分子生物學(xué)學(xué)習(xí)資料：分子生物學(xué)閱讀延伸譯文

1.研究相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)的意義?

蛋白質(zhì)很少單獨(dú)發(fā)揮其功能，通常都是多種蛋白質(zhì)形成復(fù)合物起生物學(xué)作用，全球范圍內(nèi)蛋

白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究，也就是所謂的相互作用組學(xué)已經(jīng)成為非常重要的現(xiàn)代分子生

物學(xué)。蛋白質(zhì)是所有細(xì)胞的重要組成部分，大多數(shù)細(xì)胞行使功能時蛋白質(zhì)之間的相互作用是

必不可少的。如基因轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞周期調(diào)控，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或監(jiān)控過程中等的基本過程都依賴于正

確的功能蛋白質(zhì)復(fù)合物?！昂蠡蚪M”時代的重要里程碑之一是功能注釋的基因組數(shù)據(jù)的積

累。蛋白質(zhì)形成時的干擾或?qū)M織內(nèi)蛋白質(zhì)復(fù)合物的干擾，往往會導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，最終

導(dǎo)致疾病。而且，在不同的組織和細(xì)胞中,蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成并非一成不變，為適應(yīng)細(xì)胞生長

的微環(huán)境變化，蛋白質(zhì)復(fù)合物的各組成成分還存在著時間和空間的表達(dá)差異性。因此,在組織

或細(xì)胞中眾多蛋白質(zhì)協(xié)同發(fā)揮生理作用的過程中，蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成分析尤其重要，這也

進(jìn)一步要求我們充分揭示一個細(xì)胞或組織中完整的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)一蛋白質(zhì)相

互作用組。

2.相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法有哪些？

答：⑴生物化學(xué)方法：①免疫共沉淀法；②親和層析法。⑵遺傳學(xué)方法：①yeasttwo-hybrid;

(2)Protein-fragmentcomplementationassay(PCA);(3)Membraneyeasttwo-hybrid(MYTH);@

Resonance-energytransfer(RET)systems包括FRET、BRET、BRET-FRET(SRET)>TR-FRET和FRAP;

⑤luminescence-basedmammalianinteractomemapping(LUMIER);⑥Themammalian

protein-proteininteractiontrap(MAPPIT)anditsvariants(ArrayMAPPIT、MASPIT和Reverse

MAPPIT);⑦Phagedisplay;⑧Proteinmicroarrays。

①酵母雙雜交②蛋白質(zhì)的片段互補(bǔ)分析(PCA);③膜酵母雙雜交(MYTH):④共振的能量轉(zhuǎn)

移(RET)系統(tǒng)包括FRET,BRET,BRET,熒光共振能量轉(zhuǎn)移(SRET),TR-FRET和FRAP;⑤基

于發(fā)光的哺乳動物相互作用組的映射(LUMIER)；⑥哺乳動物的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的

陷阱(MAPPIT)及其變種(的陣列MAPPIT,MASPIT和反向MAPPIT);⑦噬菌體顯示屏;⑧蛋

白質(zhì)微陣列。

3.與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)相互作用研究方法相比，相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)的優(yōu)勢在哪里？

答：相互作用蛋白組學(xué)技術(shù)可以在生理條件下獲得與靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)，候選蛋白質(zhì)

與靶蛋白的結(jié)合機(jī)會均等；靈敏度高；鑒定出在空間上非直接物理相互作用的蛋白質(zhì)，避免

假陽性出現(xiàn);檢測多亞基蛋白質(zhì)之間的相互作用；能適用于大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用的研究等。

傳統(tǒng)方法由于其粗糙性和經(jīng)濟(jì)承受能力HTP互動目前可用的數(shù)據(jù)仍然是基于經(jīng)典的Y2H。雖

然它最近已表明，V2H網(wǎng)絡(luò)提供高品質(zhì)的二進(jìn)制交互信息，但該方法具有的固有的局限性,

如收縮相互作用的核和使用酵母作為宿主系統(tǒng)。而現(xiàn)在的方法是以酵母系統(tǒng)為基礎(chǔ)，應(yīng)用哺

乳動物系統(tǒng)，因此提供了一些優(yōu)勢，并且，他們往往是技術(shù)上的挑戰(zhàn)，而不是擴(kuò)展到HTP

格式。如的PCA,RET為基礎(chǔ)的方法或MAPPIT操作方法在哺乳動物細(xì)胞中，它可以補(bǔ)充耦

合質(zhì)譜方法（AP-MS）。這是經(jīng)常選用的方法，因此HTPPPIs類藥物的研究被廣泛使用的親

和純化。雖然AP-MS需要相對嚴(yán)格的生化隔離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，但它可以適用于寬范圍的

細(xì)胞類型。隨著相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)的成熟可以有更多新穎的發(fā)現(xiàn)，也可以使我們更好的了

解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間的相互作用。

1.基因芯片在醫(yī)學(xué)中有何應(yīng)用？

（1）發(fā)現(xiàn)新基因（2）基因表達(dá)分析（3）DNA序列測定與序列間比較（4）突變體和多態(tài)

性的檢測（5）疾病的診斷。（6）藥物研究的重要技術(shù)平臺，大量應(yīng)用與耐藥性檢測、藥物

靶點(diǎn)尋找、高通量的藥物篩選、藥物作用機(jī)制和毒理研究等。

2.基因芯片的使用應(yīng)注意哪些問題？

①根據(jù)研究課題的需要來選取相關(guān)基因芯片。

②基因芯片的數(shù)量：每實(shí)驗(yàn)組應(yīng)最少有5~6塊基因芯片才具有統(tǒng)計學(xué)意義。

③利用基因芯片時必須了解在什么時間取材和取什么組織進(jìn)行檢測的問題。在什么時間取材

需要研究者根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。取材時應(yīng)注意不要將無關(guān)組織帶入實(shí)驗(yàn)材料中，

以免影響取材的準(zhǔn)確性。

④組織的取材量由組織類型和基因芯片的一次成功率決定。

⑤不能單憑基因芯片檢測結(jié)果而對不同表達(dá)的基因之間的關(guān)系做出結(jié)論。

⑥隨著蛋白芯片技術(shù)的發(fā)展，將基因芯片技術(shù)與蛋白芯片技術(shù)結(jié)合使用，可提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的

可靠性和準(zhǔn)確性。

⑦可采用與基因芯片公司合作的方式進(jìn)行，在合作中，應(yīng)就實(shí)驗(yàn)的設(shè)計等問題與基因芯片公

司協(xié)商。避免由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計等原因?qū)е聦?shí)驗(yàn)的失敗。同時，應(yīng)與基因芯片公司簽訂有關(guān)合同，

明確雙方的義務(wù)和責(zé)任。

3.基因芯片有哪些優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)？

優(yōu)點(diǎn)：檢測效果：準(zhǔn)確、可靠、靈敏。檢測方法由由熒光掃描儀檢測，計算機(jī)自動分析，方

便、快捷。成本低。與傳統(tǒng)診斷區(qū)別：直接以病理基因（致病基因、疾病相關(guān)基因和外源性

病原生物基因等）為分析對象?？梢砸淮涡詫悠反罅啃蛄羞M(jìn)行檢測和分析。

缺點(diǎn)：技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜、檢測靈敏度較低、重復(fù)性差、分析泛圍較狹窄等。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)結(jié)核，特別是結(jié)核性腦膜炎(TBM)是結(jié)核分枝桿菌(M.Tb)感染最為嚴(yán)重的

形式，盡管近期在抗結(jié)核治療方面取得了一定進(jìn)展，但是在感染的患者中一半以上會出現(xiàn)死

亡或嚴(yán)重的中樞缺陷。CNS結(jié)核的決定性診斷取決于腦脊液(CSF)中M.Tb的檢測?，F(xiàn)在

CNS結(jié)核的診斷依然是個難題，因?yàn)樵赥BM急性階段廣泛應(yīng)用的細(xì)菌學(xué)檢測方法的“金標(biāo)

