布魯克液質(zhì)聯(lián)用操作規(guī)程

布魯克液質(zhì)聯(lián)用儀操作規(guī)程

1操作前檢查

1.1檢查液氮罐和高純氮的出口壓力，保證在正常范圍

1.2檢查洗針溶液和流動相

1.3流動相須現(xiàn)配并超聲，緩沖鹽溶液過0.22um微孔濾膜（或者使用色

譜純的鹽溶液和酸溶液）

1.4如使用溶融石英進樣管，操作前應檢查石英管是否拉長，確保其未超

出ESI探針尖端。

1.5檢查系統(tǒng)真空度，電離真空計讀數(shù)（分析儀區(qū)域）應小于SXlO'Torr。

1.6檢查廢液液位，及時清空廢液。

1.7檢查液氮罐和氨氣鋼瓶是否有一定壓力，以便為測試樣品提供符合流

速和壓力要求的氮氣（噴霧氣體和干燥氣體）和氮氣（碰撞氣體）。

2操作步驟及注意事項

1.檢查并打開干燥氣（Drygas）和霧化氣（NebulizerGas）所需的氮氣

源；

1）如配備液氮罐，則需打開增壓閥及供氣閥閥門，使罐體壓力保持在100

psi以上，并調(diào)節(jié)減壓閥出氣口壓力至0.6Mpa；

2）如配備氮氣發(fā)生器，則提前半小時打開氮氣發(fā)生器電源，以便使氮氣能

夠達到99.99%以上的純度，再調(diào)節(jié)氮氣流量至20L/min；

2.檢查并打開碰撞氣（CollisionGas）高純氮氣M或高純氨氣Ar鋼瓶（純

度要求99.999%）,并調(diào)節(jié)減壓閥出氣口壓力至0.4Mpa；

3.檢查機械泵泵油的水平線，需在小窗口的1/2?2/3之間；

4.打開計算機，顯示器電源；

5.打開質(zhì)譜儀主機電源（儀器左側(cè)最下方）;

