人教版高中生物必修三《DNA片段的擴增及電泳鑒定》教學設計

人教版高中生物必修三《DNA片段的擴增及電泳鑒定》教學設計

一、教材分析

本節(jié)是人民教育出版社普通高中《生物學選擇性必修3生物技術與工程》第3章第2節(jié)，

探究實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定，適用于高二年級學生學習。2017版《高中生物學課程

標準》中，要求學生“闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達載體

的構建、目的基因導入受體細胞和目的基因及其表達產(chǎn)物的檢測鑒定等步驟”。建議開展“利

用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增DNA片段并完成電泳鑒定”的實驗活動。

學生已經(jīng)學習了PCR反應的原理：利用引物與模板特異性結合，通過設計特異性引物可以

對特定的DNA片段進行擴增。生物大分子帶負電，在電場中會遷移，在瓊脂糖凝膠中遷移的速

度與分子量的大小成正相關，所以可以將不同大小的DNA片段進行區(qū)分，再與標準DNA進行比

對，大致估測出待測DNA的片段長度。本實驗有助于學生進一步理解PCR反應的原理，掌握

PCR和瓊脂糖凝膠電泳技術，認同現(xiàn)代生物技術的應用價值，運用數(shù)學方法探究生物學問題，

提高核心素養(yǎng)。

二、教學目標

1.結合生物體中DNA復制過程以及生物大分子的特性說出PCR技術和電泳技術的基本原理,

進一步加深結構與功能密切聯(lián)系的生命觀念。

2.從引物與模板的特異性結合角度分析，得出利用PCR和電泳技術對未知DNA分子鑒定的

機理，培養(yǎng)科學思維。

3.在教師的引導下設計科學合理的實驗流程（特別注意對照組設置的意義）并實施實驗，

能夠對實驗結果進行準確分析并得出結論，體會并學會科學探究的一般過程。

4.積極關注社會熱點問題，對相關消息作出理性解釋和判斷，培養(yǎng)社會責任。

三、教學過程

1.創(chuàng)設情境，導入新課

2009年，河南省文物考古研究院對位于河南省安陽市西高穴村南部的被盜東漢大墓進行

了搶救性發(fā)掘，該墓葬隨后被確認為魏武帝曹操之陵墓，即高陵。在曹操墓的發(fā)掘過程中，考

古人員共在高陵陵園內發(fā)現(xiàn)三具遺骸。其中，兩具遺骸比較完整，判定一具為60歲左右男性，

一具為老年女性。但另一具遺骸非常不完整，性別仍有待認定。

2.提出問題，展開探究

假設你是考古人員，請問可用什么方法確定該遺骸的性別？

材料一、人類的性別決定

人類的性別是由性染色體所決定的，女性的性染色體是XX型，男性的性染色體是XY型。Y染

色體上含有發(fā)育為男性的特殊基因，例如DYZ1基因，位于人類Y染色體上，其特異序列長度

154bpo具體堿基序列如下：

5'^GTTGCTGGCGCCTCCACTTTATTCCAGGCCTGTCCGAGGCCCCAAGAGTGCGfiCCGCAASCTTGTGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGC

|山仔…I…”+，，卜?“，W++，，“，…+卜，，“+，，”+—，+?一卜，“?，|-“|，，+?”，，?"+“"+，，"卜

3'CAACGACCGCGGAG6TGAAATAAGGTCCGGACAGGCTCCGGGGTTCTCACGCCGGCGTTCGAACACCCCAATACGATCAATAACGAGTCG

GGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGGATCTCAGCCATTCGTTCCCATTCCATTTCAATCGCGGCGATT31

-，+一中—“葉,““"葉『++"+”，+一葉―—+—訃—*卜,+中|

CCACCGTCGTCGGTTGAGTCGAAGGAAAGCCCGAAACAATCGTCCTAGAGTCGGTAAGCAAGGGTAAGGTAAAGTTAGCfiCCGCTAA^5'

