飼料中土霉素的測(cè)定 編制說(shuō)明

《飼料中土霉素的測(cè)定》編制說(shuō)明（征求意見(jiàn)稿）2024年河南省農(nóng)畜水產(chǎn)品檢驗(yàn)技術(shù)研究院與陜西省畜牧技術(shù)推廣總站合作承擔(dān)了國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)管理司下達(dá)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目，任務(wù)名稱(chēng)為“《飼料中土霉素的測(cè)定》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目”，合同編號(hào)為T(mén)-NY-2024-002-003，本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC76）提出并歸口。因此，我們?cè)贕B/T22259－2008《飼料中土霉素的測(cè)定高效液相色譜法》的基礎(chǔ)素，CAS號(hào)為79-57-2，分子式為C22H24N2O9，分子量460.43。它是淡黃色的晶體粉末，熔點(diǎn)為182℃,微溶于乙醇，極微溶于水。土霉素在空氣中非常穩(wěn)定，遇到光顏色變暗，在堿性溶液中容易被破壞。土霉素的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示，從所以又能夠顯酸性，因此土霉素是一種兩性化合物，且易以及抑制革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌、支原體、衣原體、生物的生長(zhǎng)繁殖，用來(lái)治療呼吸道感染和胃腸道感菌性以及價(jià)格低廉的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)領(lǐng)防，還可以亞治療劑量添加于動(dòng)物飼料，起到刺激動(dòng)物生長(zhǎng)和促進(jìn)為了規(guī)范飼料中土霉素的使用，原農(nóng)業(yè)部第168號(hào)公告），），過(guò)程中，有一些飼料廠及養(yǎng)殖企業(yè)在利益的驅(qū)使下往往預(yù)混劑，從而使動(dòng)物產(chǎn)生耐藥性及藥物殘留，進(jìn)而危害我國(guó)動(dòng)物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第1公告要求，已停用土霉素產(chǎn)品并注銷(xiāo)其進(jìn)口獸藥注冊(cè)證食品中獸藥最大殘留限量》（GB31650-2019）中也對(duì)土霉素/金霉素/四環(huán)素在動(dòng)表1GB31650-2019中對(duì)土霉素的最大殘留限量的規(guī)定動(dòng)物種類(lèi)靶組織殘留限量μg/kg牛/羊/豬/家禽肌肉200肝600腎牛/羊奶家禽蛋400魚(yú)肌肉200蝦肌肉200譜法》（GB/T22259-2008），采用0.05mol/l鹽酸溶液提取樣品中的土霉素，高效并且高效液相色譜檢測(cè)法靈敏度較低，不能準(zhǔn)確定性，無(wú)法滿(mǎn)足當(dāng)前的監(jiān)管需求。因此，亟需對(duì)GB/T22259-2008進(jìn)行修訂，在對(duì)液相方法進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，增加在參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果起草本標(biāo)準(zhǔn)，本標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了飼料中土霉素的檢測(cè)方法，本標(biāo)準(zhǔn)由河南省農(nóng)畜水產(chǎn)品檢驗(yàn)技術(shù)研究院（原河南省獸藥飼料監(jiān)察所）和陜西省畜牧技術(shù)推廣總站負(fù)責(zé)制定工作。技術(shù)歸口單位是全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)。工作流程：立項(xiàng)—成立工作組—查閱國(guó)內(nèi)外資料—收集樣品并進(jìn)行試2024年1月，我單位接到標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)后，由河南省農(nóng)畜水產(chǎn)品檢驗(yàn)技術(shù)研究院與陜西省畜牧技術(shù)推廣總站共同成立了工作組負(fù)責(zé)本標(biāo)準(zhǔn)的起草工作。同時(shí)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)起草工作進(jìn)行了分工，明確各自任務(wù)和職責(zé)，以2024年2月到3月，課題組組織技術(shù)人員通過(guò)大量查閱國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)，全面掌握了土霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化特性等。在此基礎(chǔ)上，2024年4月到7月，參考已有的文獻(xiàn)資料，針對(duì)飼料中土霉素的檢測(cè)方法、儀器條件、方法線(xiàn)性、靈敏度和精確度等進(jìn)行探索，確定了飼料中土霉素的檢測(cè)方法。并在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了多次試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本方法能很好滿(mǎn)足飼料中土霉素的檢測(cè)要求。