準(zhǔn)”(如直接涂片和細(xì)菌培養(yǎng))在檢測CSF標(biāo)本中的M.Tb時敏感性并不高。與傳統(tǒng)的“金標(biāo)

準(zhǔn)”不同，最近多種分子學(xué)方法包括核酸擴(kuò)增(NAA)分析技術(shù)，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

分析法，已經(jīng)作為一個診斷CNS結(jié)核的新興方法浮現(xiàn)。因其有快速、敏感和特異的特點(diǎn)。

此外，巢式PCR分析技術(shù)的革新值得關(guān)注，因?yàn)樗芨倪M(jìn)CNS結(jié)核的診斷。本文中，對最

近的NAA方法，主要是PCR技術(shù)作一概述。

1、簡介

在美國，由M.Tb引發(fā)的CNS疾病特別是結(jié)核性腦膜炎(TBM)并不常見，占所有結(jié)核病例的

1%左右。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌(M.Tb)感染最為嚴(yán)重的形式，盡管近期在

抗結(jié)核治療(ATT)方面取得了一定進(jìn)展，但是在感染的患者中一半以上會出現(xiàn)死亡或嚴(yán)重

的中樞缺陷。止匕外，由于廣泛傳播的AIDS引起越來越多的免疫功能不全的的群體、逐漸增

加的老齡化人群、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用等原因，使得TBM成為一個嚴(yán)重的臨床和社會問

題。因?yàn)镃NS結(jié)核相對稀少且引起的中樞癥狀無特異性，所以其診斷有很大難度。對于TBM

來說，針對結(jié)核進(jìn)行準(zhǔn)確快速診斷和早期治療尤為重要，否則會導(dǎo)致預(yù)后不良和長期的神經(jīng)

方面的后遺癥。然而，M.Tb傳統(tǒng)的基于細(xì)菌學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)檢測法包括直接涂片進(jìn)行抗酸染色

(AFB)和細(xì)菌培養(yǎng)不能對其進(jìn)行早期診斷，因?yàn)槊舾行暂^低且培養(yǎng)時間過長(4-8周)。

最近，用各種分子學(xué)方法，包括NAA分析技術(shù)，特別是PCR分析方法用于檢測CSF中

M.TbDNA已經(jīng)作為一個診斷CNS結(jié)核的新興方法浮現(xiàn)。因其有快速、敏感和特異的特點(diǎn)。

許多學(xué)者認(rèn)為雖然不同的實(shí)驗(yàn)室和每種類型的檢測方法之間的PCR敏感性有著顯著差異(65

-83%),但是不能用PCR法檢測CSF中的M.TbDNA。而且，有報道將巢式PCR法作為檢測

CSF中M.TbDNA的強(qiáng)效方法。與傳統(tǒng)的單級PCR相比，這種新方法可顯著增強(qiáng)DNA擴(kuò)增的

敏感性和特異性。然而，由于其步驟繁瑣耗時且有較高的交叉污染的風(fēng)險，所以用巢式PCR

檢測CSF以診斷TBM還有待于改進(jìn)。目前，常規(guī)診斷實(shí)驗(yàn)室檢測用實(shí)時PCR法。除了進(jìn)行

常規(guī)的定性分析，實(shí)時PCR以其高度復(fù)制性使精確定量分析成為可能。

本文作者聚焦與NAA分析技術(shù)特別是PCR法的最新進(jìn)展，并對期刊中和臨床上關(guān)于

CNS結(jié)核診斷的演進(jìn)作一概述。

2、結(jié)核的全球流行病學(xué)負(fù)擔(dān)

2007年，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計每年會有9.27百萬活性結(jié)核新增病例，這導(dǎo)致每年約

1.6百萬人死亡。結(jié)核依然是一個世界性負(fù)擔(dān)，在不發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家有大量新增病例。

實(shí)際上，在結(jié)核發(fā)病率上印度、中國、印度尼西亞、尼日利亞和南非依次位列第一到第五位。

在80%的新增病例中，像貧困、過度擁擠、營養(yǎng)不良和免疫系統(tǒng)功能不良等社會和人口統(tǒng)計

學(xué)因素在其世界范圍內(nèi)流行起重要作用，而余下的20%結(jié)核患者與撒哈拉以南非洲中的HIV

有關(guān)。在2007年新增的9.27百萬病例中，約有1.37百萬（14.8%）HIV陽性。

CNS感染是結(jié)核最為嚴(yán)重的感染形式之一。在美國針對肺外結(jié)核進(jìn)行的大范圍流行病學(xué)研究

中CNS相關(guān)的病例占總肺外結(jié)核的5-10%,與2010年CDC新進(jìn)估計的5.5%（CVS結(jié)核占總

結(jié)核病例的1.2%）相近。在CNS結(jié)核最大的前瞻性流行病學(xué)研究中，從加拿大收集的

1970-2001年間82764個結(jié)核病例中，CNS結(jié)核的發(fā)病率接近L0%。然而，盡管在像美國這

樣的發(fā)達(dá)國家中結(jié)核病例的總數(shù)量在減少，但是，有報道表明肺外結(jié)核所占比例在漸進(jìn)式增

加。造成這一現(xiàn)象的原因在于近年來免疫功能不全患者的增加和HIV/AIDS流行率的盛行。

此外,盡管結(jié)核的基于人口的總死亡率較低且正在減少，但是已有研究顯示伴有肺外結(jié)核（包

括CNS結(jié)核、TBM和傳播性疾病）患者的死亡率會顯著增加

現(xiàn)已確認(rèn)幾個引發(fā)CNS結(jié)核的風(fēng)險因素。年齡（兒童〉成人）和合并HIV感染的患者均屬患

CNS的高風(fēng)險因素。其他危險因素包括營養(yǎng)不良、近期小兒麻疹、酗酒、腫瘤成人免疫抑制

劑的應(yīng)用和社區(qū)流行的疾病。發(fā)達(dá)國家中有研究表明在CNS患者中，外國出生的個體（即

出生于發(fā)達(dá)國家以外國家的人）呈現(xiàn)出更高的患病率。

3、CNS結(jié)核的現(xiàn)行診斷方法

現(xiàn)在，CNS結(jié)核診斷依然是一復(fù)雜問題，因?yàn)橄裰苯油科顾崛旧蚆.Tb培養(yǎng)等廣為應(yīng)用

的傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測方法不能快速檢測出CSF標(biāo)本中的M.Tb,因其在TBM急性階段敏感性

較差?？紤]到CNS結(jié)核的預(yù)后和長期神經(jīng)后遺癥，其急性階段的快速準(zhǔn)確診斷和早起開始

ATT治療顯得尤為重要。基于微生物技術(shù)進(jìn)行的傳統(tǒng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”在診斷TBM時敏感性較

差且不能及時得到結(jié)果，而臨床要求診斷方法要更為敏感、快速、精確?，F(xiàn)已有應(yīng)用于結(jié)核

病呼吸道標(biāo)本的檢測技術(shù)，從這些技術(shù)中抽出幾個基于分子的方法對CNS結(jié)核進(jìn)行診斷，

這種做法是否合適仍處于評估階段。這些技術(shù)包括商品化的NAA法和其他PCR類方法。此

外，像磁共振成像（MRI）等神經(jīng)放射成像技術(shù)的應(yīng)用顯著提升TBM和結(jié)核診斷的準(zhǔn)確性。

最近，有大量應(yīng)用神經(jīng)放射成像技術(shù)評估CNS結(jié)核的報道。公認(rèn)的TBM神經(jīng)放射方法用于

基礎(chǔ)腦膜強(qiáng)化、腦積水和幕上腦實(shí)質(zhì)和腦干梗塞的診斷。而且，通常認(rèn)為腦內(nèi)結(jié)核瘤強(qiáng)度有

