)參數(shù)，見(jiàn)圖2。半乳糖醛酸線性回歸方程為C=0.3941×Area-0.001,相關(guān)系數(shù)為1，滿足外標(biāo)法定量要求。將標(biāo)準(zhǔn)溶液最低濃度重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，以此標(biāo)準(zhǔn)偏差3倍作為儀器的檢出限，半乳糖醛酸檢出限為4.05×10-3mg/L。圖2半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線2.3酸解法測(cè)定煙草果膠按照1.3.1方法分別采用2mol/L、4mol/L、6mol/L鹽酸溶液進(jìn)行煙草樣品水解，結(jié)果見(jiàn)圖3。a、b、c分別為2mol/L、4mol/L、6mol/L鹽酸溶液水解半乳糖醛酸累積量隨時(shí)間變化圖。（a）（b）（c）圖3不同濃度鹽酸溶液水解煙草樣品半乳糖醛酸累積量變化圖從圖3可以看出，不同鹽酸濃度水解煙草樣品的規(guī)律類似，在水解一定時(shí)間后，半乳糖醛酸累積量呈下降趨勢(shì)，原因是半乳糖醛酸在酸溶液下不穩(wěn)定，容易發(fā)生降解，規(guī)律與文獻(xiàn)類似[16,26,27]。煙草內(nèi)的果膠在酸作用下發(fā)生解聚生成半乳糖醛酸，水解產(chǎn)物半乳糖醛酸在酸作用下進(jìn)一步生成內(nèi)酯類物質(zhì)，半乳糖醛酸的累積量是由這兩步反應(yīng)速率所決定，當(dāng)果膠解聚作用強(qiáng)于半乳糖醛酸酯化作用時(shí)，半乳糖醛酸累積量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，而當(dāng)半乳糖醛酸酯化作用強(qiáng)于果膠解聚作用時(shí)，半乳糖醛酸累積量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。為了進(jìn)一步說(shuō)明半乳糖醛酸在酸性條件下酯化作用，將半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品溶解在2mol/L鹽酸溶液中，沸水浴回流，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出隨著酸解時(shí)間的增長(zhǎng)，半乳糖醛酸逐漸發(fā)生酯化反應(yīng)，至12h僅殘留26%。由于半乳糖醛酸在酸溶液中不穩(wěn)定，容易發(fā)生酯化作用，因此，直接采用酸水解方法測(cè)定煙草中的果膠會(huì)造成結(jié)果偏低。圖4半乳糖醛酸2N鹽酸降解曲線2.4酶解法測(cè)定煙草果膠按照1.3.2方法酶解煙草樣品，考察不同果膠酶酶加量對(duì)煙草果膠水解影響（酶解時(shí)間為4h），結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可以看出在酶加量為400mg時(shí)，酶解基本完全?？疾觳煌附鈺r(shí)間對(duì)煙草果膠水解影響（酶加量為400mg，），結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖6可以看出，在酶解4h后酶解基本完全，與文獻(xiàn)[30]研究結(jié)果一致。對(duì)比酸解法和酶解法，可以看出酶解法測(cè)得的樣品中果膠含量要高于酸解法。圖5不同酶加量對(duì)果膠降解程度的影響圖6水解時(shí)間對(duì)果膠降解程度的影響為了驗(yàn)證酶解法水解果膠是否完全，將酶解后的樣品殘?jiān)?酶加量500mg，酶解時(shí)間4h處理后的樣品殘?jiān)?轉(zhuǎn)移至150mL圓底燒瓶中，加入60mL2mol/L鹽酸溶液，沸水浴回流2h，測(cè)定酸解液中的半乳糖醛酸含量，結(jié)果見(jiàn)表3。表3結(jié)果顯示烤煙煙梗樣品仍能檢測(cè)到含量為0.78%（占樣品總重）的半乳糖醛酸，說(shuō)明樣品中仍然有超過(guò)0.78%的果膠未完全水解，成品卷煙的結(jié)果與煙梗類似，究其原因可能是原果膠包裹在煙草細(xì)胞壁物質(zhì)中，果膠酶不容易作用到，造成不能完全水解。表3酶解法測(cè)定煙草中果膠含量樣品酶解酶解殘?jiān)?N鹽酸水解烤煙煙梗8.67%0.78%成品卷煙7.35%0.42%注：烤煙煙梗樣品為原梗，成品卷煙為一品黃山。