2024年8月，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析，撰寫(xiě)標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說(shuō)明，形成了《飼料中土2024年9月，分別由、和三家單位對(duì)本方法進(jìn)行了復(fù)核試驗(yàn)，不同實(shí)驗(yàn)室均小于%，線(xiàn)性范圍、檢出限及定量限也與2021年8月，向等家涉及國(guó)內(nèi)科研、教學(xué)和管理等領(lǐng)域的有關(guān)單位的教授、專(zhuān)家和技術(shù)人員征求意見(jiàn)，將《飼料中土霉素的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說(shuō)明征求意見(jiàn)稿及征求意見(jiàn)表發(fā)送至各有關(guān)單位和專(zhuān)家。年月，先后收到份反饋意見(jiàn)并進(jìn)行匯總。對(duì)各有關(guān)單位和專(zhuān)家共提出條意見(jiàn)，起草小組對(duì)反饋意見(jiàn)逐條進(jìn)行研究和討論，查閱、搜集相關(guān)內(nèi)容的科學(xué)依據(jù)，對(duì)有爭(zhēng)議的問(wèn)題通過(guò)電話(huà)和電子郵件等聯(lián)系方式向有關(guān)單位的專(zhuān)家請(qǐng)教。起草小組通過(guò)討論，統(tǒng)一意見(jiàn)后作出的處理意見(jiàn)并提出相應(yīng)的依據(jù)、理由及修改結(jié)果（見(jiàn)意匯總處理表），共于2024年月形成農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《飼料中土霉素的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說(shuō)明在本標(biāo)準(zhǔn)的制定過(guò)程中嚴(yán)格遵循國(guó)家有關(guān)方針、政策、法規(guī)和規(guī)章，標(biāo)準(zhǔn)的編寫(xiě)規(guī)則及表述按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》、GB/T5009.1-2003《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法理化部分總則》和GB/T20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》的要求編寫(xiě)。在標(biāo)通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外土霉素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)，土霉素的檢測(cè)色譜方法主要為液相色譜-紫外檢測(cè)器法和液相色譜-熒光檢測(cè)器法，考慮到基質(zhì)干擾及檢測(cè)方法靈敏度的情況，通過(guò)比較后選擇液相色譜-熒光檢測(cè)器法，通過(guò)對(duì)土霉素Na2EDTA-Mcllvaine緩沖標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光光譜掃描發(fā)現(xiàn)，激發(fā)波長(zhǎng)379nm，發(fā)射多西環(huán)素的測(cè)定》中所述，四環(huán)素類(lèi)檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)380nm，發(fā)射波長(zhǎng)495nm。并查閱資料得知，美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）國(guó)際學(xué)報(bào)第92卷中對(duì)土霉素檢測(cè)方法的報(bào)道中，檢測(cè)波長(zhǎng)為激發(fā)波長(zhǎng)390nm，發(fā)射波長(zhǎng)512nm。對(duì)三種色譜波長(zhǎng)進(jìn)行比較，各波長(zhǎng)條件下土霉素響應(yīng)值如表2。結(jié)果顯示土霉素在激發(fā)波長(zhǎng)土霉素濃度μg/mL文獻(xiàn)依據(jù)激發(fā)波長(zhǎng)nm發(fā)射波長(zhǎng)nm響應(yīng)值0.2土霉素溶液熒光掃描379518679148農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第282號(hào)-2-2020380495566449AOAC國(guó)際學(xué)報(bào)第92卷390512716219并在很大程度上影響檢測(cè)靈敏度。在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第282號(hào)-2-2020《飼料中土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素的測(cè)定》的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)采用WatersXBridgeC18(4.6×150mm，5μm)為色譜柱，考察了該公告中所描述的甲醇-氯化鈣保證下一針?lè)逍螣o(wú)干擾。所以，本標(biāo)準(zhǔn)采用液相色譜條件為：A相：EDTA-CaCl2-乙酸鹽緩沖液，B相：甲醇。梯度洗脫程序：0~13min，85%-85%A；23.1~30min，85%~85%A。流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20μ土霉素具有較強(qiáng)的極性，易與金屬離子螯合形成配合物，同時(shí)在pH<2時(shí)易發(fā)生消去反應(yīng)而生產(chǎn)脫水物，堿性條件下易生成異構(gòu)體，故本方法擬采用酸性提取液。