檢測樣本中是否含有154bp的DYZ1基因？如何觀察DNA中是否含有DYZ1基因？

要觀察到某一特定大小的DNA片段，例如前面提到的長度為154bp的DYZ1基因，可以利

用瓊脂糖凝膠電泳的辦法，將其鑒定出來。DNA分子在電泳液中帶負電荷，在電場中向正極移

動。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡結構，DNA分子通過時會受到阻力。DNA片段越大，受到的阻力也越

大，因此在凝膠電泳中遷移較慢。經(jīng)過一段時間電泳后，不同大小的DNA片段就區(qū)分開來，形

成不同的條帶。

標&DMAM

lOOObp

SOObp

400bp

300bp

200bp

lOObp

電泳后,大量DNA片段通過特異性的核酸染料染色，我們就可以清楚的看到DNA電泳條帶。

例如，在標準DNA分子電泳后有大小依次為lOObp,200bp,300bp,400bp,500bp等條帶，通

過與標準DNA對比，比如在一號泳道出現(xiàn)在lOOObp的位置出現(xiàn)了條帶，說明樣本中有大量的

lOOObp大小的DNA,2號泳道出現(xiàn)兩條條帶，說明樣本中有兩種DNA片段。我們要檢測的DYZ1

基因大小為154bp,其條帶應位于100-200之間的位置。

老師提問：一個DNA分子進行電泳能觀察到條帶嗎？

答：不能，我們觀察到的DNA條帶是成千上萬個相同DNA分子經(jīng)過電泳后而形成的。

老師總結：DNA電泳可以檢測出目標DNA,但前提是要獲得大量的長度為154bp的DYZ1基因的

DNA片段。那我們從樣本中只能提取到極少量的DNA,遠達不到檢測的要求，怎么辦？如何從

微量DNA中獲得大量的DYZ1基因片段?