高有低。伴有不規(guī)則壁的圓形或分葉狀腫物，并且調(diào)節(jié)對比度后呈均質(zhì)或環(huán)狀增強(qiáng)。然而,

當(dāng)只用神經(jīng)放射成像技術(shù)時，無法區(qū)分結(jié)核瘤和其他想像真菌顆粒這樣的腦內(nèi)集聚性損傷。

因此，我們認(rèn)為是基于分子學(xué)的技術(shù)和神經(jīng)放射成像結(jié)合的方法是有發(fā)展前景的方法，在診

斷TBM和結(jié)核性腫瘤中非常好，而不是伴或不伴有經(jīng)典的細(xì)菌生物學(xué)技術(shù)的神經(jīng)放射成像

技術(shù)。

肺結(jié)核的研究和治療

4、PCR技術(shù)的最新進(jìn)展

診斷M.Tb的NAA法是通過對來自痰液或CSF等臨床標(biāo)本進(jìn)行M.Tb的DNA或RNA提取和擴(kuò)

增，以檢測是否含有結(jié)合桿菌。PCR技術(shù)是典型的DNA擴(kuò)增方法。鑒于PCR分析技術(shù)的最

新成就和進(jìn)展，在這部分，我們對其原理做一概括。

4.1PCR的基本原理

圖1簡要闡釋了PCR的基本原理。從根本上說，PCR分析技術(shù)依賴與熱循環(huán)，包括重復(fù)加熱

和冷卻以使DNA變性及其酶的復(fù)制。短的DNA片段稱為引物，他有與含DNA酶的靶區(qū)互補(bǔ)

的序列，是使特異性DNA序列擴(kuò)增的重要組成部分。熱循環(huán)的第一步是在高溫（94-98℃

20-30秒）下進(jìn)行雙鏈DNA的物理分離。這被稱為DNA變性階段。在較低溫度（50-65/20-40

秒）下，將與靶DNA互補(bǔ)的引物退火到每一個單鏈DNA模版上，該步為退火階段。PCR的特

異性主要來源于與模版序列完全匹配的引物序列和取決于于引物長度的退火溫度。DNA多

聚酶連接到引物-模版雜交鏈上開始DNA復(fù)制。DNA聚合酶從5'到3'方向組裝合成一條

新的與DNA模版互補(bǔ)的鏈，該步叫延伸。一般來說，幾乎所有的PCR均需要耐熱的DNA聚

合酶，如最初從嗜熱水生菌中分離出的Tap聚合酶。結(jié)果，它實(shí)現(xiàn)了連續(xù)重復(fù)熱循環(huán)程序,

即交替的加熱和冷卻步驟。進(jìn)行熱循環(huán)時，合成的DNA片段自身作為模版進(jìn)行復(fù)制，成為

一個連續(xù)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使得DNA模版成倍的擴(kuò)增。

用瓊脂糖凝膠電泳的方法根據(jù)擴(kuò)增的DNA片段長度（分子量）的不同將其分離。然后用含

EB（澳化乙定）的溶液處理，EB是在瓊脂糖凝膠電泳中使DNA條帶可見的最常用的染料。

因?yàn)樵赨V燈下EB熒光嵌入DNA主要的槽中，經(jīng)EB處理后，可見明顯的擴(kuò)增的靶DNA片

段的條帶，進(jìn)而進(jìn)行檢測。

4.2、巢式PCR法原理

圖1b為巢式PCR法的基本原理。巢式PCR法是改進(jìn)的PCR法,旨在顯著增強(qiáng)擴(kuò)增效率、減

少因非目標(biāo)引物結(jié)合位點(diǎn)擴(kuò)增引起的非特異性PCR產(chǎn)物。盡管普通PCR特異性取決于與靶

DNA序列結(jié)合的引物的互補(bǔ)性，但引物常與其他相似的DNA區(qū)域結(jié)合,產(chǎn)生像引物二聚體、

發(fā)夾結(jié)構(gòu)和替代性目標(biāo)序列這樣的不相關(guān)的PCR產(chǎn)物。巢式PCR使用兩對引物，應(yīng)用于PCR

的兩個連續(xù)性步驟中。特別是，第二對引物在首步PCR產(chǎn)物中進(jìn)行再次擴(kuò)增；這就是“巢

式”這一概念的來源。第一對PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。然而，第二對引物結(jié)合

在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部進(jìn)行第二步PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。

巢式PCR的優(yōu)點(diǎn)在于如果第一步擴(kuò)增了不相關(guān)或非特異性片段，第二次能在錯誤片段上進(jìn)

行引物配對并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR是一項非常好的技術(shù)，他可通過兩步擴(kuò)增

獲得足量的靶DNA,并且他可通過降低非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增顯著改進(jìn)靶序列的特異性。

4.3、實(shí)時定量PCR法原理

實(shí)時定量PCR法是一種變異的PCR技術(shù)，旨在擴(kuò)增并且同時定量靶DNA分子；他可進(jìn)行檢

測和定量。盡管實(shí)時定量PCR法的基本步驟衍生于普通的PCR法，但是其重要特點(diǎn)在于可

在反應(yīng)過程中實(shí)時檢測擴(kuò)增的DNA片段。與傳統(tǒng)的普通PCR（在反應(yīng)的終末階段檢測PCR

產(chǎn)物）相比，這是一新的革命性的方法.實(shí)時檢測PCR的兩種常用方法如下：（1）用像SYBR

Green這樣的非特異性熒光染料嵌入任意雙連DNA中（2）用像TapMan探針一樣的序列特

異的寡聚核甘酸探針標(biāo)記熒光報告染料，只有該探針與互補(bǔ)的靶序列雜交后才能被檢測到。

前者（SYBRGreen）結(jié)合包括非特異性PCR產(chǎn)物（如引物二聚體）在內(nèi)的所有雙鏈DNAPCR

產(chǎn)物。這是其潛在的缺陷，因?yàn)樗麜绊戭A(yù)期目標(biāo)DNA的精確定量。

相比之下，像TapMan探針這樣的熒光報告探針只檢測包含互補(bǔ)探針序列的DNA片段；因

此，即使出現(xiàn)非特異性的擴(kuò)增片段，應(yīng)用這類報告探針依然可以顯著增強(qiáng)特異性并且能精確

定量。圖1C所示為基于熒光探針技術(shù)（TaqManPCR）的實(shí)時定量PCR的基本原理。用熒光報

告染料(如FAM或VIC)在5'端標(biāo)記序列特異性寡聚核甘酸探針，在3'端標(biāo)記共朝的淬

滅染料(如TAMRA)。熒光報告染料和淬滅染料非常接近，阻止熒光的發(fā)散。當(dāng)反應(yīng)被啟動

時，在PCR退火階段，探針和引物均與靶DNA序列退火。當(dāng)PCR反應(yīng)繼續(xù)時，Taq聚合酶

的5'-3,核酸外切酶活性使探針分解，進(jìn)而使報告集團(tuán)和淬滅集團(tuán)分離，導(dǎo)致報告染料的

非淬滅集團(tuán)放射熒光，該熒光可在激光激發(fā)后得到檢測。因?yàn)闊晒鈭蟾嫒玖吓c淬滅染料的分

離方式與PCR循環(huán)過程有關(guān)，所以熒光強(qiáng)度呈指數(shù)形式增加。這種增加被用來測定Ct值，

以計算每一次反應(yīng)的擴(kuò)增率。最終可以精確測量主量DNA

最新的中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核的PCR診斷

5、檢測M.Tb的商品化NAA法

如今，美國食品藥品管理局(FDA)己通過了兩中可行的商品化NAA法，用于M.Tb的直接

檢測。如下：羅氏Amplicor結(jié)核分枝桿菌測試(RocheDiagnosticSystems,Inc.,Indianapolis,IN,

USA)和基因探針擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌直接(MTD)檢測(Gene-Probe,Inc.,SanDiego,CA,USA)兩種