本方法參考原標(biāo)準(zhǔn)0.05mol/l鹽酸溶液、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第282號(hào)-2-2020《飼料中土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素的測(cè)定》中所描述的提取液Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液和AOAC所報(bào)道的酸化甲醇三種提取溶劑。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，3種溶劑中0.05mol/l鹽酸溶液回收率最低，Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液可有效提取飼料中的土霉素藥物，回收率在70%~110%范圍，但提取次數(shù)為3次，并通過(guò)后續(xù)以水稀釋?zhuān)ゴ蟛糠种苄噪s質(zhì)，分離度好，只提取一次即可滿(mǎn)足很好的回收率要求，在85%~115%之間。但對(duì)于添加劑預(yù)混合飼料，特別是微量元素預(yù)混合飼料，由于金屬元素含量較高，與土霉素絡(luò)合嚴(yán)重，導(dǎo)致以酸化甲醇為提取溶劑的回收率較低，在30%左右。因此，配合料、濃縮料、精料補(bǔ)充料采用酸化甲醇作為提取溶劑，添加劑預(yù)混合飼料采用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液作為提取溶劑。采用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取時(shí)，提取步驟對(duì)回收率有一定影響。40℃和50℃發(fā)現(xiàn)，溫度及超聲時(shí)間對(duì)提取效果影響不大。最終確定振蕩10min，min，10000r/min離心10min，移取上清液至另一離心管中。殘?jiān)謩e用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液緩沖液20mL、10mL重復(fù)提取兩次，合并三次上清液，用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液緩沖液定容至50mL，混勻備用。取備用液過(guò)在土霉素液相條件下，考察結(jié)構(gòu)類(lèi)似或有關(guān)藥物對(duì)土霉素檢測(cè)的干擾。根據(jù)土霉素的藥物用途和性質(zhì)，我們選擇金霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、磺胺類(lèi)（磺胺嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺噻唑等13種）、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)（泰樂(lè)菌素、替米考星、吉他霉素）、氟喹諾酮類(lèi)（氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、沙拉沙星、洛美沙星、培氟沙星、恩諾沙星、左氧氟沙星）、酰胺醇類(lèi)（氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素）等藥物進(jìn)行干擾試驗(yàn)。結(jié)果表明，在土霉素的液相檢測(cè)條件下，無(wú)藥物在土霉素處出峰。由此表明金霉素、四環(huán)素等藥物對(duì)土霉素的檢測(cè)無(wú)干擾。干擾試a：土霉素bb：金霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素c：喹諾酮類(lèi)d：酰胺醇類(lèi)ff：大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)精確移取適量標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，用50%甲醇/Mcllvaine-Na2EDTA緩沖溶液分別稀釋?zhuān)频脻舛确謩e為0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，由低濃度到高濃度供高效液相色譜儀測(cè)定。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。求得以50%甲醇稀釋的土霉素回歸方程為Y=2.62×104X+7.08×105，R2=0.999966，以Mcllvaine-Na2EDTA緩沖溶液稀釋的土霉素回歸方程為Y=3.10×106X-2.71×104，空白試樣按相同步驟處理后，測(cè)定結(jié)果表明，在相應(yīng)的保留時(shí)間處，空白試）：濃縮飼料和精料補(bǔ)充料（預(yù)混合飼料、混合型飼料添加劑2g）中，提取后測(cè)定，依據(jù)信噪比S/N≥3，確定其檢出限。試驗(yàn)結(jié)果表明，土霉素在豬、雞配合飼料、濃縮飼料和精料補(bǔ)充料中的檢測(cè)限為1.0mg/kg，在水產(chǎn)飼料中的檢出限為5.0）：濃縮飼料和精料補(bǔ)充料（預(yù)混合飼料、混合型飼料添加劑2g）中，提取后測(cè)定，依據(jù)信噪比S/N≥10且添加回收試驗(yàn)中回收率和批間批內(nèi)RSD滿(mǎn)足要求，確定其定量限。試驗(yàn)結(jié)果表明，土霉素在豬、雞配合飼料、濃縮飼料和精料補(bǔ)充料中的定量限為2.0mg/kg，在水產(chǎn)飼料中的定量限為10.0mg/kg，在添加劑預(yù)混合飼精料補(bǔ)充料和添加劑預(yù)混合飼料中的添加回收情況。