2.5酸化酶解結(jié)合法測(cè)定煙草果膠植物果膠分別以原果膠、果膠酯酸、果膠酸三種形態(tài)存在植物組織中，原果膠是與纖維素、半纖維素結(jié)合在一起的高度甲酯化的聚半乳糖醛酸，只存在于細(xì)胞壁中，不溶于水[5]。煙葉成熟后細(xì)胞壁中仍然會(huì)存在一定量原果膠，原果膠與細(xì)胞壁物質(zhì)糾纏在一起，通過(guò)酶作用很難進(jìn)行水解完全，而且在原果膠中，聚半乳糖醛酸可被甲醇部分酯化，并以金屬橋（特別是鈣離子）與多聚半乳糖醛酸分子殘基上的游離羧基相連接，造成原果膠結(jié)晶度高，不易水解。不溶于水的原果膠通過(guò)酸作用可以破壞金屬離子橋（離子鍵），增加原果膠的親水性，與此同時(shí)通過(guò)酸化作用可以破壞細(xì)胞壁，使包裹在里面的原果膠充分裸露出來(lái)，有利于果膠酶的作用。有鑒于此，采用0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L鹽酸溶液酸化處理煙草樣品（沸水浴回流1h），然后使用果膠酶分別水解殘?jiān)退峄海瑲堅(jiān)附馔旰笫褂?mol/L鹽酸水解，離子色譜測(cè)定半乳糖醛酸含量（占樣品總重），結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可以看出，采用不同濃度的鹽酸處理煙草樣品，基本未造成果膠的水解，在0.05mol/L條件下未檢出，0.05mol/L以上濃度的僅造成微弱的水解。采用鹽酸溶液處理樣品，煙草中的果膠并未能全部溶解，從表4可以看出仍然有大量的果膠殘存在殘?jiān)?，因此必須?duì)鹽酸提取液和殘?jiān)歼M(jìn)行酶解才能不至于使測(cè)定結(jié)果偏低。為了驗(yàn)證果膠酶對(duì)鹽酸溶液提取后的殘?jiān)附馔瓿沙潭?，將酶解后的樣品殘?jiān)D(zhuǎn)移至150mL圓底燒瓶中，加入60mL2mol/L鹽酸溶液，沸水浴回流2h，測(cè)定該酸解液中的半乳糖醛酸含量，結(jié)果顯示半乳糖醛酸僅有微量殘留，說(shuō)明采用鹽酸酸化后進(jìn)行酶解，殘?jiān)械墓z水解比較徹底。表4酸化酶解法測(cè)定煙草中果膠含量酸化液酸化液酶解殘?jiān)附饷附鈿堅(jiān)}酸水解0.05N-3.95%5.80%0.09%0.1N0.07%3.88%5.98%0.10%0.15N0.08%3.74%6.11%0.08%0.2N0.09%4.02%5.96%0.07%0.5N0.19%3.75%6.12%0.07%注：-為未檢出；實(shí)驗(yàn)樣品為烤煙原梗；酸化液取1mL進(jìn)行酶解，酶解條件為100mg果膠酶、酶解時(shí)間4h；殘?jiān)附鈼l件為400mg酶加量，酶解時(shí)間4h。上述酶解是對(duì)酸化液和殘?jiān)謩e進(jìn)行酶解的，下面將對(duì)酸化液和殘?jiān)瑫r(shí)酶解，采用0.05mol/L鹽酸和0.59mol/L檸檬酸溶液分別酸化處理樣品，沸水浴回流1h，酸化完畢后冷卻。鹽酸酸化液使用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，加入pH4檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖鹽；檸檬酸酸化液直接加入一定比例的檸檬酸鈉，使溶液pH值為4。分別加入400mg果膠酶，55℃水浴水解，離子色譜測(cè)定半乳糖醛酸含量，結(jié)果見(jiàn)表5。從表5可以看出，對(duì)酸化液和殘?jiān)瑫r(shí)酶解，酶解不能完全。使用硫酸苯酚法[5]監(jiān)測(cè)酸化液中還原糖，苯酚溶液呈棕黑色，說(shuō)酸化液中存在一定量的還原糖，這些還原糖是由酸水解煙草中多糖物質(zhì)產(chǎn)生的，這些糖分的存在對(duì)于果膠酶有底物抑制作用[29,30,33]，降低了果膠酶的活性，以致酶解不能完全。為了順利對(duì)含糖量較高的酸化液進(jìn)行有效的酶解，采取的方法是對(duì)酸化液進(jìn)行稀釋，降低其中的糖分含量，使糖不至于抑制果膠酶活性，取1mL酸化液加入緩沖溶液后，溶液在硫酸苯酚中顯淡黃色，說(shuō)明其中的糖分濃度已經(jīng)很低，這樣能夠使果膠有效表5樣品酸化酶解測(cè)定結(jié)果酶解酶解殘?jiān)}酸水解鹽酸酸化6.58%0.79%檸檬酸酸化7.28%0.68%注：實(shí)驗(yàn)樣品為烤煙原梗。綜合上述分析，采用0.05mol/L鹽酸酸化煙草樣品（注：實(shí)驗(yàn)樣品為烤煙成品梗絲），再分別對(duì)酸化液和殘?jiān)M(jìn)行酶解，合并酶解液，離子色譜進(jìn)行定量分析。