6.啟動micrOTOFcontrol控制軟件，務必保持儀器一直處在shutdown狀

態(tài)，待真空度達到W1X10e-6mbar后，才可切換至standby狀態(tài)待機；為

了保證良好穩(wěn)定的實驗結(jié)果，待真空度下降至10e-7mbar以下后，再

operate儀器開始測試。

2.2新建液相方法

打開hystar軟件，選擇method,然后輸入新建方法的名字，點擊open,

開始方法的新建。在彈出的對話框中選擇edit,然后點擊“wizard”進行

設置。液相方法包括梯度、流速、柱溫、樣品盤溫度、時間、進樣針吸樣

速度等，可依次設置即可，全部設置好之后，將。

BmkerDaltonacs

?hystar

z

U

一

一

一

言

三

g笑

2.3新建質(zhì)譜方法

方法一：

在otofcontrol中，打開method,按照自己待檢測物的分子量范圍及正負

偏向性選擇合適的質(zhì)譜方法，小分子有對應的smallmolecular方法，蛋

白質(zhì)組有專門的proteomics方法。

方法二（非專業(yè)人員不推薦）：

在otofcontrol中，打開method,選擇new,即可新建質(zhì)譜方法?？梢孕?/p>

改的參數(shù)包括以下幾個方面：

(1)mode中的Focus為active,linespectracalculation為usesum

intensity,ionpolarity為pos或neg,massrange調(diào)到待檢測物合適

的分子量范圍。

(2)source中capillarypos：4500V,neg：3500oDivertvalve：sourcel-2

進質(zhì)譜；source1-6為discardtofluid

(3)Tune中collisionRF小分子調(diào)到1000-1500,大分子調(diào)到2000-2500；

lowmass視目標物分子量大小截留(例如目標分子為500,可調(diào)為300,去

掉小分子區(qū)域的雜峰)。

(4)MS/MS中如果想檢測二級，可以勾選autoMS/MS；precursorions中

cycletime正常下為3s

(5)chromatogram中選擇BPC

根據(jù)待檢測物的分子量大小和正負偏向性，先在軟件自帶的質(zhì)譜方法中選

擇相應的方法，再在此方法的基礎上進行優(yōu)化及分段(如含鹽的樣品截掉

前2~5分鐘，1-6waste)o

儀器在操作狀態(tài)下〈Operation》穩(wěn)定20-30分鐘后即可開始儀器質(zhì)量準

確度校正。

2.4儀器質(zhì)量準確度校正

2.2.1.藥物和酶解多肽樣品，選用甲酸鈉溶液作為校正標準液。覆蓋質(zhì)量

范圍m/z90-1200；校正模式選用<EnhancedQuadratic)。

2.2.2.蛋白質(zhì)類樣品選用三氟乙酸鈉溶液作為校正標準液。覆蓋質(zhì)量范圍

m/z200-2000；校正模式選用(Quadratic》。

2.2.3.校正液配制

甲酸鈉校正液：

溶劑：異丙醇：水溶液=1：1并含有0.2%甲酸

lOmM甲酸鈉校正液：1mlIMNaOH+99ml溶劑

三氟乙酸鈉校正液：

溶劑：50%乙氟含有0.1%三氟乙酸鈉（TFA）

2.2.3.<Calibration>校正界面

3.測樣方式

3.1直接進樣測定

對于標準品或相對較純或混合組分較少并且不含鹽的藥物樣品，如果僅需

要進行鑒定，可以采用直接進樣方法測定。

3.1.1樣品用標準溶劑（50%H20,50%乙脯或甲醇，0.1%甲酸）溶解或稀釋

3.1.2將配好的樣品或標準品吸入進樣器（針），將進樣器（針）放置于進

樣泵中。注意：進樣器（針）內(nèi)不能有氣泡

3.1.3將進樣器（針）直接與離子源連接（如圖）

E團

I]--------D

注意毛細管與注射器之間需緊密連接。進樣器內(nèi)不能有氣泡

3.1.4設置進樣泵的流速為120?180微升/小時。

3.2液質(zhì)聯(lián)用（LC/MS）測定樣品

采用常規(guī)液相色譜系統(tǒng)（色譜柱2.1x150mm；流速200-300uL/min）o啟

動Hystar軟件，打開hystar軟件，在sampletable中選擇相應的文件并

打開，然后復制一個之前做過的樣品，對復制后的新的一行進行文件名，

存儲路徑和液相質(zhì)譜方法的修改（改完之后再檢查一遍）。

注：如果是新建sampletable,可以打開一個新的復制一行粘貼到新建里,

因為新建的自動進樣的不對。

樣品表編輯界面-General-gg-

E.]V7.5A<*?<?；3f?I?：gI??>—tWJ:i"

Q<i>cnmcmn

0.

Q'<3

S'?3fl?

H-?

066

BrukerDaltonics

樣品表編輯界面?Methods

G?aw>l|B?tkod?|AMF?rw??t?riI|Pret?in?e*?*|

Si?>d?dPMhDAMe<h<xfc

＞對每個樣品，可分別調(diào)用不同的液相方法、質(zhì)譜方法、數(shù)據(jù)處理方法等等I

＞建議不同硬件的方法，如液相方法、質(zhì)譜方法等，分別保存在不同的路徑下；

A可以將所有方法合并保存，生成Supermethod,即第二步中可調(diào)用的方法；

A質(zhì)譜方法的編輯在micrOTOFcontrol中，編輯好后保存為質(zhì)譜方法文件，hystar中

只能調(diào)用文件；

BrukerDaltonics

系統(tǒng)控制和狀態(tài)區(qū)

|SHyStaf(AcquHitlon100811.xml|

-a￡*?HosMeSpbonsfotnpat,tfrxfow*|p

PlnvAov?|tnMtam)0500PkMopteu|b?)乃Irvtctan1o<1Ipanel,I

233PoHionR011---------------------1

XA000v?nl?mp[T|

T(nr5G010005OnVoknwM5000

」sfa0nzip溫2Sgg1gm.

氣A'■L"；回Z21c密飛嘉當前樣品信息

\＞分模塊顯示，液相系統(tǒng)（泵、進樣器、柱溫箱、檢測器等），質(zhì)譜系統(tǒng)等；

\＞對于Agilent液相，控制命令在相應模塊的右鍵菜單中；

\》對于Diorwx液相和Waters,可進入其自身的控制軟件界面；

\“液相控制和操作請參考液相系統(tǒng)說明書；

hystar狀態(tài)區(qū)顯示為綠色時，表示所有系統(tǒng)準備就緒，可開始采集數(shù)據(jù)：

〃點擊“start”開始數(shù)據(jù)采集

BrukerDaltonics

數(shù)據(jù)采集■詔

使用批量采集可更靈活、方便的添加或刪除樣品

BrukerDaltonks

采集結(jié)束后的系統(tǒng)設置?ggm

BrukerDahonic*

4.輸入下列參考參數(shù)

4.1.直接進樣：（低流速）大約在120-180微升/小時

離子源：Nebulizer0.4bar

DryGas4.0L/min

DryTemp180℃

4.2.藥物小分子樣品液質(zhì)聯(lián)用：平均流速大約在200-300uL/min

離子源：Nebulizer0.8bar

DryGas6-8L/min

DryTemp180℃

4.3.酶解多肽樣品液質(zhì)聯(lián)用：平均流速大約在200-300nL/min

離子源：DryGas3.0L/min

DryTemp160℃

5.手動獲得一個MS/MS圖譜

打開MS/MS界面，選擇MRM-＞輸入〈ParentCondition》列表，激活Scan

Mode0

6.后期處理

6.1打開分析文件

6.1.1.在任務欄中或者在工具欄中選擇按鈕均可切換到數(shù)據(jù)分析程序

(DataAnalysis),讀取所獲得的數(shù)據(jù)文件

6.1.2.讀取數(shù)據(jù)文件被可選擇File菜單下的open對話框，所需要的

顯示窗口將被程序自動打開。

6.1.3.在文件對話框中選擇目錄d:\data\start用鼠標鍵雙擊

testOOOO.d,testOOOl.d,test0002.d來打開數(shù)據(jù)文件；按住shift鍵

來標記所有文件并點擊回車鍵來一次全部打開所選文件。

6.1.4.質(zhì)譜圖與色譜圖按文件名讀取并顯示在File菜單下。在分析清單

窗口下選擇所需的文件，選擇后圖譜在各自的窗口下顯示。

6.2質(zhì)譜圖

6.2.1.在分析清單窗口下選擇的結(jié)果在質(zhì)譜圖窗口顯示。

6.2.2.通過Masslist參數(shù)對話框改變離子檢測參數(shù)