檢測均用M.Tb(GenBankaccessionno.NC000962.2(1471846-1473382))的16S核糖體

RNA(rRNA)作為擴(kuò)增的靶序列。16s核糖體RNA(rRNA)代表著微生物的穩(wěn)定屬性，被廣泛應(yīng)用

于確定分枝桿菌種類。

羅氏Amplicor檢測應(yīng)用的是普通PCR法。在這種檢測試劑盒中用引物對和M.Tb特異性的16S

核糖體RNA(rRNA)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。此外，羅氏CobasTaqManMTB檢測是Amplicor檢測的

改進(jìn)方法，它采用的是實(shí)時(TaqMan)PCR技術(shù)。同時，基因探針擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌直接(MTD)

檢測是等溫的RNA擴(kuò)增方法。在這種檢測試劑盒中，在恒溫(43。。條件下通過反轉(zhuǎn)錄酶和

RNA聚合酶耦合，使M.Tb的16S核糖體RNA(rRNA)直接擴(kuò)增，用特異性oligo-RNA探針雜交

方法進(jìn)行檢測?，F(xiàn)在,FDA規(guī)定Amplicor法只能用于痰涂片陽性的呼吸道標(biāo)本的檢測。同時，

不管AFB的痰涂片結(jié)果如何，均可應(yīng)用MTD法檢測呼吸道標(biāo)本。有幾項研究報道，在AFB

痰涂片陽性標(biāo)本中，兩種檢測方法均可獲得滿意的結(jié)果(敏感性和特異性均高于95%),但

是,應(yīng)用于AFB痰涂片陰性標(biāo)本時，敏感性降低(60-85%)。FDA規(guī)定，兩種方法均不能應(yīng)用

于CSF的檢測。

6、PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用：CNS結(jié)核的診斷

表1總結(jié)了用PCR技術(shù)診斷CNS結(jié)核的效果。應(yīng)用NAA技術(shù)的難點(diǎn)在于CSF標(biāo)本中M.Tb

的快速診斷，CSF標(biāo)本多數(shù)來自主要出現(xiàn)在TBM中的少數(shù)桿菌，還有CSF中擴(kuò)增抑制因子的

出現(xiàn)。在臨床實(shí)際實(shí)踐中，診斷CNS結(jié)核時，PCR的敏感性和特異性是最為重要的。為改進(jìn)

PCR法的敏感性和特異性，在CSF標(biāo)本里從少數(shù)M.Tb桿菌中有效提取純化DNA和設(shè)置特意

有效的模版引物以擴(kuò)增M.TbDNA是最為重要的因素。因此，許多研究人員在這些問題上進(jìn)

行著緊鑼密鼓地工作。在20世紀(jì)90年代，Shankar、Kaneko、Lin等人報道許多從CSF標(biāo)本

提取和純化M.TbDNA的改進(jìn)方法。據(jù)這些研究表明，用包含蛋白激酶K和十二烷基磺酸鈉

(SDS)的細(xì)胞溶解液作為表面活性劑處理CSF標(biāo)本，然后從處理后的CSF標(biāo)本中用氛-氯抽

提法和乙醇沉淀法提取和純化M.TbDNA。為更有效的從CSF樣本中提取出少量的M.TbDNA,

作者用了高分子量載體Ethachinmate(NipponGenejokyo,Japan)和之前報道的氛氯抽提法和

乙醇共沉底法一起作為提取核酸的共沉底劑。然而，在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，在臨床實(shí)驗(yàn)中，

不適合用傳統(tǒng)的氛氯抽提法和乙醇沉底法，因?yàn)檫@些方法步驟繁瑣且非常耗時。通常情況下，

商用柱提取試劑盒（如QIAmp血包和QIAmpDNAMiniKit,（QiagenInc.,Valencia,CA,USA）,

CobasAmplicor呼吸道標(biāo)本制備試劑盒（RocheDiagnosticSystems,Inc.,Indianapolis,IN,USA））

己經(jīng)在之前的研究中被廣泛用來從各種樣本中提取DNA。然而，在現(xiàn)行的研究中，商用柱

提取試劑盒不能從CSF標(biāo)本中提取出M.TbDNA；因此，這些廣為應(yīng)用的試劑盒不適宜用來

提取CSF標(biāo)本中小量的M.TbDNAo

當(dāng)前，用NAA法評估了四種主要的M.TbDNA特異性序列（即IS6110區(qū)插入序列（Rv3475:

GenBankaccessionno.NC000962.2（3891051-3892091））,65-kDa熱休克蛋白抗原（Rv0251c:

NC000962.2（302173-302652））,16SrRNA基因和MPT64（NC000962.2（2223343-2224029））。

在這四種序列區(qū)域中，IS6no區(qū)插入序列是一個專門在M.Tb復(fù)合物基因組中發(fā)現(xiàn)的重復(fù)性

元件，在許多研究中，他已廣泛用于有優(yōu)越擴(kuò)增效率的靶序列（表1）。在這些之前的研究中，

針對IS6110插入序列的PCR檢測用于TBM診斷是顯示比較好的效果（總的敏感性為70-98%,

特異性為80-100%）（表1）。此外，靠近IS6110插入序列，16SrRNA基因常用于NAA檢測,

并且他是兩個商用M.Tb檢測方法（即RocheAmplicor檢測和基因探針MTD檢測）的靶序列。

如前所述，這兩種方法檢測呼吸道標(biāo)本已經(jīng)得到FDA認(rèn)證?，F(xiàn)在尚無得到認(rèn)證的用于CSF

檢測的商用NAA方法，但是有研究評價了他們在TBM病例中的效果（表1）。最近一項關(guān)于

商用NAA法診斷TBM的薈萃分析顯示總體的敏感性為56%,特異性為98%。基于這些研究

結(jié)果，人們認(rèn)為商用NAA法可能在診斷TBM中起一定作用，但因其敏感性較低，所以不是

確診TBM的理想方法。因?yàn)椴荒苡眠@兩種商用NAA法診斷TBM的主要原因在于其敏感性

較差，所以可以認(rèn)為，他們可以用于檢測包含大量M.Tb桿菌的呼吸道標(biāo)本，但不能用于檢

測CSF樣本中的少量M.TbDNA。近來有研究表明，改進(jìn)的基因探針MTD檢測可提升CSF中

M.TbDNA的檢測效果。然而，這些改進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用僅限于單個的實(shí)驗(yàn)室，尚未得到廣泛應(yīng)

用。同時，MPT64是編碼MPT64蛋白的基因序列，這在M.Tb復(fù)合物中有特異性，且僅存在

于M.Tb基因組中的一個位點(diǎn)上，因此，認(rèn)為MPT64是PCR法中最具特異性的序列，已經(jīng)在

許多研究中用作PCR的靶序列。Lee等人比較了IS6110,65kDa抗原和MPT64三個序列，認(rèn)

