抗生素分離純化新技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

抗生素分離純化新技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀【摘要】從發(fā)酵液中分離純化抗生素,是抗生素新藥研發(fā)的難點(diǎn).根據(jù)抗生素性質(zhì)的差異建立的分離純化方法各不相同,因此采用合理有效的分離純化技術(shù)路線是新型抗生素研究成功與否的關(guān)鍵.本文綜述了并且報(bào)道了一些國(guó)內(nèi)外最近研制出的新型抗生素的分離純化方法的應(yīng)用及其廣闊的前景.【關(guān)鍵詞】抗生素；分離純化；膜分離；大網(wǎng)格吸附抗生素簡(jiǎn)介抗生素（antibiotics）是由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動(dòng)植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)?，F(xiàn)臨床常用的抗生素有微生物培養(yǎng)液液中提取物以及用化學(xué)方法合成或半合成的化合物。目前已知天然抗生素不下萬種。抗生素以前被稱為抗菌素，事實(shí)上它不僅能殺滅細(xì)菌而且對(duì)霉菌、支原體、衣原體等其它致病微生物也有良好的抑制和殺滅作用，近年來通常將抗菌素改稱為抗生素。抗生素可以是某些微生物生長(zhǎng)繁殖過程中產(chǎn)生的一種物質(zhì)，用于治病的抗生素除由此直接提取外；還有完全用人工合成或部分人工合成的。通俗地講，抗生素就是用于治療各種細(xì)菌感染或抑制致病微生物感染的藥物。重復(fù)使用一種抗生素可能會(huì)使致病菌產(chǎn)生抗藥性。之所以現(xiàn)在提出杜絕濫用抗生素此乃是原因之一。科學(xué)地使用抗生素是有的放矢。通常建議做細(xì)菌培養(yǎng)并作藥敏試驗(yàn)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果選用極度敏感藥物，這樣就避免了盲目性，而且也能收到良好的治療效果?？股胤蛛x純化抗生素的提煉一般是指將在發(fā)酵液中積累的抗生素經(jīng)過分離、濃集、純化，獲得符合使用要求制品的全過程。是一門利用各種化工單元操作有機(jī)組合進(jìn)行生物技術(shù)產(chǎn)品后處理的技術(shù)。由于抗生素的生源、性質(zhì)各異，在發(fā)酵液中存在形式、雜質(zhì)的干擾情況不一，以及制品的使用要求不同，所以抗生素的提煉過程不可能有一規(guī)范化的模式。即使是同種抗生素，常因生產(chǎn)菌株、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件或發(fā)酵水平的差異而采用不同化工單元組合的提煉工藝。如以土霉素的生產(chǎn)為例，其提煉方法曾有鈣鹽沉淀、溶媒萃取、離子交換及游離堿沉淀等的演變。極大多數(shù)的抗生素是微生物代謝過程的次級(jí)產(chǎn)物，過量合成的抗生素一般都是直接分泌到胞外，有的溶于培養(yǎng)液、有的與培養(yǎng)液中其他組分結(jié)合后沉積或粘附于菌體。發(fā)酵液中菌體等固形雜質(zhì)的量因抗生素品種而異，一般在10一40腸(v/v)的范圍。培養(yǎng)液中溶有殘留的培養(yǎng)基成分1~5%(w/v)、其他的代謝產(chǎn)物及菌體自溶后滲出的胞漿等雜質(zhì)，抗生素的含量一般僅為。.1一3腸(w/v)左右。抗生素的提煉在概念上是由預(yù)處理、分離、濃集、純化諸環(huán)節(jié)所構(gòu)成。一個(gè)化工單元，操作有時(shí)可能達(dá)到若干個(gè)目的。3.抗生素的分離純化技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀3.1大網(wǎng)格吸附樹脂在抗生素分離純化方面的應(yīng)用大網(wǎng)格吸附劑近年來發(fā)展比較迅速，大網(wǎng)格樹脂在抗生素分離、純化方面的應(yīng)用有很廣泛的應(yīng)用。如在多膚類:、酮類、糖類、雜環(huán)類、絲裂霉素類多烯類、、核普類、蔥環(huán)類、菇烷類、吩嗓類等抗生素在分離純化中應(yīng)用了大網(wǎng)格吸附劑。目前它巳逐漸取代活性炭和Al:03等經(jīng)典的吸附劑，在抗生素’制備工藝中’顯示出愈來愈重要的作用。