分別考察不同酶加量（酶解時(shí)間2h）和酶解時(shí)間（酶加量10mg）對(duì)殘?jiān)泄z水解影響，結(jié)果見(jiàn)圖7、8；不同酶加量（酶解時(shí)間1h）和酶解時(shí)間（酶加量10mg）對(duì)酸化液中果膠水解影響，結(jié)果見(jiàn)圖9、10。從圖7可以看出隨著酶用量的增加，半乳糖醛酸的測(cè)定量也增加，當(dāng)加酶量>5mg后，半乳糖醛酸的測(cè)定量幾乎保持不變，說(shuō)明10mg果膠酶(酶活30u/mg)就足以酸化后殘?jiān)械墓z水解出來(lái)。從圖8可以看出隨反應(yīng)時(shí)間的增加，半乳糖醛酸的測(cè)定量也變大，直到t>90min后才趨于平緩，因此確定2h為果膠酶酶解果膠水解時(shí)間。圖9規(guī)律與圖7類似，酶加量>5mg后，半乳糖醛酸的測(cè)定量幾乎保持不變，圖10中酸解液中果膠在酶解時(shí)間30min之后酶解完全。綜合上述條件優(yōu)化的結(jié)果，確定酶解條件。殘?jiān)罴衙附鈼l件：1g煙末殘?jiān)?00mLpH4乙酸/乙酸鈉緩沖液、10mg果膠酶、55℃水浴水解2h；酸化液最佳酶解條件：1mL酸化液、20mLpH4乙酸/乙酸鈉緩沖液、10mg果膠酶、55圖7酶加量對(duì)殘?jiān)泄z水解影響圖8酶解時(shí)間對(duì)殘?jiān)泄z水解影響圖9酶加量對(duì)酸化液中果膠水解影響圖10酶解時(shí)間對(duì)酸化液中果膠水解影響2.6測(cè)定結(jié)果的計(jì)算樣品中的半乳糖醛酸含量按照式（1）進(jìn)行計(jì)算，果膠含量以半乳糖醛酸計(jì)。X=k（C-C0）V×100%…………（1）m(1-W)式中，X——試樣中的果膠含量，%；C——測(cè)試樣品溶液中半乳糖醛酸濃度，單位為毫克每升（mg/L）；C0——空白樣品溶液中半乳糖醛酸濃度，單位為毫克每升（mg/L）；V——溶液C的體積，單位為升（L）；m——試樣質(zhì)量，單位為毫克（mg）；W——試樣含水率，%；k——溶液A體積與酶解取樣體積之比。2.7方法重復(fù)性和回收率按照2.5確定的前處理方法，處理煙草樣品，重復(fù)測(cè)定五次，考察重復(fù)性。果膠含量(以半乳糖醛酸計(jì))的測(cè)定值分別為10.43%、10.54%、10.46%、10.44%、10.66%，平均測(cè)定值為10.50%，RSD為0.91%，表明本法精密度較高。在樣品中加入純果膠標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma,P9135,半乳糖醛酸含量74%），考察方法的回收率，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果顯示回收率為94%-101%，回收率較高，滿足定量分析要求。表6果膠回收率果膠添加量(mg)換算成半乳糖醛酸(mg)測(cè)定值（mg）回收率(%)00105.0-52.638.9141.794.399.173.3179.1101.0200.4148.3249.097.12.8方法適用性驗(yàn)證分別按照2.5確定的前處理方法處理烤煙、香料煙、白肋煙和成品卷煙樣品，樣品酸化液分別酶解1h和2h以考察酶解條件的適用性，樣品殘?jiān)附馔瓿珊笫褂?mol/L鹽酸水解以考察酶解是否完全，結(jié)果見(jiàn)表7。從表7可以看出酸化酶解1h和2h沒(méi)有明顯區(qū)別，不同樣品殘?jiān)附庖脖容^完全，說(shuō)明2.5確定方法對(duì)于不同種類的樣品皆能適用。表7方法適用性驗(yàn)證酸化液酶解1h酸化液酶解2h酶解殘?jiān)}酸水解烤煙5.49%5.47%0.04%香料煙5.40%5.36%0.05%白肋煙3.77%3.75%0.13%成品卷煙4.66%4.50%0.06%2.9比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用所建立的方法，分別在安徽中煙、上海煙草集團(tuán)、江西中煙、廣東中煙4家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)，選取比對(duì)樣品為烤煙煙梗（梗絲）、烤煙（07皖南C3FA）、白肋煙（07建始B1F）、香料煙（04新疆AB級(jí)）、烤煙型卷煙（一品黃山）、混合型卷煙（都寶）共計(jì)