結(jié)合168號(hào)公告中土霉素鈣的用量，在空白飼料中添加3個(gè)不同水平土霉素進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)，添加量如下：豬、雞配合飼料為2mg/kg、20mg/kg、100mg/kg，魚(yú)配合飼料為101000mg/kg，各濃度進(jìn)行5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)123452ⅡⅡ90.2Ⅱ95.795.987.197.8123452ⅡⅡ92.199.092.197.6Ⅱ94.791.994.893.8123455ⅡⅡⅡ123452ⅡⅡ98.695.592.397.1Ⅱ89.989.195.793.296.5123452ⅡⅡⅡ123455ⅡⅡ94.491.4123452ⅡⅡ90.297.793.189.197.0Ⅱ97.112345Ⅱ94.493.897.7ⅡⅡ95.494.590.9123455ⅡⅡ98.5Ⅱ99.799.396.198.8123455Ⅱ90.596.997.4Ⅱ94.1Ⅱ97.596.6123455ⅡⅡ95.186.186.294.4Ⅱ98.489.799.5流動(dòng)相的種類(lèi)和比例不僅影響目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和峰形，還會(huì)影響到目標(biāo)化合物的離子化效率，從而影響靈敏度。本實(shí)驗(yàn)分別考察了乙腈-水、甲醇-水、乙時(shí)間(min)A相(％)B相(％)090903.040604.040604.1905.590土霉素在酸性條件下穩(wěn)定，易被質(zhì)子化，本方法使用WatersACQUITYUPLC-XevoTQ-S液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，ESI+離子模式進(jìn)行分析。以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，在ESI+離子模式進(jìn)行全掃描。經(jīng)優(yōu)化，最終所獲得儀器條件被測(cè)物名稱(chēng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)m/z錐孔電壓V碰撞能量eV土霉素461.2>426.1a461.2>337.03826a為定量離子。由于添加劑預(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑提取液中含有大量不揮發(fā)的鹽，同時(shí)為最大程度的除去樣品中的雜質(zhì)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法最好對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化，因此比較了C18、PEP-2、HL見(jiàn)HLB固相萃取柱對(duì)土霉素的凈化效果和回收率均可以較好的滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。渣，過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。研究發(fā)現(xiàn)洗脫液氮?dú)庀麓蹈稍俣ㄈ葜?mL，多西環(huán)率下降至50%左右，其他3種四環(huán)素藥物的回收率都有不同程度下降。因此，本固相萃取柱回收率（%）C18PEP-271.0HLB95.1Plexa84.5本試驗(yàn)分別考察了20%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、80%甲醇溶液作為稀釋溶液，結(jié)果顯示土霉素的響應(yīng)沒(méi)有明顯差異。但隨著有機(jī)相比例增高，殘?jiān)兄崛〔襟E同液相方法，移取提取液0.2mL，加入0.8mL水，渦旋混勻，10用甲醇3mL洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入20%甲醇溶液1采用將空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液與純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)溶液所制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜飼料的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表17，從表中可以看出，基質(zhì)效應(yīng)范圍為基質(zhì)基質(zhì)效應(yīng)豬配合料豬濃縮料2.03豬預(yù)混合飼料雞配合料2.02雞濃縮料0.90雞預(yù)混合飼料精料補(bǔ)充料魚(yú)配合飼料微量元素預(yù)混合飼料0.33植物提取物（蒲公英根固體提取物）微生態(tài)制劑（枯草芽孢桿菌+釀酒酵母）以土霉素的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)基質(zhì)線(xiàn)性方程相關(guān)系數(shù)豬配合料Y=17715.9X-5520.530.9931豬濃縮料Y=46506.1X+4621.430.9986豬預(yù)混合飼料Y=28621.9X+3095.160.9993雞配合料Y=47176.4X-9026.30.9993雞濃縮料Y=19571.7X+261.0050.9970雞預(yù)混合飼料Y=33684.7X-317.9930.9961精料補(bǔ)充料Y=16937.6X-24.49210.9999魚(yú)配合飼料Y=11472.6X+1705.090.9998微量元素預(yù)混合飼料Y=7372.33X-558.4020.9992植物提取物（蒲公英根固體提取物）Y=38528.5X+5027.40.9957微生態(tài)制劑（枯草芽孢桿菌+釀酒酵母）Y=23623.5X+733.8370.9990微量元素預(yù)混合飼料植物提取物（蒲公英根固體提取物）本方法采用液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法考察了空白試樣按相同的步驟處理后，結(jié)檢出限（LOD）：根據(jù)要求，添加適量土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液于空白飼料中，提取定量限（LOQ）：根據(jù)要求，添加適量土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液于空白飼料中，提取后測(cè)定，依據(jù)信噪比S/N≥10（按PtP算）且添加回收試驗(yàn)中回收率、批間批內(nèi)RSD滿(mǎn)足要求，確定其定量限。