從男性尿液中提取尿激酶并進(jìn)行活性測定實(shí)驗(yàn)報(bào)告

PAGE“設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)”項(xiàng)目申請書項(xiàng)目名稱從男性尿液中提取尿激酶并進(jìn)行活性測定項(xiàng)目負(fù)責(zé)人申卓凡年級、專業(yè)2014級唐敖慶班化學(xué)方向聯(lián)系電子郵件shenzhuofan01@填表日期2016年月日國家級生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心制表填表說明1、本申請書適用于各門實(shí)驗(yàn)課程的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。2、《設(shè)計(jì)性項(xiàng)目申請書》要按順序逐項(xiàng)填寫。填寫內(nèi)容要實(shí)事求是，講究誠信，不能有雷同；表達(dá)要明確、嚴(yán)謹(jǐn)?？杖表?xiàng)要填“無”。3、格式要求：（1）一律用A4紙打印，于左側(cè)裝訂成冊。（2）字體：中文用宋體，英文和數(shù)字用Times

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Roman字體，行距為1.5倍行距。（2）一級標(biāo)題：標(biāo)題編排應(yīng)采用“（一）、（二）、（三）”等依次分級編號，左起縮進(jìn)2字符，宋體加黑，字號為小四號。（3）二級標(biāo)題：標(biāo)題編排應(yīng)采用“1、2、3、”等依次分級編號，左起縮進(jìn)2字符，宋體加黑，字號為五號。（4）內(nèi)容：字號為五號，每段第一行左起縮進(jìn)2字符。4、“設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)”項(xiàng)目每人填寫一項(xiàng)。5、參考文獻(xiàn)按照國家標(biāo)準(zhǔn)《文后參考文獻(xiàn)著錄規(guī)則》(GB7714-87)要求書寫。6、本《申請書》各頁不夠可自行加頁項(xiàng)目名稱從男性尿液中提取尿激酶并進(jìn)行活性測定經(jīng)費(fèi)5000（元）起止時(shí)間2016年6月至2016年8月負(fù)責(zé)人學(xué)號姓名年級專業(yè)聯(lián)系電話E-mail12140916申卓凡2014級唐敖慶班化學(xué)方henzhuofan01@163.com一、立項(xiàng)背景和依據(jù)（一）研究目的尿激酶（簡稱UK）是一種從人尿中提取的藥物，在臨床上被用于溶栓劑，預(yù)防和控制心肌梗死、高血壓、動(dòng)脈硬化等；具有抗肺癌轉(zhuǎn)移作用，可用于治療癌癥；能降低精液黏稠度，促使精子和卵子結(jié)合受孕。UK通常從健康新鮮尿液中分離得到，該法因原料易得、價(jià)錢便宜而被廣泛應(yīng)用。由于UK有著重要的醫(yī)療價(jià)值，所以許多研究報(bào)導(dǎo)了各種從尿液中分離、提純尿激酶的方法。但這些方法都面臨著兩個(gè)方面的問題：第一，提取和純化的收率要高，盡可能保留酶的總活力；第二，精制后產(chǎn)品的比活要達(dá)到一定的高度。本項(xiàng)目研究的目的就是為了提高分離和提純的效率。（二）國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析對于提取、純化尿激酶的方法，國內(nèi)外已有許多報(bào)導(dǎo)。目前，從已發(fā)表的文章和專利來看，從尿液中分離、提純尿激酶主要有這些思路：①發(fā)泡法：向尿液通氣發(fā)泡，收集泡沫，滴加消泡劑使泡沫液化，使尿液得以濃縮，加入沉淀劑使尿激酶沉淀得到粗品；②沉淀法：在尿液中加入沉淀劑，使尿激酶沉淀得粗品；③吸附法：采用最多的方法。選擇適當(dāng)?shù)奈絼┻x擇性吸附尿激酶，然后將其洗脫得尿激酶粗品。常用的吸附劑有硅膠、樹脂等；④離子交換法；⑤超濾法。（三）研究意義因人尿中尿激酶的含量很低，取得尿激酶的關(guān)鍵在于如何從大量的尿液中富集尿激酶。從上世紀(jì)70年代至今，國內(nèi)對尿激酶的提取工藝一直不盡人意。國內(nèi)生產(chǎn)的尿激酶粗品僅有一部分制成精品，不少粗品直接出口由外商加工精制銷售賺取利潤。