為MPT64是PCRM.TbDNA擴(kuò)增中最具特異性和敏感性的序列。

除了商用NAA法，應(yīng)用PCR法擴(kuò)增M.TbDNA己經(jīng)得到了許多臨床上的關(guān)注（表1）。

正如上面所描述的一樣，為了改進(jìn)診斷CNS結(jié)核的PCR法，科研人員已經(jīng)嘗試了各種想法。

最近，發(fā)明了革命性的巢式PCR技術(shù)以診斷CNS結(jié)核，與傳統(tǒng)的PCR相比，他能顯著增加

敏感性和特異性。Liu等人報道，針對MPT64序列的巢式PCR被用于CSF標(biāo)本的檢測，這些

標(biāo)本來自臨床懷疑感染TBM的21個患者，巢式PCR使得24小時內(nèi)TBM診斷的敏感性為

90%,特異性為100%。此外，他們報道說，巢式PCR的敏感性比普通的PCR高1000倍。作

者從臨床收集了9個高度懷疑TBM患者的CSF標(biāo)本用巢式PCR法檢測了MPT64序列。在我

們的研究中，巢式PCR的敏感性和特異性均為100%,但是普通PCR和M.Tb培養(yǎng)的敏感性

僅為22.2%。而且，我們檢測了巢式PCR的最低檢測敏感性。巢式PCR的檢測水平在1-10

復(fù)制份數(shù)/2UL純化的M.TbDNA,與傳統(tǒng)的PCR相比，其敏感性從1000倍提升到10000倍。

考慮到PCR分析結(jié)果和ATT反應(yīng)之間的關(guān)系，Lin等人用普通PCR.Scarpellini等人用巢式PCR

分別檢測了這種關(guān)系。值得一提的是，Scarpellini等人進(jìn)行了歷時性研究，他們從接受臨床

治療的7名患者中收集了一些CSF標(biāo)本，用巢式PCR測定了IS6110序列。在他們的研究中，

巢式PCR結(jié)果顯示4個TBM患者在ATT過程中的臨床狀況轉(zhuǎn)陰。與此相反，沒有ATT反應(yīng)

的3位患者整個臨床過程中的巢式PCR結(jié)果依然為陽性，最終死亡。因此，Scarpellini等人

認(rèn)為巢式PCR可用于評估TBM的臨床治療過程。與此相似的是，在我們的研究中，從7個

高度疑似TBM的患者收集ATT治療中的27份CSF標(biāo)本，用巢式PCR法進(jìn)行檢測，其中有

11份（40.7%）顯示陽性。而且，我們的巢式PCR結(jié)果顯示，在ATT中6位患者的臨床狀況得

到改善，結(jié)果轉(zhuǎn)陰。與此相反，從7位接受臨床治療的患者中收集27份連續(xù)標(biāo)本，用傳統(tǒng)

的PCR和M.Tb培養(yǎng)法檢測，結(jié)果顯示為陰性。巢式PCR有著優(yōu)異的敏感度和特異性，是一

種實(shí)用的方法。有些疑難病例用普通的PCR法很難檢測到M.Tb,而用巢式PCR卻可以診斷，

鑒于此，作者預(yù)測，如果該項技術(shù)得到合理的廣泛臨床應(yīng)用，他將是精確快速診斷CNS結(jié)

核最有效的工具。

盡管我們都期望在臨床上能廣泛應(yīng)用巢式PCR法，但令人遺憾的是，現(xiàn)在還很少用于

TBM的診斷。存在的主要爭議在于，該法步驟繁多，而且很費(fèi)時，不適合在臨床上作為常

規(guī)檢測手段。此外，因該法顯著增加了敏感性且需要額外的擴(kuò)增步驟，所以，一般來說會很

容易發(fā)生交叉污染。當(dāng)然，巢式PCR不適合對許多樣本進(jìn)行臨床常規(guī)的甄別檢查。然而，

即便可用其他簡單方法檢查診斷TBM,但是陰性結(jié)果并不能排除感染M.Tb的可能性,因此，

用適宜的臨床檢測手段診斷TBM依然是一大難題。在急性臨床階段，CNS結(jié)核需要的不是

甄別性檢測而是一個確定性的檢查。因此，如果將巢式PCR用于從TBM高度疑似患者中收

集的明確適當(dāng)?shù)呐R床標(biāo)本中，他應(yīng)該是一項非常有用的技術(shù)。最后，用巢式PCR診斷CNS

結(jié)核的另一難點(diǎn)在于他需要配備一個合適的實(shí)驗(yàn)室以應(yīng)用這一精確的技術(shù);就現(xiàn)實(shí)情況而言,

在TBM高度流行區(qū)，常常沒有這種條件。這是CNS結(jié)核診斷中一個至關(guān)重要的問題，需要

得到盡快解決。

7、用于CNS結(jié)核診斷的PCR技術(shù)的新進(jìn)展

最近，為快速診斷CNS結(jié)核，作者開發(fā)了一種新型內(nèi)控寬量程定量巢式實(shí)時PCR法

（WR-QNRT-PCR）,用于M.TbDNA的檢測。該技術(shù)既有巢式PCR的強(qiáng)敏感性，又有實(shí)時定

量（TaqMan）PCR的精確性。（圖2a）

在WR-QNRT-PCR中，需準(zhǔn)備“野生”（W）和“新突變”（NM）兩種原質(zhì)粒，用來定量檢測

M.TbDNAo在W-質(zhì)粒中將一個239個堿基對的MPT64基因片段插入到pCR2.1載體中，作

為標(biāo)準(zhǔn)模版（圖2b）。NM-質(zhì)粒在W-質(zhì)?；A(chǔ)上進(jìn)一步突變，在iWR-QNRT-PCR中作為一個

新的內(nèi)控“校準(zhǔn)器”（圖2b）。在NM-質(zhì)粒中，五個區(qū)中包含兩對（內(nèi)部和外部）正向和

方向引物對，和一個TaqMan探針退貨位點(diǎn)，用人工隨機(jī)核酸置換這些位點(diǎn)（圖2b）。將人

工隨機(jī)核酸序列設(shè)置成與野生M.TbMPT64序列核酸組成一致的序列。制備四對特異性引物

和兩種特異性TaqMan探針，以備用于WR-QNRT-PCR中。表2和圖2b顯示了這些引物和探

針的序列和位置。對野生M.Tb或W-質(zhì)粒的MRT64序列來說，兩對正向和反向引物（WF1和

WR1兩個外部引物用于第一步，TqMn-WF2和TqMn-WR2兩個內(nèi)部引物用于第二步）和

TaqMan探針（TqMn-W-VIC）是特異的。相比而言，對NM-質(zhì)粒中用作新內(nèi)控“校準(zhǔn)器”的人

工隨機(jī)核酸來說,兩對正向和反向引物（MF1和MR1兩外部引物及TqMn-MF2和TqMn-MR2

兩內(nèi)部引物對）和TaqMan探針（TqMn-M-FAM）是特異的。這些引物和探針的核酸組成均設(shè)置

成一樣的，但是序列不同，是隨機(jī)分布的（表2）。因此，我們可以認(rèn)為，這些引物和探針

跟野生MPT64或NM-質(zhì)粒的退火效率是相同的。

WR-QNRT-PCR法包含兩步連續(xù)的PCR擴(kuò)增，第一步為傳統(tǒng)的普通PCR,第二步為實(shí)時

（TaqMan）PCR（圖2a）。在該法中，整個程序包括在相同的分析條件下同時提取、擴(kuò)增和檢

測M.TbDNA及作為新內(nèi)控的NM—質(zhì)粒，這需要用針對各自模版有著相同退火效率的四對

引物和兩個探針。因此，在CSF標(biāo)本中，根據(jù)擴(kuò)增率和新內(nèi)控校準(zhǔn)器（NM質(zhì)粒）的關(guān)系，

可計算M.TbDNA的起始拷貝量，計算公式如下：X:W=C:M.\X=WXC/M.（X,每毫升

CSF樣本中M.TbDNA的起始拷貝量；C,新內(nèi)控的起始拷貝量（="校準(zhǔn)器”103NM質(zhì)粒

拷貝）；W和M,分別為提取和擴(kuò)增后，M.TbDNA和NM-質(zhì)粒的拷貝數(shù)。）人們普遍認(rèn)為,

在M.Tb中，MPT64基因一次拷貝代表一個細(xì)菌。因此，我們可認(rèn)為用WR-QNRT-PCR法計

算的拷貝數(shù)與CSF樣本中M.Tb的細(xì)菌數(shù)有關(guān)。

WR-QNRT-PCR法需要兩個定量檢測M.TbDNA和新內(nèi)控物NM-質(zhì)粒的特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在實(shí)時（TaqMan）PCR中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的精確度是影響定量檢測的首要因素。圖2c和2d展示了