試驗(yàn)結(jié)果表明，土霉素在飼料中的定量限為0.05采用標(biāo)準(zhǔn)添加法考察了土霉素在配合飼料、濃縮飼料、預(yù)混合飼料和精料補(bǔ)充料中的添加回收情況。添加量同液相方法，分別為：豬、雞配合飼料為0.05和混合型飼料劑的添加濃度為0.05mg/kg、100mg/kg、1000mg/kg，各濃度進(jìn)行5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表19~12345ⅡⅡⅡ12345ⅡⅡⅡ15ⅡⅢⅡⅡ12345Ⅱ99.1Ⅱ85.677.6Ⅱ87.092.794.694.712345ⅡⅡ93.696.7Ⅱ12345ⅡⅠⅡⅢⅡ12345ⅡⅡⅡ12345ⅡⅡⅡ12345ⅡⅠ Ⅱ Ⅱ表28植物提取物（蒲公英根固體提取12345Ⅱ97.1Ⅱ95.4Ⅱ表29微生態(tài)制劑（枯草芽孢桿菌+釀酒12345Ⅱ97.9Ⅱ92.798.3Ⅱ87.090.292.092.8從表中可以看出，本方法在空白飼料中添加0.05mg/kg～1000mg/kg的土霉素，回收率為70.5%～108.5%，批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10.9%。說(shuō)明該方法對(duì)不同飼料樣品中，不同含量的土霉素測(cè)定均有較好的準(zhǔn)確度。不同飼料的空白及空白添加樣品的特征離子色譜見(jiàn)圖31～圖53。進(jìn)樣量：20μL；流動(dòng)相：乙腈-0.01mol/L三氟乙酸（10+90），等度洗脫。將土霉素貯備液（1mg/mL）及土霉素標(biāo)準(zhǔn)中間工作液(100μg/mL)分別稀釋至10μg/mL上機(jī)測(cè)定。土霉素貯備液穩(wěn)定性如圖54所示，土霉素標(biāo)準(zhǔn)中間工作液穩(wěn)定性如圖55所示。因此我們將土霉素貯備液的有效期定為1個(gè)月，將濃度為100μg/mL的土霉素中間液的有效期定為1周。由于土霉素藥物不穩(wěn)定，因此，標(biāo)準(zhǔn)工圖54土霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液穩(wěn)定性(1mg/mL)配合飼料、濃縮飼料及精料補(bǔ)充料用鹽酸甲醇提取樣品中的土霉素并用水稀釋?zhuān)砑觿╊A(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液提取配合飼料、濃縮飼料及精料補(bǔ)充料用鹽酸甲醇提取樣品中的土霉素并用水稀釋。添加劑預(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液提取樣品中的土霉素，HLB固相萃取柱凈化。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，基質(zhì)匹配根據(jù)土霉素檢測(cè)方法不同添加濃度的回收率原則要求，三個(gè)復(fù)核單位的高效液相色譜法回收率范圍也都在%之間，批內(nèi)批間變異系數(shù)也都小于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法回收率范圍也都在%之間，批內(nèi)批間變異系數(shù)也都小于％。因此本方法將回收率范圍定在%之間。本標(biāo)準(zhǔn)建立了飼料中土霉素的高效液相色譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法，明確規(guī)定了適用范圍、提取凈化方法以及高效液相色譜條件、質(zhì)譜條件等，具有修訂稿修訂內(nèi)容章節(jié)號(hào)和章節(jié)標(biāo)題章節(jié)號(hào)和章節(jié)標(biāo)題標(biāo)題飼料中土霉素的測(cè)定高效液相色譜法標(biāo)題飼料中土霉素的測(cè)定增加液質(zhì)方法，名字更改為《飼料中土霉素的測(cè)定》本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中土霉素含量的高效液相色譜測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、濃縮飼料、添加劑預(yù)混合飼料中土霉素的測(cè)定，檢出限為0.5mg/kg,定量限為2mg/kg.本文件規(guī)定了飼料中土霉素的高效液相色譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本文件適用于配合飼料、濃縮飼料、添加劑預(yù)混合飼料、水產(chǎn)飼料、精料補(bǔ)充料和混合型飼料添加劑中土霉素的測(cè)定。本文件高效液相色譜法配合料、濃縮料和精補(bǔ)料的檢出限為1mg/kg，定量限為2mg/kg；添加劑預(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑的檢出限為2mg/kg，定量限為5mg/kg；水產(chǎn)飼料的檢出限為5.0mg/kg，定量限為10.0mg/kg，定量限為0.05mg/kg。適用范圍增加了水產(chǎn)飼料、精料補(bǔ)充料和混合型飼料添加劑。更改了液相方法檢出限和定量限，增加了液質(zhì)方法的檢出限和定量限。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款，凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。引用文件日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法更新了規(guī)范性引用文件聲明。