對尿激酶純化技術(shù)進(jìn)行研究，利國利民，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。（四）主要參考文獻(xiàn)[1]生物化學(xué)教研室尿激酶組.尿激酶(人尿)的分離與精制——(Ⅰ)尿激酶的分離[J].吉林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),1979(2).[2]劉蘭英,孫中武,尹洪濱,等.以732陽離子交換樹脂為吸附劑分離尿激酶的研究[J].吉林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),1981(4).[3]趙新燕,劉艷.尿激酶的分離與純化研究[J].現(xiàn)代制造,2013(5):21-24.[4]祝一鋒,蔡志亮,趙忠睦,等.尿激酶精制新工藝[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998(1):63-66.[5]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].二部.2015年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:532-533.[6]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].四部.2015年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:96-97.二、項(xiàng)目研究內(nèi)容（一）項(xiàng)目主要研究內(nèi)容該項(xiàng)目主要設(shè)計(jì)了一套從新鮮男性尿液中提取、純化尿激酶并進(jìn)行酶活力測定的實(shí)驗(yàn)方案。（二）擬解決的關(guān)鍵問題1、提取和純化的收率問題人尿中尿激酶的含量很低，取得尿激酶的關(guān)鍵在于如何從大量的尿液中高收率地富集尿激酶。純化尿激酶的各步驟中，如何在提高比活倍數(shù)的同時(shí)盡量保存尿激酶的總活力也是一個(gè)關(guān)鍵問題。2、精制粗品時(shí)提高比活的問題精制后產(chǎn)品的比活要達(dá)到一定的高度，藥用尿激酶要求達(dá)到臨床上“安全有效”的純度。（三）創(chuàng)新點(diǎn)1、高效本項(xiàng)目提供了與其他方案相比更加高效的一系列從尿液中分離、純化尿激酶的實(shí)驗(yàn)方法。以732陽離子交換樹脂作為尿激酶吸附劑，比其他傳統(tǒng)方法提取收率高約10%。2、低成本本實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)較為科學(xué)，在保證效果的前提下，通過不同試劑使用量及其效果的對比，能做到盡量節(jié)約。且沒有用到不必要的昂貴設(shè)備。3、較為簡便本實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)盡量減少了繁瑣無必要的操作步驟，以求快速高效。三、項(xiàng)目實(shí)施方案（一）研究思路由于報(bào)道的現(xiàn)有許多種分離、提純方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，所以計(jì)劃采取文獻(xiàn)中記載的各種路線的不同可取部分來綜合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。（二）技術(shù)路線1、從尿液中分離尿激酶的路線2、提純尿激酶粗品的路線（三）研究方法擬通過樹脂吸附法從新鮮尿液中提取粗品尿激酶，再通過一系列凝膠層析和離子交換層析精制純化尿激酶粗品。同時(shí)每一步操作得到的樣品都用發(fā)泡法測定酶活力（IU/mL或IU/mg）。最后用Folin-酚法測定精制后尿激酶粉末的蛋白質(zhì)含量，換算出比活（IU/mg）。（四）實(shí)施計(jì)劃1、從尿液中分離尿激酶粗品①堿化除沉淀將新鮮男性尿液用5mol/LNaOH溶液調(diào)至pH值為9.0，靜置1小時(shí)，虹吸上清液，棄去灰白色的沉淀。②732陽離子交換樹脂樹脂吸附尿激酶將虹吸的上清液用5mol/L鹽酸調(diào)到pH值為5.3—5.5，加3%（W/V）732樹脂，攪拌吸附1.5小時(shí)。