兩個特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線。在樣本回歸分析中，兩標(biāo)準(zhǔn)曲線均顯示Ct值（y軸）和每一標(biāo)準(zhǔn)模

版的起始拷貝數(shù)的對數(shù)（X軸）有顯著的線性相關(guān)（R2>0.99）。兩因素ANOVA法顯示，在重

復(fù)區(qū)組實(shí)驗(yàn)中兩個標(biāo)準(zhǔn)曲線均無顯著性差異（n=10;F=1.007,P=0.65和F=1.015,P=0.53）,

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率可計算出實(shí)時PCR的PCR效率（E用。公式如下:PCR效率=10（-1/斜率）-1.

兩個標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率分別為（-3.33和-3.28）,通過該公式可得PCR效率（E用分別為99.7和

101.8%。這些結(jié)果表明，WR-QNRT-PCR法中，M.TbDNA和新內(nèi)控物的擴(kuò)增和檢測效率幾乎

一樣。

當(dāng)將NM-質(zhì)粒103拷貝數(shù)的值設(shè)置為新內(nèi)控的最優(yōu)拷貝數(shù)時，NM-質(zhì)粒擴(kuò)增曲線顯示

作為模擬M.TbDNA的W-質(zhì)粒的所有起始拷貝數(shù)（1-105）有著顯著的統(tǒng)一模式（圖2e）。

此外，用單因素ANOVA法（圖2f）,NM-質(zhì)粒103拷貝的Ct值顯示所有W-質(zhì)粒的起始拷貝

數(shù)間的均方有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.086,P=0.774）。這些結(jié)果表明在整個PCR擴(kuò)增過程中，M.Tb

DNA和新內(nèi)控之間沒有干擾。因此，我們可以認(rèn)為在WR-QNRT-PSR法中，NM-質(zhì)?？勺鳛?/p>

內(nèi)控”校準(zhǔn)因子）。NM-質(zhì)粒的發(fā)展，使得WR-QNRT-PCR法有穩(wěn)固的統(tǒng)計學(xué)意義，使在寬檢

測范圍（1-105）進(jìn)行M.TbDNA檢測成為可能。

作者檢測了WR-QNRT-PCR法在CNS結(jié)核的精確快速診斷及其臨床過程評估中的效果。

作者收集了1998-2005年間24位TBM疑似患者和29位非TBM患者的標(biāo)本。從24位患者

中收集了67份CSF樣本，在這些樣本中，有43份是從10位（3號和8-16號病例）隨訪超

過2周的患者中得到的連續(xù)性標(biāo)本。表3總結(jié)了24位疑似TBM患者入院時（在ATT之前）

的臨床特征.所有的24位患者達(dá)到了（A）臨床標(biāo)準(zhǔn)并（B）符合TBM特征（如表3所述），有8

個確診病例（1-8號病例）（M.Tb的CSF培養(yǎng)陽性）和16個高度疑似病例（9-24號病例）（符

合所有臨床標(biāo)準(zhǔn)，有3個佐證診斷的陽性結(jié)果，但是未分離出病菌）。在臨床應(yīng)用中，對這

24位臨床TBM疑似患者來說，WR-QNRT-PCR法顯示了足夠高的敏感性（95.8%）和特異性

（100%）o表3列出了測得的每毫升CSF中M.TbDNA的拷貝數(shù)。在傳統(tǒng)的logistic回歸中，每

毫升CSF中M.TbDNA的拷貝數(shù)>8000,是導(dǎo)致TBM預(yù)后不良（=死亡）的獨(dú)立危險因素（OR=

16.142,95%CI=1.191-218.79,*P=0.0365）。在歷時研究中，在10位TBM疑似患者的臨床治

療過程中，M.TbDNA的拷貝數(shù)有顯著改變。這10位患者包括2個確診病例（3號和8號病

例）和8個高度疑似病例（9-16號病例），在從3號和8號患者臨床治療過程所收集的43

份CSF標(biāo)本中，只有3份M.Tb培養(yǎng)結(jié)果為陽性。相比之下，用WR-QNRT-PCR法進(jìn)行M.TbDNA

的定量檢測顯示有25份CSF標(biāo)本陽性。止匕外，有8位患者（8-14號和16號病例）ATT有效

且其臨床分期和常規(guī)CSF結(jié)果在臨床療程中均得到改善，M.TbDNA的拷貝數(shù)逐漸減少到低

于WR-QNRTPCR法的檢測限（圖2g）。然而，在3號和15號病例中，ATT無效并死于TBM

惡化，在整個臨床過程中，拷貝數(shù)持續(xù)增高（圖2g）。重復(fù)測量ANOVA顯示，在臨床治療

過程中，ATT有效（8、14、16號病例）和無效（3和8號病例）患者的M.TbDNA拷貝數(shù)改

變趨勢有著顯著差異（*P=0.0041）（圖2g）。在11和12號病例中，入院時顱部MRI顯示多

個顱內(nèi)局灶性腫物，認(rèn)為是典型的結(jié)核瘤（表4和圖2h）。在進(jìn)行ATT過程中，WR-QNRT-PCR

法顯示陰轉(zhuǎn)后，這兩個結(jié)核瘤病例再次顯示無任何腦膜炎癥狀的瞬態(tài)陽性。一般來說，結(jié)核

瘤患者常伴有TBM,當(dāng)然在無TBM的情況下結(jié)核瘤也會發(fā)生。隨訪MRI顯示，這兩例結(jié)核瘤

分別在ATT5個月和3個月后消失（表4）。有意思的是，隨著結(jié)核瘤的消失，WR-QNRT-PCR

結(jié)果顯示為完全陰性。作者推斷在ATT期間，用WR-QNRT-PCR法對這兩個病例進(jìn)行M.TbDNA

的瞬態(tài)檢測與結(jié)核瘤有關(guān)。在結(jié)核瘤中存在少量M.Tb。ATT可使結(jié)核瘤破裂，隨著它的破裂

會有少量M.TbDNA滲入CSF中，高度敏感的WR-Q.NRT-PCR法可能會檢測到這些DNA.這些

結(jié)果表明，在急性臨床病例中，可用基于分子的技術(shù)和神經(jīng)放射成像技術(shù)相結(jié)合的方法作為

診斷TBM和結(jié)核瘤的強(qiáng)效方法。眾所周知，目前尚無有關(guān)這兩個病例的報道；因此，我們

可認(rèn)為他們在臨床上十分重要。而且，在簡單回歸分析中顯示M.TbDNA拷貝數(shù)和TBM臨床

分期顯著相關(guān)（R2=0.597,*P<0.0001）（圖2D。這些歷時研究結(jié)果表明WR-QNRT-PCR在評估

TBM臨床過程和ATT反應(yīng)的定量分析時非常有用。眾所周知，以前的研究中，沒有對CNS

結(jié)核整個臨床過程的CSF樣本中M.Tb的細(xì)菌數(shù)和DNA量的報道。將WRQNRT-PCR用于急性

臨床階段定量檢測CSF中M.TbDNA,因?yàn)榘袾M-質(zhì)粒作為新內(nèi)控，所以該法有著顯著的精

確度和可信度。因此，我們可認(rèn)為，在CNS結(jié)核的快速精確診斷中，這是一種先進(jìn)高效的

方法。

然而，這種新技術(shù)尚未廣泛用于臨床常規(guī)檢查。可能是WR-QNRT-PCR法需要兩步連續(xù)