6個(gè)典型樣品，每個(gè)樣品分別由兩個(gè)實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)立測(cè)定，共計(jì)獲得8個(gè)比對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表8表8比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品名稱安徽上海江西廣州變異系數(shù)12121212煙梗10.54%10.46%10.33%10.13%10.63%10.43%10.37%10.52%1.46%烤煙8.09%7.95%8.16%8.08%7.52%7.81%7.83%8.02%2.60%白肋煙8.15%7.98%7.63%7.46%8.12%8.20%7.79%7.95%3.36%香料煙7.22%7.38%7.10%6.81%6.46%6.70%6.99%7.11%4.29%一品黃山8.33%8.16%8.07%7.83%8.03%8.23%7.67%7.85%2.77%都寶9.29%9.01%8.65%8.87%9.00%8.83%8.92%9.06%2.09%比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用本標(biāo)準(zhǔn)確定的果膠測(cè)定方法，不同實(shí)驗(yàn)室得到了較為一致的分析結(jié)果，對(duì)不同類型的煙草樣品測(cè)定結(jié)果皆令人滿意。3、結(jié)論建立了一種離子色譜法測(cè)定煙草中果膠的分析方法，優(yōu)化了酸化酶解結(jié)合法水解煙草中果膠的前處理?xiàng)l件，本法選擇性強(qiáng),重復(fù)性好,回收率高,可用于煙葉果膠含量的批量檢測(cè)。參考文獻(xiàn)1.Layten,D.andMark,T.N.Tobaccoproduction,chemistryandtechnology[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2003.255.2.閆克玉.煙草化學(xué)[M].鄭州:鄭州大學(xué)出版社,2002.50.3.金聞博,戴亞.煙草化學(xué)[M].北京:清華大學(xué)出版社,1993.53.4.李漢超,王淑嫻.煙草、煙氣化學(xué)及分析[M].鄭州:河南科學(xué)技術(shù)出社,1991.87.5.大連輕工業(yè)學(xué)院,華南理工大學(xué),鄭州輕工業(yè)學(xué)院,等.食品分析[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1999.213.6.Dische,Z.Anewspecificcolorreactionofhexuronicacids.JournalofBiologicalChemistry,1947(167),189-198.7.Blumenkrantz,N.andAsboe-Hansen,G.Anewmethodforquantitativedeterminationofuronicacids.AnalyticalBiochemistry,1973(54),484-489.8.Kinter,P.K.andVanBuren,J.P.Carbohydrateinterferenceanditscorrectioninpectinanalysisusingthem-hydroxydiphenylmethod.JournalofFoodScience,1982(47),756-764.9.Penman,A.andSanderson,G.R.Amethodforthedeterminationofuronicacidsequenceinalginates.CarbohydrateResearch,1972(25),273-282.10.Scott,R.W.Colorimetricdeterminationofhexuronicacidsinplantmaterials.AnalyticalChemistry,1979(51),936-941.11.Matsuhashi,S.andHatanaka,C.Differencebetweenthefreeandconjugatedgalacturonateresiduesintheircolorreactionwithcarbazoleorm-hydroxybiphenylreagents.BioscienceBiotechnologyandBiochemistry,1992(56),1141-1153.12.Jones,T.M.andAlbersheim,P.Agasliquidchromatographicmethodforthedeterminationofaldoseanduronicacidconstituentsofplantcellwallpolysaccharides.PlantPhysiology,1972(49),926-936.13.Ford,C.W.Aroutinemethodforidentificationandquantitativedeterminationbygas–liquidchromatographyofgalacturonicacidinpecticsubstances.JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,1982(33),318-324.14.DeRuiter,G.A.;Schols,H.A.;Voragen,A.G.J.andRombouts,F.M.Carbohydrateanalysisofwater-solubleuronicacidcontainingpolysaccharideswithhigh-performanceanion-exchangechromatographyusingmethanolysiscombinedwithTFAhydrolysisissuperiortofourothermethods.AnalyticalBiochemistry,1992(207),176-185.15.Quemener,B.andThibault,J.F.Assessmentofmethanolysisforthedeterminationofsugarsinpectins.CarbohydrateResearch,1990(206),277-287.16.Haikel,G.;Nicolas,M.;Katherine,N.;Bernard,W.andMichel,P.Kineticofthehydrolysisofpectingalacturonicacidchainsandquantificationbyionicchromatography.FoodChemistry,2006(96),477-484.17.吳勝芳,王樹(shù)英,陶冠軍,等.離子色譜法測(cè)定多糖水解液中的半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2005,24（4）:86-88.18.Selvendran,R.andMarch,J.F.;Ring,S.Determinationofaldosesanduronicsacidcontentofvegetablefiber.AnalyticalBiochemistry,1979(96),282-292.19.Biermann,C.J.Hydrolysisandothercleavagesofglycosidiclinkagesinpolysaccharides.AdvancesinCarbohydrateChemistryandBiochemistry,1988(46),251-271.20.Schols,H.A.;Bakx,E.J.;Schipper,D.andVoragen,A.G.J.Axylogalacturonansubunitpresentinthemodifiedhairyregionsofapplepectin.CarbohydrateResearch,1995(279),265-279.21.Quemener,B.andThibault,J.F.Assessmentofmethanolysisforthedeterminationofsugarsinpectins.CarbohydrateResearch,1990(206),277-287.22.Garleb,K.A.;Bourquin,L.D.andFahey,G.C.Galacturonateinpecticsubstancesfromfruitsandvegetables:comparisonofanionexchangeHPLCwithpulsedamperometricdetectiontostandardcolorimetricprocedure.JournalofFoodScience,1991(56),423-426.23.Matsuhashi,S.;Inoue,S.I.andHatanaka,C.Simultaneous