PCR技術可以實現(xiàn)從微量DNA中大量獲得某一特定的DNA片段。聚合酶鏈式反應（簡稱PCR）

是一種用于復制、擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA

復制。PCR的最大特點是能在短時間內將微量的DNA大幅擴增。我們都知道，在體內DNA作為

遺傳為物質是可以復制的，PCR技術其實就是實現(xiàn)了DNA在體外條件的復制。在體內，DNA聚

合酶可以以四種脫氧核甘酸為原料，以DNA兩條鏈為模板，合成新的DNA分子。DNA聚合酶起

始DNA的復制需要以一段15-30個堿基的單鏈RNA作為聚合酶作用的起點，我們把這一小段

RNA叫做引物。引物與DNA單鏈結合，然后招募DNA聚合酶完成DNA的復制。DNA復制完成后

再將RNA引物切除，補上DNA。根據(jù)DNA復制的原理，我們只需要在試管加入DNA模板，DNA

聚合酶，以及適當?shù)囊锞涂梢詫崿F(xiàn)DNA的體外復制。兩種引物分別作為復制的起始位點，保

證了擴增出來的DNA就是引物之間的DNA片段。

PCR的原理

引物1DNA聚合酶

一」.....*

DNA聚合酶"物2

..............特定DNA片段

根據(jù)前面的分析，要利用PCR技術復制DYZ1基因，那么，首先要在人類基因組數(shù)據(jù)庫中

查閱了DYZ1的基因序列，如圖，紅色框內的DNA即為要復制的DNA片段。我們設計了上、下

游的兩種引物，并送到生物公司合成好了。所以，理論上只要在試管中加入模板DNA、DNA聚

合酶、四種脫氧核甘酸，上、下游引物就可以實現(xiàn)DNA的體外擴增。

引物的設計

上游引物5,TCC<TnATTCCAGGCCrcTCC3,

下游引物5'TTGAAATCGAATGGGAAOGAATCG3,

3.配制反應體系，進行PCR

我們使用的PCR試劑叫做2XPCRmix,在這個試劑里面含有DNA聚合酶，四種脫氧核甘

酸，以及酶發(fā)揮作用的緩沖液等，我們只需要加入DNA模板，引物就可以進行PCR反應了。

2XPCRmix使用說明書

產(chǎn)品簡介：2XPCRMix中含有耐高溫的DNA聚合酶，dNTP,PCR反應所需的緩沖液等,

只需加入適量引物、模板和水即可進行PCR擴增。

使用說明：按下表的量混勻PCR反應所需的各種溶液：

試劑最終濃度體積體積

水—7uI3.4uI

10pg-

模板DNA10RI5uI

1ug*

引物1(10HM)0.8RM4uI1.6uI

引物2(10HM)0.8RM4uI1.6uI

2XPCRMix1X25yI10uI

總體積-50uI20u1

注意事項：由于PCR反應非常靈敏可以擴增目的基因序列超過1000萬倍，在使用時請注意避

免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設置不加模板的空白對照以確認是否有待擴增DNA的污

染。

本實驗使用的PCR反應體系

2XPCRmix

25uL

（含甑四種脫軌核仔酸，緩沖液等）

上游引物（10umol/L）4nL

下游引物（10umol/L）4uL

模板DNA10uL

H2O7uL

共：50uL

如果要鑒定某DNA樣本是來自男性還是女性，我們只要以這個DNA作為模板，進行PCR,

如果能產(chǎn)生大量的DYZ1片段，這說明樣本DNA模板中含有DYZ1基因，是男性，反之為女性。

為了使實驗更具說服力，我們還設計了幾組對照。加入水的空白對照組，加入男性DNA的陽性

對照組，加入女性DNA的陰性對照組。

配制PCR反應體系:

g組別1234

7ul7ul7ul7ul

H2O

上游引物4ul4ul4ul4ul

下游引物4ul4ul4ul4ul

2Xlaq

25ul25ul25ul25ul

酶mix

樣品DNA男性DNA女性DNA無菌水

模板

lOullOullOullOul

性

性

陽

陰空白

照

照

對

實驗組對

對照

接下來，我們來制備陽性對照組和陰性對照組的DNA模板。由于PCR反應非常靈敏，只需

要極少量模板DNA就可以了。所以我們只需要按以下方法提出少量口腔上皮細胞的DNA就行了。

那么我需要一男一女兩位同學來提供口腔上皮細胞，有志愿的嗎？模板已經(jīng)制備好了，接下來

我們來配置PCR反應體系。

口腔上皮細胞DNA粗提取液（模板）的制備：取材前，用涼開水漱凈，去除口腔內的食物

殘渣；用無菌的牙簽在口腔兩側頰部輕輕刮動數(shù)次，獲得口腔上皮細胞；將牙簽放入300ul

裂解液中，反復攪動幾次，將細胞洗下，即可。

在課前，我們已經(jīng)把上面的四種物質加好了，所以只需要在每組溶液中加入10微升模板

就可以了。第一組加入未知樣本DNA,第二組……PCR反應溶液配好以后放入PCR儀就可以實

現(xiàn)體外的DNA擴增了。啟動PCR儀，它將按程序來進行反應。首先看PCR儀器的反應程序：主

要是三步溫度變化：94℃,30s,稱為變性；55℃,30s,稱為退火；72℃,30s,稱為延伸。

每一步的目的是什么呢？

PCR的過程

1、變性

目的其國5IUIIUUIIUIUIUIUIIUUIIUUIIIUU3，

目口,至四3,11111皿111］皿皿皿11皿1皿皿5.

94℃

snnnnnnnnnnnnnn‘

3.muniuinMminuimiiiN

變性：加熱使DNA氫鍵斷裂，DNA雙鏈解聚為單鏈。

2、退火

.nnnnnnnnnnnnnn?

3,iiiiKiiiiJuiiniirim5,

-55℃

IUIIUUIIUIUIUIUIIUUIIUUIIIUU

3niwiiiiiiiiiiiiniiiinfliiiiii6

退火：降低溫度，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。

3、延伸

叫卜5IJ哂IIUIIIU—IIIIIUIIIUHU也MIIIU叫3?MinR|n

.，miiTuuni叫unminmni口

72℃

s,IIJJUIlllllllllIllUlIllJlIUUIIIDll3,

-HnniiiiiniiiiiiiinfiiiDniiinii..

5lUIIUIIIUIIIIIUIIIUIIH_,