擴(kuò)增，步驟繁雜。因此，作者正在研發(fā)新的簡易實(shí)惠的定量和高敏感技術(shù)，使之可以和一步

的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)時PCR發(fā)展而來的WR-QNRT-PCR法相媲美。這種正在研發(fā)的方法結(jié)合了全基因組

擴(kuò)增（WGA）和實(shí)時（TaqMan）PCR技術(shù)。全基因組擴(kuò)增為少量優(yōu)質(zhì)DNA擴(kuò)增成為可能并且其

中的幾項技術(shù)可用于商品化試劑盒，價格合理。特別值得一提的是，這些應(yīng)用WGA法的試

劑盒采用的是多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于許多研究中，實(shí)現(xiàn)了基因組的均

衡擴(kuò)增。MDA技術(shù)是一種優(yōu)越的方法，該法用Phi29DNA噬菌體多聚酶和隨機(jī)六聚體引物

實(shí)現(xiàn)了基因組DNA的持續(xù)擴(kuò)增。在該項研究中，作者用的是基于MDA技術(shù)的GenomiPhiV2

試劑盒（GEHealthcareLifeSciences,Uppsala,Sweden）o因?yàn)橹苯佑肎enomiPhiV2試劑盒即可

提取和純化CSF中的少量M.TbDNA,使其作為模版,WR-QNRT-PCR法中的第一步即可省略。

現(xiàn)行WGA法的改進(jìn)可顯著簡化WR-QNRT-PCR法。因此，盡管該技術(shù)仍有待于研究，但是

我們都期待這種經(jīng)濟(jì)的臨床檢測方法可廣泛進(jìn)行臨床實(shí)際應(yīng)用。

如上所述，包括TBM在內(nèi)的CNS結(jié)核是M.Tb感染的最嚴(yán)重形式，會引起死亡和嚴(yán)重

的后遺癥。此外，由于AIDS流行引起免疫功能不全個體及高齡人群不斷增加，再加上皮質(zhì)

激素等免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，使得CNS結(jié)核依然是一個嚴(yán)重的臨床和社會問題。特別是

在亞洲和非洲這樣的不發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家，有著許多日益加劇的社會問題，如貧困、人

口過多。營養(yǎng)不良等等，這使得包括TBM在內(nèi)的M.Tb感染流行，成為一個嚴(yán)重的社會和人

口統(tǒng)計學(xué)難題。作者認(rèn)為我們有必要發(fā)展新技術(shù)并且使這些技術(shù)能夠在這些地方應(yīng)用。我們

所研究的新技術(shù)的廣泛應(yīng)用將導(dǎo)致TBM早期確診病例增加進(jìn)而改善TBM的療效；因此，他

們?yōu)檫@些國家做出了巨大的醫(yī)學(xué)和社會貢獻(xiàn)。我們努力開發(fā)新的，更為快速、精確、敏感、

簡易、實(shí)惠且能定量的診斷CNS結(jié)核的技術(shù)，我們希望這種努力有助于改善全球的醫(yī)療護(hù)

理，特別是在不發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家。

8、結(jié)論

近期，在快速精確診斷CNS結(jié)核方面，除了基于細(xì)菌學(xué)的傳統(tǒng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，我們嘗試了各

種方法。本文對近期NAA法（主要是PCR技術(shù)）的進(jìn)展做一綜述。特別是巢式PCR法的發(fā)

明，為CNS結(jié)核的診斷做出了重要貢獻(xiàn)。WR-QNRT-PCR法有內(nèi)控物并結(jié)合了高度敏感的巢

式PCR和精確實(shí)時定量PCR,被認(rèn)為可快速診斷TBM,盡管如此，該法尚未用于臨床常規(guī)檢

查。這種新技術(shù)有高敏感性且能精確定量，不僅能用于CNS結(jié)核的診斷，還能預(yù)測預(yù)后，

評估TBMATT過程中的療效。因此，我們希望該法能廣泛用于CNS結(jié)核急性臨床階段的診

斷。

甲狀腺癌的分子診斷的最新進(jìn)展

最常見的內(nèi)分泌腫瘤甲狀腺癌的發(fā)病率在過去十年中日益增加。濾泡起源的甲狀腺癌的

組織學(xué)分型有甲狀腺乳頭狀癌（PTC）,甲狀腺濾泡狀癌（FTC），和甲狀腺未分化癌（ATC）.

良性甲狀腺腫瘤（BTA）是常見的內(nèi)分泌腫瘤。另一方面，甲狀腺髓樣癌并非濾泡細(xì)胞起源，

而是起源與濾泡旁細(xì)胞或C細(xì)胞，因此，在此不做贅述。

大量研究表明，高治愈率的分化良好的甲狀腺癌（WDTC）,濾泡細(xì)胞起源的甲狀腺腫瘤，

到常常致命的甲狀腺未分化腫瘤是逐級進(jìn)展的。低分化的甲狀腺癌及WDTC的侵襲性變體

（如高細(xì)胞和柱細(xì)胞）常為這一生物連續(xù)性進(jìn)展模型中的中間體。

臨床、流行病學(xué)及病理學(xué)均有證據(jù)支持該逐步進(jìn)展和去分化這一概念。例如，伴隨著有

絲分裂，壞死，及核的多形性的出現(xiàn)，在侵襲性甲狀腺腫瘤中可見乳頭狀及濾泡狀增長的逐

步消失，與此同時穩(wěn)健增長逐步加強(qiáng)。這些腫瘤中大部分含有分化的甲狀腺腫瘤的殘余灶。

在臨床醫(yī)治甲狀腺癌時，常常會難于診斷。原因之一在于評估甲狀腺結(jié)節(jié)時廣為應(yīng)用的

細(xì)針吸取標(biāo)本（FNAB）為模棱兩可的細(xì)胞學(xué)。如在美國，每年在甲狀腺結(jié)節(jié)的300000個病例

中，大部分為BTA.而且，20-30%的FNAB顯示為模棱兩可的細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)，這一報告模式在

過去的20年來一直沒變。盡管相當(dāng)多的患者為良性結(jié)節(jié)，但他們?yōu)槭菇Y(jié)節(jié)完全回復(fù)常態(tài)，

全都選擇手術(shù)治療。

在甲狀腺癌患者進(jìn)行合適的外科治療和藥物治療中，謹(jǐn)慎的風(fēng)險分層是其中關(guān)鍵的一步。

這種風(fēng)險評估通?；谂R床病理學(xué)因素，這種評估可信度低且大部分時候不能在甲狀腺手術(shù)

前得到結(jié)果。

大部分甲狀腺癌患者的愈后都非常好。一般的治療包括全甲狀腺切除，在疾病進(jìn)一步發(fā)