停止攪拌后，樹脂自然下沉。虹吸去掉殘余尿液，收集吸附有UK的樹脂。③洗滌用0.1mol/L，pH值5.5的磷酸緩沖液（體積為上清液的10%），攪拌洗滌0.5小時(shí)。虹吸去上清液。再以0.1mol/L、pH值6.4的磷酸緩沖液攪拌洗滌0.5小時(shí)。虹吸去上清液，收集樹脂。④洗脫第一次洗脫：用2%氨水（用量為pH9.0的上清液的3.5%）攪拌洗脫1.5小時(shí)。第二次洗脫：以同樣量的洗脫液攪拌洗脫0.5小時(shí)，抽濾收集洗脫液。合并兩次洗脫液，測量其體積。⑤硫酸銨沉淀按洗脫液體積加入固體硫酸銨，不斷攪拌使其溶解，并使其飽和度達(dá)65%。用5mol/L鹽酸調(diào)到pH值為8.6。于0—-2℃下沉淀8小時(shí)。冷凍離心收集棕色的尿激酶粗品沉淀。2、尿激酶的精制①SephadexG-50凝膠過濾除鹽將UK粗品用預(yù)冷至0一5℃的無熱原蒸餾水溶解，制成UK含量為(2—3)*104IU/mL的UK水溶液，立即用冷凍離心機(jī)分離，收集上清液，用2mol/L鹽酸或2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.5。將此溶液上SephadexG-50凝膠柱（此柱預(yù)先用pH6.5，0.1mol/L的磷酸鈉緩沖液平衡），上樣體積控制在柱床體積的15%—25%，收集流出液中含UK的部分。②CM-SephadexC-50離子交換層析預(yù)先用pH6.5，0.1mol/L的磷酸鈉緩沖液平衡CM-SephadexC-50離子交換層析柱。將上一步收集到的UK溶液上平衡過的離子交換層析柱，加1個(gè)床體積的柱平衡液洗滌后，用0.6mol/L的氯化鈉溶液洗脫，收集UK活力部分。③硫酸鈉沉淀在上一步收集的UK溶液中緩緩加人固體硫酸鈉（430g/L），邊加邊攪拌，直至加入的硫酸鈉溶解，立即用冷凍離心機(jī)分離，收集UK沉淀物。④Bio-GelP–30凝膠過濾將上一步收集的UK沉淀物用0—5℃的無熱原蒸餾水溶解，制成UK含量為(5—10)*104IU/mL的溶液，上Bio-GelP–30凝膠柱（此柱預(yù)先用0.3mol/L的氯化鈉溶液平衡），上樣量控制在柱床體積的8%—12%，隨時(shí)監(jiān)測流出液的UK活力，收集第一個(gè)流出峰部分，即H-UK部分。⑤產(chǎn)品的除菌及冷凍干燥將上述工序收集的H-UK溶液添加1%—5%的甘露醇作賦形劑（加量多少依產(chǎn)品效價(jià)要求和冷凍干燥情況而定），用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后，立即進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥后的UK為粉狀產(chǎn)品，密封于容器內(nèi)，置0—5℃下保存。3、尿激酶的活性測定（氣泡法）①試劑的配制牛纖維蛋白原溶液：取牛纖維蛋白原，加巴比妥-氯化鈉緩沖液（pH7.8）溶解并稀釋制成每1mL中含6.67mg可凝結(jié)蛋白的溶液。牛凝血酶溶液：取牛凝血酶，加巴比妥-氯化鈉緩沖液（pH7.8）溶解并稀釋制成每1mL中含6.0單位的溶液。牛纖維蛋白溶酶原溶液：取牛纖維蛋白溶酶原，加三羥甲基氨基甲烷緩沖液（pH9.0）溶解并稀釋制成每1mL中含1—1.4酪蛋白單位的溶液（如溶液渾濁，離心，取上清液備用）?；旌先芤号R用前取等體積的牛凝血酶溶液和牛纖維蛋白溶酶原溶液，混勻。②UK標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取UK標(biāo)準(zhǔn)品，加巴比妥-氯化鈉緩沖液（pH7.8）溶解并定量稀釋制成每1mL中含60單位的溶液。③UK供試品溶液的制備取前面步驟得到的尿激酶樣品適量，精密稱定，加巴比妥-氯化鈉緩沖液（pH7.8）溶解并定量稀釋制成與標(biāo)準(zhǔn)品溶液相同濃度的溶液，搖勻。④測定法取試管4支，各加牛纖維蛋白原溶液0.3mL，置于37℃±0.5℃水浴中，分別加巴比妥-氯化鈉緩沖液（pH7.8）0.9mL、0.8mL、0.7mL、0.6mL，依次加標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.lmL、0.2mL、0.3mL、0.4mL，再分別加混合溶液0.4mL，立即搖勻，分別計(jì)時(shí)。