和活性炭相比，它具有選擇性好、解析容易、機(jī)械強(qiáng)度好可反復(fù)使用和流體阻力小等優(yōu)點(diǎn)〔3，.〕，特別是其孔隙大小、骨架結(jié)構(gòu)和極性可按不同原料和合成條件進(jìn)行選擇。因此可適合于吸附各種有機(jī)化合物。過去必須用有機(jī)溶劑提取或只能用活性炭吸附的抗生素，目前用大網(wǎng)格吸附劑提取也取得了滿意的結(jié)果。這為進(jìn)一步革下除離心機(jī)，簡(jiǎn)化工，序和設(shè)備，節(jié)約有機(jī)溶媒，提供了很大的可能性。另外，對(duì)于一些屬弱電解質(zhì)的非離子型抗生素，過去不能用離子交換法分離，現(xiàn)在也可考慮用大網(wǎng)格吸附荊。因此，它可補(bǔ)充離子交換樹脂的不足，為抗生素的提純提供了新途徑。3.2大孔網(wǎng)狀吸附劑在抗生素分離純化中的應(yīng)用大孔網(wǎng)狀吸附劑的應(yīng)用新發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，采用大孔網(wǎng)狀吸附劑分離、純化抗生素是抗生素工業(yè)中值得注意的動(dòng)向。最近幾年來，國(guó)外發(fā)表的新抗生素中有不少是用大孔網(wǎng)狀吸附劑作為提取精制手段。大孔吸附劑不僅可以吸附脂溶性抗生素，而且可以吸附水溶性抗生素，過去認(rèn)為必須用有機(jī)溶劑提取，或者只能用活性炭吸附的抗生素，用它提取也取得滿意的結(jié)果。這為進(jìn)一步割除離心機(jī)、節(jié)約有機(jī)溶劑以及革除大量廢液回收工序和設(shè)備，提供了很大的可能性。這種非離子型的多孔骨架，其性質(zhì)和天然吸附劑活性炭相似，在某種程度上要比活性炭?jī)?yōu)越得多。3.3逆流色譜技術(shù)在抗生素分離純化中的應(yīng)用現(xiàn)代逆流色譜技術(shù)為化合物的分離純化提供了一個(gè)新的手段,與HPLC等液-固色譜技術(shù)比較,由于分離原理不同,二者間存在很強(qiáng)的互補(bǔ)性。它無需固體作固定相,不存在固體對(duì)樣品組分的吸附、玷污、變性、失活、拖尾等現(xiàn)象,能實(shí)現(xiàn)很高的回收率,節(jié)省昂貴的材料消耗和溶劑消耗(HPLC的1/10以下),運(yùn)行使用的后續(xù)投入較低。逆流色譜在無需更換不同極性的色譜柱情況下,通過提高極性溶劑或非極性溶劑比例的方法,可以實(shí)現(xiàn)流動(dòng)相從弱極性到強(qiáng)極性或相反的轉(zhuǎn)化。由于色譜柱容積大,無填料,柱內(nèi)空間全部是有效空間,因此,樣品負(fù)載能力強(qiáng),制備量大,重現(xiàn)性好。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的盤管總體積為100ml的逆流色譜儀一次可分離0.5~2g的粗品,而3000ml容量的制備型逆流色譜儀一次可分離15~60g的粗品。但是,與氣相色譜和高效液相色譜等相比,逆流色譜的分離效率即理論塔板數(shù)還不高(一般在1000以下),一次分離所需時(shí)間還較長(zhǎng)(以小時(shí)計(jì)),因此,還不宜用于組成復(fù)雜的混合物的全譜分離分析。逆流色譜技術(shù)在基本原理以及溶劑系統(tǒng)選擇等方面還有待于進(jìn)一步的普及研究開發(fā)與應(yīng)用逆流色譜技術(shù)已經(jīng)成功用于許多抗生素的分離純化,這些抗生素的結(jié)構(gòu)類型有肽類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、蒽環(huán)類、放線菌素類、多烯類、核苷類、糖類和頭孢類等(表2)。本文作者等用國(guó)產(chǎn)分析型TBE-300高速逆流色譜儀(深圳同田生化技術(shù)有限公司)對(duì)含環(huán)孢菌素A、B、C、D的混合物進(jìn)行分離,以石油醚/丙酮/水(3∶3∶2,V/V)為溶劑系統(tǒng),下相為流動(dòng)相,運(yùn)行8h后得到純度大于98.5%的A、B、C、D各組分,收率高于85%。事實(shí)證明高速逆流色譜技術(shù)在抗生素分離純化方面大有可為。3.4超濾膜在抗生素提取中的應(yīng)用超濾膜的特征是截留大分子,透過小分子,進(jìn)行大分子與小分子的分離。超濾膜的組件類型主要有中空纖維膜、卷式膜及管式膜。用超濾可以對(duì)生物活性物質(zhì)和熱敏感性藥物如酶、多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行濃縮、提取和分離。