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法(GB/T6682-1992,neqISO3696:1987)GB/T14699.1飼料采樣GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備//本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。試樣中土霉素經(jīng)酸性溶液提取后，注入高效波相色譜儀反相色譜系統(tǒng)中進(jìn)行分離,用紫外檢測(cè)器（或二極管陣列檢測(cè)器）檢測(cè)，外標(biāo)法計(jì)算土霉素的含量。配合飼料、濃縮飼料及精料補(bǔ)充料用酸化甲醇提取樣品中的土霉素并用水稀釋?zhuān)砑觿╊A(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液提取樣品中的土霉素，高效液相色譜熒光法測(cè)定，外標(biāo)法定量。更改了液相方法原4試劑和溶液除特殊說(shuō)明外，所用試劑均為分析純，水為蒸餾水，色譜用水符合GB/T/5682中一級(jí)用水規(guī)定。4.1鹽酸：優(yōu)級(jí)純。4.2鹽酸溶液(0.05mol/L)：取鹽酸(4.1)4.5mL，溶解于1000mL水中4.3乙腈:色譜純。4.4磷酸二氫鈉。4.5磷酸。4.6磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氧鈉(4.4)1.2g.加水使溶解并稀釋至1000mL,用磷酸(4.5)調(diào)pH值至3.50，搖勻，過(guò)濾。4.7土霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度應(yīng)大于97.0%4.8土霉索標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取已知純度的土霉素標(biāo)準(zhǔn)品20mg,置于100mL棕色容量瓶中，用鹽酸溶液(4.2)溶解定容、搖勻，其濃度為0.2mg/mL。貯存于4℃冰箱中，溶液有效期1個(gè)月。4.9土霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作液：分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)貯備液(4.8)0.05、0.50、2.50、7.50、12.5、25mL于100mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度。該標(biāo)準(zhǔn)系列中土霉素的相應(yīng)濃度分別為0.1、1、5、15、25、50ug/mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。4.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.2.1水：GB/T6682，一級(jí)。4.2.2甲醇：色譜純。4.2.3鹽酸甲醇：移取10mL鹽酸于1000mL甲醇中混4.2.450%甲醇：移取50mL甲醇，加水至100mL，混4.2.5鹽酸溶液（1mol/L）：移取鹽酸9mL，加水稀釋至100mL，混勻。4.2.6氫氧化鈉溶液（10mol/L）：稱(chēng)取氫氧化鈉40g，加水溶解并稀釋至100mL，混勻。4.2.7Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液：分別稱(chēng)取一水檸檬酸12.9g，十二水磷酸氫二鈉27.6g，二水乙二胺四乙酸二鈉37.2g，加水900mL溶解，用鹽酸溶液（4.2.5）或氫氧化鈉溶液（4.2.6）調(diào)pH至4.0±0.5，加水稀釋至1000mL，混勻，即得。4.2.8EDTA-CaCl2-乙酸鹽緩沖液：取乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2·2H2O）9.3g，加水500mL，溶解，加氫氧化鈉4.0g，溶解，冷至室溫，再依次加無(wú)水氯化鈣5.5g，乙酸5.7mL，混勻，加水至1000mL，用氫氧化鈉溶液（4.2.6）調(diào)pH至6.6±0.1?！牧巳芤杭捌渑渲品椒?。5儀器和設(shè)備5.1分析天平:感量0.0001g。5.2振蕩器。5.3超純水處理器。5.4高效液相色譜儀:紫外檢測(cè)器（或二極管陣列檢測(cè)器）。5.5pH計(jì)。5.60.45μm濾膜。4.3儀器設(shè)備4.3.1高效液相色譜儀：配熒光檢測(cè)器。4.3.2天平：感量0.01g和0.01mg。4.3.4離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥10000r/min。4.3.5渦旋混合器。4.3.6旋渦振蕩器。4.3.7超聲波清洗器。4.3.8酸度計(jì)。高效液相色譜儀檢測(cè)器更改為熒光檢測(cè)器；增加了離心機(jī)、渦旋振蕩器、超聲波清洗器等儀器。6試樣制備6.2選取具有代表性的飼料樣品至少500g,按GB/T20195制備樣品。4.4樣品按GB/T20195制備樣品，至少200g，粉碎使其全部通過(guò)0.425mm孔徑的分析篩，充分混勻，裝入密閉容器中，備用。更改了樣品制備方7試樣溶液的制備稱(chēng)取試樣適量（配合飼料10g、濃縮飼料5g、預(yù)混料1g)精確至1mg。置于250mL具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入100mL鹽酸溶液(4.2),于振蕩器上振蕩提取10min,溶液用濾紙過(guò)濾或用鹽酸溶液(4.2)作適當(dāng)稀釋?zhuān)瑸V液過(guò)0.45μm濾膜(5.6),備用。4.5試驗(yàn)步驟配合飼料、濃縮飼料及精料補(bǔ)充料平行做兩份試驗(yàn)。稱(chēng)取試樣5g，精確至0.01g，置mL，渦旋混合后振蕩10min，10000r/min離心5min，移取上清液0.5mL，加入0.5mL水（4.2.1渦旋混（4.2.12），供HPLC測(cè)定。