DB42-T 2252-2024 牛無綠藻PCR-RFLP檢測技術(shù)

DB42PCR-RFLPdetectiontechniqueforProtothecabovis湖北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 2 2 2 3 4 5 6 6 8本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定對本文件的有關(guān)修改意見建議請反饋至武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，聯(lián)系電話郵箱：1牛無綠藻PCR-RFLP檢測技術(shù)本文件適用于生鮮乳中牛無綠藻的定性檢測、實驗GB4789.2食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范SN/T3902檢驗檢疫二級生物安全3.1牛無綠藻Protothecabovis4縮略語P.bovis：牛無綠藻（Protothecabovis）DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAciPIM：無綠藻分離培養(yǎng)基（ProtothecaIsolationMedTSB：胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TryptoneSoybeanBrothMePCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReactPCR-RFLP：限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（RestrictionFragmentLengtPBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferSalTAE：三乙醇胺四乙酸緩沖液（Tris-acatate-ethyleneDiamineTetraaceticAcidBu2cytb：細(xì)胞色素b（cytochromeb）物，可擴增牛無綠藻，然后通過特異性的限制性酶切反應(yīng)，鑒定牛a)超凈工作臺；3357.1.3電泳相關(guān)試劑：TAE、瓊脂糖、GelRed熒光染料、DL500DNA7.1.4限制性內(nèi)切酶試劑：TaiI和RsaI快切酶，可使用其他效果相似商品化限制性內(nèi)切酶。7.1.5陽性對照：含有牛無綠藻cytb基因序列的重組pMD18-T載體（20ng/mL）。7.1.6陰性對照：無菌雙蒸水（符合GB/T66827.2引物上游引物:5’-gtgtagaacatattatgagag-3’下游引物:5’-tacccataagaaataccattctgg-3’7.3材料a)離心管（1.5mL，200μL）；c)移液器吸頭（1mL，200μL，10μL）。擇白色奶油樣凸起的單個菌落進行繼代培養(yǎng)中培養(yǎng)36h～48h，培養(yǎng)液OD600值在2～3之間。8.3樣品的制備渦旋混勻，10000rpm離心2min，棄掉上清，收集沉淀樣品于1.5mL滅菌離心管中。8.4樣品的存放收集的樣品放置于冰上或者2℃~8℃條件下保存，盡快進行檢測。制備的樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；若需長期保存，應(yīng)置于-80℃冰箱49檢測步驟吸取上清，冰上或者2℃~8℃條件下保存，盡快進行檢測。制備的樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；若需長期保存，應(yīng)置于-80℃冰箱保存，避PCR擴增反應(yīng)體系配制見表3。表3中引物使用濃度為10μmol/μL，陽性對照和待檢樣品均需稀釋20體系(μL）2259.3PCR擴增9.4PCR-RFLP酶切PCR-RFLP酶切反應(yīng)體系配制見表4。將表4的反應(yīng)體系（不含PCR產(chǎn)物）充分混勻后，每個反應(yīng)管中37℃下酶切10min（RsaI，10U/μL），然后在65℃下酶切10min（TaiI，10U/μL）。體系(μL）5TaiI快切酶RsaI快切酶5混合后鋪板。5μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物，包括被檢樣品、陽性對照、陰性對照；5μL的DL括被檢樣品、陽性對照和陰性對照；5μL的DL500DNAMa9.6凝膠成像10.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)PCR結(jié)果：牛無綠藻陽性對照樣品，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后，出現(xiàn)大小為644bp的特異性擴增條帶，610.2結(jié)果判定樣品PCR擴增未出現(xiàn)特定性的陽性擴增條帶或酶切結(jié)果未出現(xiàn)與陽性對照大小一致的三條帶，判定為陰性；樣品PCR擴增出現(xiàn)大小為644bp特異性陽性擴增條帶，且酶切結(jié)果出現(xiàn)與陽性對照大小一致的實驗室應(yīng)符合SN/T3902要求，實驗室生物安全應(yīng)符合G94條修改意見現(xiàn)已根據(jù)修改意見全部進行了修改或說明，兩家權(quán)威單位對本標(biāo)準(zhǔn)的方法驗證進行了驗12.3針對標(biāo)準(zhǔn)中相關(guān)的樣品采樣人員和實驗室人員需進行標(biāo)準(zhǔn)的宣貫和培訓(xùn)，詳細(xì)解說標(biāo)準(zhǔn)各章條78標(biāo)準(zhǔn)名稱及編號總體評價適用性該標(biāo)準(zhǔn)與當(dāng)前所在地的產(chǎn)業(yè)或社會發(fā)展水平是否相匹配？是否協(xié)調(diào)性該標(biāo)準(zhǔn)的特色要求與其他強制性標(biāo)準(zhǔn)的主要技術(shù)指標(biāo)、相關(guān)法律法規(guī)、部門規(guī)章或產(chǎn)業(yè)政策是否協(xié)調(diào)？是否標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行單位或人員是否按照標(biāo)準(zhǔn)要求組織開展相關(guān)工作？是否實施信息標(biāo)準(zhǔn)實施過程中是否存在阻力和障礙？是否實施過程中存在的主要問題修改意見適用口修改