發(fā)酵料液的相對(duì)分子質(zhì)量從數(shù)百到數(shù)萬,因此在抗生素分離提取中,超濾通常被用于預(yù)處理過程,以實(shí)現(xiàn)高效率的分離純化。超濾膜在芐青霉素提取中以及其他抗生素提取中都有應(yīng)用。3.5反滲透膜在抗生素提取中的應(yīng)用反滲透(RO)最初用于水處理方面,因其成本較高,難度也較大,在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用研究尚處于起步階段。近年來,反滲透過程在果汁濃縮、提取抗生素和添加劑提純方面的應(yīng)用已有報(bào)道,中國(guó)在這方面的研究還有待進(jìn)一步深入。反滲透膜在6-氨基青霉烷酸(6-APA)中、在鏈霉素生產(chǎn)工藝中、在濃縮紅霉素發(fā)酵液濾液中、在處理土霉素結(jié)晶母液中都有廣泛的應(yīng)用。3.6納濾膜在抗生素提取中的應(yīng)用發(fā)酵法生產(chǎn)的抗生素原液中含4%生物殘?jiān)?、不定的鹽分、約0·1%~0·2%的抗生素。納濾(NF)膜可通過兩種途徑回收和純化抗生素:一種是先用溶劑萃取,再用NF膜濃縮,這一過程由于溶劑可循環(huán)利用,可節(jié)約80%的成本;另一種是先用膜濃縮再用溶劑萃取,這一方法可大大提高萃取設(shè)備的生產(chǎn)能力,降低溶劑的用量。納濾膜在提取6-氨基青霉烷酸(6-APA)中、在提取螺旋霉素中、在提取其他抗生素中有廣泛的應(yīng)用。3.7乳狀液膜在抗生素提取中的應(yīng)用液膜具有進(jìn)行高度提取所需的較大接觸面積和時(shí)間,所以其滲透速度很快,非常適合于分離和富集較不穩(wěn)定的抗生素;同時(shí)液膜提取使回收操作一步完成,推進(jìn)了在抗生素分離和純化中的應(yīng)用。液膜萃取技術(shù)在抗生素提煉中的應(yīng)用研究主要是青霉素的提取,雖未商品化,但個(gè)別技術(shù)已進(jìn)入中試階段。液膜分離在其他幾類抗生素提取中的應(yīng)用報(bào)道較少。乳狀液膜在提取青霉素中、在提取其他抗生素中有廣闊的應(yīng)用前景。結(jié)語抗生素分離純化過程是一項(xiàng)非常繁瑣艱巨的任務(wù)，尤其對(duì)未知成分的新型抗生素的分析，需要投入大量的人力物力，不僅要求研究人員熟練掌握各種分離技術(shù)，還要求研究人員有足夠的耐心。在總結(jié)前人分離純化的基礎(chǔ)上，敢于嘗試各種分離純化技術(shù)并勇于創(chuàng)新，從而合理的摸索出一條新的分離純化的路線來。將這些新的分離純化技術(shù)應(yīng)用到現(xiàn)實(shí)生活中的各個(gè)行業(yè)。在日漸繁榮的今天，隨著科技的進(jìn)步，人才的涌出，抗生素的分離純化技術(shù)會(huì)適用時(shí)代的進(jìn)步，在應(yīng)用中會(huì)有廣闊的前景，會(huì)研究出更多更好節(jié)能節(jié)料環(huán)保的新技術(shù)?？股氐姆蛛x純化的前景不可估量。參考文獻(xiàn)[1]張?zhí)煊?逆流色譜技術(shù)[M].北京:北京科學(xué)技術(shù)出版社,1993[2]NisbetLJ.[J].Chem.Tech.Biotechbol.,1982,32(1):251[3]方孝華.[J].醫(yī)藥工程設(shè)計(jì),1998,2(3):11~13[4]BritesAlvesAM,MoraoA,CardosoJP.[J].Desalination,2002,148:181~186[5]劉路,劉玉榮.[J].水處理技術(shù),2000,26(3):169[6]何旭敏,何國(guó)梅,曾碧榕等.[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào),2001,40[7]上?；W(xué)院。醫(yī)藥工業(yè)1977:8[8]鄔行彥,孫進(jìn).[J].國(guó)外醫(yī)藥抗生素雜志分冊(cè),1992,13(6):455~462[9]樓福樂,毛偉鋼,陸曉峰.[J].膜科學(xué)與技術(shù),1999,19(3):8~12[10]JoachimDanzig,WilhelmTischer,ChristianWandrey.[J].Chem.Eng.Technol.,1995,18:256[11]曹學(xué)君,鄔行彥,吳彤等.[J].生物工程學(xué)報(bào),1998,