添加劑預(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑平行做兩份試驗(yàn)。稱(chēng)取試樣2g，精確至0.01g，置于50mL離心管中，加入Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液緩沖液（4.2.7）20mL，渦旋混合后振蕩10min，超聲提取10min，10000r/min離心10min，移取上清液至另一離心管中。殘?jiān)謩e用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液緩沖液（4.2.7）20mL、10mL重復(fù)提取兩次，合并三次上清液，用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液緩沖液（4.2.7）定更改了液相方法的試驗(yàn)步驟。（4.2.12），供HPLC測(cè)定。件7.2.1色譜柱：Cg柱,柱長(zhǎng)150mm,內(nèi)徑4.6mm,粒徑為5μm,或相當(dāng)者。7.2.2柱溫：室溫。7.2.3流動(dòng)相：磷酸緩沖液(4.6)+乙腈=84+16,混勻，脫氣。7.2.4流速：1.0mL/min。7.2.5檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器（或二極管陣列檢測(cè)器），檢測(cè)波長(zhǎng)353nm.7.2.6進(jìn)樣量：20μL.液相色譜參考條件液相色譜參考條件如下：a)色譜柱：C18柱，柱長(zhǎng)150mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5μm，或性能相當(dāng)者；b)柱溫：30℃;c)檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)390nm，發(fā)射波長(zhǎng)512nm；d)流速：1.0mL/min；e)進(jìn)樣量：20μL；f)流動(dòng)相：A相：EDTA-CaCl2-乙酸鹽緩沖液，B相:甲醇，梯度洗脫，見(jiàn)表1。表1梯度洗脫條件時(shí)間(min)A相(％)B相(％)07525203070243070287525307525更改了液相色譜條//標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測(cè)定（4.2.11）和試樣溶液（4.5.1）上機(jī)測(cè)定。在上述色譜條件下，土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)附錄A。增加了標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測(cè)定//定性以保留時(shí)間定性，試樣溶液中土霉素保留時(shí)間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（濃度相當(dāng)）中土霉素的保留時(shí)間一致，其相對(duì)偏差在±2.5％之內(nèi)。增加了定性要求，規(guī)定了保留時(shí)間相對(duì)偏差范圍。定按上述色譜條件，分別將土霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作液(4.9)及試樣溶液(7.1)上機(jī)測(cè)定，以單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，以色譜峰面積積分值定定量以土霉素的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（響應(yīng)值）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99。試樣溶液（4.5.1）中土霉素的濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)更改了定量方法，增加了超范圍樣品稀釋方法。的線(xiàn)性范圍內(nèi)。如超出范圍，配合飼料、濃縮飼料及精料補(bǔ)充料試樣溶液用50%甲醇（4.2.4），添加劑預(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑試樣溶液用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液緩沖液（4.2.7）稀釋?zhuān)╪倍）后，重新測(cè)定。單點(diǎn)校準(zhǔn)定量時(shí)，試樣溶液（4.5.1）中待測(cè)物的濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相差不超過(guò)30%。8結(jié)果計(jì)算試樣中土霉素的含量(X)以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/kg)表示，按式(1)計(jì)算：X——試樣中土霉素的含量，單位為毫克每千克(mg/kg)；C——試樣溶液中土霉素的含量，單位為微克每毫升(ug/mL);m-試樣質(zhì)量，單位為克(g)；(mL)。結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。4.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試樣中土霉素的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w計(jì)，數(shù)值以毫克每千克（mg/kg）表示。