展階段，用放射碘（1-131）療法進(jìn)行殘余物消融或治療。只有腫瘤表形與正常甲狀腺一樣，存

在通過TSH受體和碘鹽共輸體（NIS）的表達(dá)對生長因子TSH有反應(yīng)時，這些治療方法才能見

效。用頸部超聲等解剖成像、全身放射碘掃描和帶有抗甲狀腺球蛋白抗體的特異性甲狀腺球

蛋白血清學(xué)測定等方法對患者進(jìn)行監(jiān)測。

在另一方面，伴有再發(fā)性或代謝性疾病的甲狀腺癌患者其死亡率高達(dá)50%。甲狀腺癌的

去分化包括TSH受體表達(dá)的丟失，NIS,和甲狀腺球蛋白的丟失。在腫瘤不能進(jìn)行NIS表達(dá)過

程中，臨床醫(yī)生也不能用放射碘進(jìn)行監(jiān)測和治療。然而，處于該狀態(tài)的腫瘤在18F-脫氧葡萄

糖正電子發(fā)射斷層掃描（FDG-PET）中可見。就臨床而言，對于FDG-PET陽性的非碘敏感腫

瘤的治療方法有觀察、附加手術(shù)、外部離子束照射，還有像美國FDA認(rèn)證的doxorubicin化

療藥物，及臨床實(shí)驗(yàn)。

近來引進(jìn)的靶向治療藥物有多個靶點(diǎn)，包括受體酪氨酸激酶，非受體酪氨酸激酶，和絲

氨酸蘇氨酸激酶，這些藥物為甲狀腺癌沉珂患者帶來了福音。

分子醫(yī)學(xué)的現(xiàn)行目標(biāo)是能夠描繪每位患者的腫瘤，以決定用何種方法來達(dá)到最佳療效。

在基因和/或表觀遺傳調(diào)節(jié)等腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域其概念的闡述和技術(shù)方面有著顯著進(jìn)步，但在

甲狀腺致癌基因中卻缺乏統(tǒng)一的理論。本綜述旨在提供一個框架，以了解相關(guān)研究該如何發(fā)

展才能針對不同腫瘤基于相應(yīng)治療。

2、染色體重排

在甲狀腺乳頭狀癌中最早能識別的基因改變?yōu)樵┗騌ET（轉(zhuǎn)錄時重排）的染色體改

變。此RET原癌基因是位于10號染色體長臂近端的21號外顯子,他可編碼酪氨酸激酶受體。

他涉及神經(jīng)崎起源細(xì)胞的生長，生存，分化和移動的調(diào)節(jié)。正常情況下，他不在卵泡細(xì)胞中

表達(dá)。易發(fā)生異位基因部位有獨(dú)特的空間接近性，這可以在甲狀腺有絲分裂中期、favorsRET

基因重排時優(yōu)先發(fā)生，這就是甲狀腺腫瘤中RET重排具有特異性的原因。

盡管有10多個重排得以描述，但是在PTC中發(fā)現(xiàn)的重排大部分是RET/PTC1,RET/PTC2,

和RET/PTC3。這些重排中管家（或普遍表達(dá)）基因的上游（5'端）元件能驅(qū)使RET酪氨酸

激酶區(qū)域表達(dá)。融合基因提供的異源引物有助于RET/PTC嵌合蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致乳頭狀癌細(xì)

胞中RET受體酪氨酸激酶中組分及依賴性配體的激活。

臨床上，在放射相關(guān)RTC中?？砂l(fā)現(xiàn)RET/PTC變體。1986年切爾諾貝利核電廠爆炸后

小兒甲狀腺癌增加導(dǎo)致甲狀腺癌兩個組分的形成。第一個為可早期發(fā)現(xiàn)并有侵襲性的PTC

穩(wěn)固變體，他含有RET/PTC3重排。而第二個PTC為帶有更為典型的表型和臨床過程，在切

爾諾貝利核爆后的生存者中含有RET/PTClo

轉(zhuǎn)基因小鼠和體外細(xì)胞作用均表明這些融合蛋白能啟動PTCo在甲狀腺未分化癌中

RET/PTC重排并不常見，這表明這些腫瘤可用常規(guī)療法處理。而且，用RET/PTC法識別來自

FNA的甲狀腺結(jié)節(jié)診斷PTC已經(jīng)開始啟用。

有證據(jù)表明RET/PTC重排代表導(dǎo)致PTC進(jìn)展的早期基因改變。約有20%不定期發(fā)生的

PTCS中可見RET/PTC重排。而且在甲狀腺皮質(zhì)和其他良性損傷中也可見RET/PTC重排。然而，

既然這種重排見于大部分腫瘤細(xì)胞，我們就有理由認(rèn)為他具有PTCS特異性。

有幾項研究表明與PTC有關(guān)的RET/PTC重排缺乏進(jìn)展到PDTC或ATC的證據(jù)。近期

Santoro等人的研究表明顯示RET/PTC重排的PDTCs少于10%?因此他們得出結(jié)論：相對而

言，帶有RET/PTC重排的PTC發(fā)展為PDTC或ATC的可能性較小。

近來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有顯著抑制RET酶活性的復(fù)合物。特別是在用甲磺酸伊馬替尼（可激活

ABL激酶的抑制因子）治療慢性髓性白血病方面取得了顯著成效，這一成功顯著促進(jìn)了治療

性蛋白激酶抑制因子的研究。有對抗RET活性的多種藥物正處于試驗(yàn)階段，最值得關(guān)注的有

ZD6474-Vandetanib和Bay43-9006-Sorafenib,但是這些藥物也作用于其他酪氨酸激酶受體。

特別是Sorafenib,他在兩次二期臨床試驗(yàn)中的有效率分別為15%和23%,由于Vandetanib

有阻斷RET信號活性才能力，他率先應(yīng)用于髓性甲狀腺癌患者，然而，對于DTC患者，還

正處于二期臨床試驗(yàn)。

3、RAS突變

在3型甲狀腺癌，絲裂素活化蛋白激酶、胞外信號調(diào)節(jié)酶（RAS/Raf/MEK/ERK）和磷脂酰

肌醇-3激酶（PI3K）/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，RAS（Rat肉瘤的簡寫形式）癌基因家族調(diào)節(jié)兩個重

要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。良性和惡性甲狀腺腫瘤中均可見RAS突變，在ATCs中有可變頻率。

由H-RAS,K-RAS,和N-RAS三個RAS基因合成的21-kDa蛋白質(zhì)家族在腫瘤形成過程中

起重要作用。RAS蛋白有兩種存在形式：一種為富含二磷酸鳥甘（GDP）的非活性形式和富含

三磷酸鳥甘（GTP）的活性形式。他們能將起于酪氨酸激酶膜受體的信號傳給級聯(lián)的有絲分裂

素激活蛋白激酶（MAPKs）。這將激活靶基因的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞的增殖、存活和凋亡。在外顯子

1GTP結(jié)合區(qū)域（密碼子12或13）或外顯子2GTPase區(qū)域（密碼子61）的點(diǎn)突變可激活致

癌基因RAS,這可使蛋白質(zhì)處于激活狀態(tài)并導(dǎo)致下游靶位的慢性刺激，基因組的不穩(wěn)定性，

額外的突變和惡性轉(zhuǎn)化。RAS突變是轉(zhuǎn)化細(xì)胞中最常見的突變之一。在良惡性甲狀腺腫瘤中

均可見三種RAS基因的突變。他們在濾泡癌，PDTC,和ATC中均較常見，在PTC中較少。

RAS致癌基因在甲狀腺腫瘤發(fā)展過程中的作用還不清楚。

一些研究表明在良惡性甲狀腺腫瘤中RAS突變盛行率相當(dāng)，這說明RAS激活么能代表

著早期事件。另外一些研究表明RAS突變特別是N-RAS61號密碼子的突變與腫瘤的進(jìn)展和

侵襲性臨床表現(xiàn)有關(guān)。伴有甲狀腺特異性RAS表達(dá)突變的轉(zhuǎn)基因小鼠會發(fā)展為甲狀腺增生

和甲狀腺腫瘤。Garcia-Rostan等人近期研究顯示RAS突變預(yù)示著WDTC獨(dú)立腫瘤階段的預(yù)后

不好。

而且，他們發(fā)現(xiàn)PDTC和ATC常有多個RAS突變。這些突變可能代表甲狀腺腫瘤進(jìn)展過

程的中間階段。

4、甲狀腺癌中的BRAF突變和MAP激酶信號轉(zhuǎn)