6.2.3.下列對話框被用來在圖譜中設置新的離子檢測參數(shù)

6.2.4.對下一步的Method參數(shù)設置參見BrukeDaltonics

DataAnalysisReferenceManual

ModifiedProcessingModule.m-MethodParameters囚

|OK|Abbtechen|U.emehmen|

6.3色譜數(shù)據(jù)

6.3.1.完整色譜圖

1.讀取數(shù)據(jù)文件(e.g.testOOOl.d),顯示TIC(TotalIon

Chromatogram)

2.讀取某一個離子的色譜數(shù)據(jù)可以打開EditChromatogramTraces對話

框

3.通過Edit菜單下選擇Chromatogram選項來打開Traces對話框

如下圖所示，選擇質(zhì)荷比為622的離子。

6.3.2.獲得各組分的質(zhì)譜圖(Compoundspectra)

使用Find->Compound功能鍵，快速有效的產(chǎn)生各組分的質(zhì)譜圖；

1)功能鍵〈Compounds-Chromatogram》產(chǎn)生色譜分離過程中所有組分的

質(zhì)

譜圖。打開CompoundSpectra窗口時，可以看到各組分的質(zhì)譜圖。

2)功能鍵〈Compounds-MS(n)>產(chǎn)生所有采用MS(n)步驟采集的圖譜。

3)<Compounds-AutoMS(n)>產(chǎn)生MS-和MS/MS圖

7.報告

有幾種可用的報告形式來輸出數(shù)據(jù)，一種報告僅有質(zhì)譜圖，另一種報告則

只有色

譜圖，還有一種兩種圖譜都保留。

7.1.直接打印：打印鍵；或者打開File菜單，選擇Print；或者通過

打印

預覽打印，選擇打印預覽鍵或在File菜單選擇PrintPreview,然后在

打印預

覽窗口下選擇打印鍵

7.1.1報告內(nèi)容下拉菜單包含了所有可選的報告內(nèi)容

7.1.2.獲得參數(shù)報告

選擇此內(nèi)容的報告中包含了獲得所選分析結(jié)果的參數(shù)

7.1.3.顯示報告

選擇此內(nèi)容將完全按照顯示窗口打?。òㄉV窗口、質(zhì)譜顯示窗口、混

合

物質(zhì)譜窗口、質(zhì)譜窗口）

7.2質(zhì)譜圖

報告內(nèi)容中幾種可選的質(zhì)譜圖形式

7.2.1.質(zhì)譜清單報告

報告中含所選的質(zhì)譜圖的peak清單

7.2.2.質(zhì)譜圖報告

報告中含所選的質(zhì)譜圖報告

7.3色譜圖

報告內(nèi)容中幾種可選的色譜圖形式

7.3.1色譜清單報告

報告中含所選的色譜圖的色譜峰清單

7.3.2色譜圖報告

報告中含所選質(zhì)譜圖的報告

7.3.3混合質(zhì)譜圖報告

報告中含所選色譜圖的混合質(zhì)譜報告

BIDivertValve廢液模式（不含定量環(huán)）

Divertvalveinsourceposition:

,green(HPLC)toyellow(nebulizer).

?blue(calibrant)vialooptogray(waste).

Divertvalveinwasteposition:

?green(HPLC)isconnectedtogrey

(waste)->HPLCflowisnotconnectedto

source(thisisusefulforflushingHPLCor

column.

?blue(calibrant)isconnectedtoyellow

(nebulizer).

Conclusion:

?noconstantflow,flowrateisdependentonvalveposition

(HPLCflow<->syringeflow).

?calibrationcanbedoneinmicrOTOFcontrolsoftwareorinpostprocessing

software.

?valvecanbeusedforswitchingHPLCflowdirectlytowaste.

?syringepumpcanbeusedforinfusions.

BRUKER.

IMOITTOFSmIraiMtfUALFGNSOS

RIWNHVI00nEna&gUfaScienceTootaBasedonMassSpeclrwnatry?

多級質(zhì)譜：AutoMS/MS適用于定性?喧

，AutoMS/MS頁面可定義自動二級質(zhì)譜相關(guān)的數(shù)據(jù)采集策略;

＞SmartExclusion會自動排除強度不變的背景?

＞動態(tài)排除是增加數(shù)據(jù)量；

＞根據(jù)實際背景離子添加相應的排除離子；

＞根據(jù)實際背景（基線）確定絕對信號強度的閾值。