反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)在30—40秒內(nèi)凝結(jié)，當(dāng)凝塊內(nèi)小氣泡上升到反應(yīng)系統(tǒng)體積一半時(shí)作為反應(yīng)終點(diǎn)，立即計(jì)時(shí)。每個(gè)濃度測3次，求平均值（3次測定中最大值與最小值的差不得超過平均值的10%）。以尿激酶濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)間的對數(shù)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。供試品按上法測定，用線性回歸方程求得供試品溶液濃度，計(jì)算每1mg供試品的酶活力（單位）。⑤空白實(shí)驗(yàn)以0.9%氯化鈉溶液作空白液，同上述方法操作（試劑的配制同上述酶活力測定步驟）。4、尿激酶中蛋白含量的測定（Folin-酚法）①Folin試液的配制取氫氧化鈉10g，碳酸鈉50g，加水400mL使溶解，作為甲液。取酒石酸鉀0.5g，加水50mL使溶解；另取硫酸銅0.25g，加水30mL使溶解，將兩液混合作為乙液。②對照品溶液的制備取牛血清白蛋白對照品，加水溶解并制成每1mL中含0.2mg蛋白的溶液。③UK供試品溶液的制備精密稱量經(jīng)上述步驟提取、精制的尿激酶粉末約10mg，用0.9%氯化鈉溶液定量稀釋，制成每1mL中蛋白質(zhì)含量約0.2mg的溶液。④繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線精密量取對照品溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分別置具塞試管中，各加水至1.0mL，再分別加入Folin甲試液1.0mL，搖勻，室溫放置10分鐘。各加入Folin乙試液4.0mL，立即混勻，室溫放置0.5小時(shí)，照紫外-可見分光光度法，在650nm波長處測定吸光度，同時(shí)以0號管作為空白。以蛋白質(zhì)含量與其相對應(yīng)的吸光度計(jì)算線性回歸方程。⑤測定法精密量取供試品UK溶液適量，依照相同方法測定。從線性回歸方程計(jì)算UK供試品溶液中的蛋白質(zhì)含量并乘以體積倍數(shù)，即得10mg尿激酶粉末中的蛋白質(zhì)含量。由3和4的結(jié)果可以計(jì)算所得尿激酶蛋白質(zhì)的比活，即每1mg蛋白質(zhì)中所含的酶活力單位數(shù)，單位是IU/mg。（五）預(yù)期結(jié)果用732陽離子交換樹脂從尿液中吸附尿激酶，預(yù)期平均收率約為70%-80%，比活為600-800CTA/mg尿激酶粗品；依2中的步驟純化尿激酶，預(yù)期平均總收率為60%左右，比活提高總倍數(shù)能穩(wěn)定在50倍以上，這些結(jié)果說明該實(shí)驗(yàn)方案的可行性較高。用氣泡法測定尿激酶的活性時(shí)，混合液搖勻計(jì)時(shí)后預(yù)期應(yīng)在30-45秒內(nèi)凝結(jié)，且凝塊在15分鐘內(nèi)重新溶解。以0.9%氯化鈉溶液作空白，同法操作時(shí)，凝塊在2小時(shí)內(nèi)不溶。尿激酶樣品的活性、蛋白含量、比活取決于實(shí)驗(yàn)具體操作情況。四、擬利用資源（一）儀器設(shè)備冷凍離心機(jī)，層析柱，0.22μm微孔濾膜，恒流泵，紫外檢測儀，恒溫水浴鍋，紫外-可見分光光度計(jì)。（二）實(shí)驗(yàn)材料新鮮尿液，蒸餾水，732樹脂（100—220目），5mol/LNaOH溶液，5mol/L鹽酸，0.1mol/LpH5.5磷酸緩沖液，0.1mol/LpH6.5磷酸緩沖液，2%氨水，硫酸銨，2mol/L鹽酸，2mol/LNaOH溶液，SephadexG-50凝膠，CM-SephadexC-50離子交換樹脂，0.6mol/LNaCl溶液，Bio-GelP–30凝膠，0.3mol/LNaCl溶液，甘露醇，牛纖維蛋白原，牛凝血酶，牛纖維蛋白溶酶原，pH7.8巴比妥-氯化鈉緩沖液，尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品，pH9.0三羥甲基氨基甲烷緩沖液，0.9%氯化鈉溶液，F(xiàn)olin甲、乙試液，牛血清白蛋白。五、教師評語與成績實(shí)驗(yàn)成績：指導(dǎo)教師（簽名）：