多點(diǎn)校準(zhǔn)按式（1）計(jì)算；單點(diǎn)校準(zhǔn)按式（2）計(jì)算：式中:ρ——從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得的試樣溶液土霉素的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL）；V——提取液的總體積，單位為毫升（mL）；V1——用于稀釋/進(jìn)樣的提取液體積，單位為毫升（mL）；V2——最終上機(jī)溶液的體積，單位為毫升（mLm——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；n——稀釋倍數(shù)。A——試樣溶液中土霉素的峰面積；As——標(biāo)準(zhǔn)溶液中土霉素的峰面積；ρ——土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，單位為微克每毫升(μg/mL）；V——提取液的總體積，單位為毫升（mL）；V1——用于稀釋/進(jìn)樣的提取液體積，單位為毫升（mL）；更改了液相方法計(jì)算公式，增加了單V2——最終上機(jī)溶液的體積，單位為毫升（mLm——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；n——稀釋倍數(shù)。測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。9精密度在重復(fù)性試驗(yàn)條件下兩次平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差不大于10%。4.7精密度在重復(fù)性條件下，兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對(duì)差值不大于該算術(shù)平均值的10%。//5液相色質(zhì)譜法配合飼料、濃縮飼料及精料補(bǔ)充料用鹽酸甲醇提取樣品中的土霉素并用水稀釋。添加劑預(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液提取樣品中的土霉素，HLB固相萃取柱凈化。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量?！黾恿艘嘿|(zhì)檢測(cè)方三、試驗(yàn)驗(yàn)證的分析、綜述報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果本標(biāo)準(zhǔn)在制定過(guò)程中，起草組分別委托三家單位對(duì)本方法進(jìn)行了復(fù)核試驗(yàn)，結(jié)果表明，該方法均滿(mǎn)足各項(xiàng)技術(shù)要求，最終確本標(biāo)準(zhǔn)的制定和實(shí)施，一方面將大幅度提高飼料產(chǎn)品的安全性，把好飼料關(guān)口，提高相關(guān)農(nóng)畜產(chǎn)品的安全性；另一方面也將為國(guó)家飼料質(zhì)量安全監(jiān)控提供有效的技術(shù)支撐，實(shí)現(xiàn)飼料工業(yè)和畜牧業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展。本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布實(shí)施將為生產(chǎn)者提供技術(shù)服務(wù)，保證安全飼料產(chǎn)品的生產(chǎn)，避免生產(chǎn)者受到損失，間接提四、與國(guó)際、國(guó)外同類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容的對(duì)比情況，或者與測(cè)試的本標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中土霉素的測(cè)定高效液相色譜法》（GB/T22259-2008）相比，有以下提升：1.將提取液0.05mol/l鹽酸溶液改為鹽酸甲醇和Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，提高了提取效率，并且Na2EDTA-Mcllvaine緩沖2.將紫外檢測(cè)法改為熒光檢測(cè)法，提高方法選擇性和靈敏度；3.適用范圍增加了水產(chǎn)飼料、精料補(bǔ)充料和混合型飼料添加劑，提高了標(biāo)準(zhǔn)適用性；4.增加液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，滿(mǎn)足更高的檢測(cè)需求。與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第282號(hào)-2-2020《飼料中土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素的測(cè)定》相比，本標(biāo)準(zhǔn)針對(duì)土霉素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化了儀器條件，提高了方法液相法配合飼料中的檢測(cè)限為3mg/kg，定量限為5mg/kg；添加劑預(yù)混合飼料、濃縮飼料和精料補(bǔ)充料中檢測(cè)限10mg/kg，定量限為20mg/kg配合料、濃縮料和精補(bǔ)料的檢出限為1mg/kg，定量限為2mg/kg；添加劑預(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑的檢出限為2mg/kg，定量限為5mg/kg；水產(chǎn)飼料的檢出限為5mg/kg，定量限為10mg/kg。液質(zhì)法配合飼料中的檢測(cè)限為0.01mg/kg，定量限為0.05mg/kg；在添加劑預(yù)混合飼料、濃縮飼料和精料補(bǔ)充料中檢測(cè)限0.025mg/kg，定量限為0.1mg/kg。檢出限為0.02mg/kg，定量限為0.05mg/kg。本標(biāo)準(zhǔn)的制定過(guò)程中嚴(yán)格貫徹國(guó)家有關(guān)方針、政策、法律和規(guī)章等、嚴(yán)格執(zhí)行國(guó)家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。