香型粳稻分子育種技術(shù)規(guī)程（征求意見(jiàn)稿）

ICS點(diǎn)擊此處添加ICS號(hào)CCS點(diǎn)擊此處添加CCS號(hào)21TechnicalRegulationforMolecularBreedingofAromaticJaponicaRice在提交反饋意見(jiàn)時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專(zhuān)利連同支持性文件一并附上。IDBXX/TXXXX—XXXXDBXX/TXXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：遼寧省水稻研究所本文件主要起草人：呂軍、李建國(guó)、姜秀英、解文孝、潘爭(zhēng)艷、韓勇、王之旭、張悅。本文件發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問(wèn)題和意見(jiàn)建議，均可以通過(guò)來(lái)電和來(lái)函等方式進(jìn)行反饋，我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。歸口管理部門(mén)通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（遼寧省沈陽(yáng)市和平區(qū)太原北街2號(hào)），郵編：110001，聯(lián)系電話標(biāo)準(zhǔn)起草單位通訊地址：遼寧省水稻研究所（遼寧省沈陽(yáng)市蘇家屯區(qū)楓楊路129號(hào)郵編：110101，聯(lián)系電話DBXX/TXXXX—XXXX4DBXX/TXXXX—XXXX香型粳稻分子育種技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了香型粳稻分子育種前的準(zhǔn)備和育種程序等。本文件適用于粳稻品種中香味品質(zhì)的改良及攜帶香味基因Badh2的香稻品種的分子標(biāo)記輔助育種。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T15682大米食用品質(zhì)感官評(píng)價(jià)方法GB/T19495.1轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)通用要求和定義GB/T19495.3轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法NY/T83米質(zhì)測(cè)定方法NY/T593食用稻品種品質(zhì)NY/T596香稻米DB21/T3079優(yōu)良食味水稻品種（品系）選育技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)3.1術(shù)語(yǔ)和定義GB/T19495.1界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1.1分子育種molecularbreeding指通過(guò)分子技術(shù)對(duì)育種的目標(biāo)基因和目標(biāo)性狀進(jìn)行轉(zhuǎn)移和選擇，進(jìn)而培育出優(yōu)良的新品種。3.1.2純合個(gè)體Homozygousindividual指同源染色體在同一基因座上的兩個(gè)等位基因相同的基因型個(gè)體，自交后代不會(huì)分離。3.1.3雜合個(gè)體heterozygousindividual指同源染色體在同一基因座上的兩個(gè)等位基因不同的基因型個(gè)體，自交后代產(chǎn)生分離。3.1.4輪回親本recurrentparent指回交育種中用于多次回交的親本。3.1.5供體親本donorparent5DBXX/TXXXX—XXXX指回交育種中提供目標(biāo)性狀的親本。3.2縮略語(yǔ)Badh2：香味基因（betainealdehydedehydrogenaseaDNA：脫氧核糖核酸(deoxyribonuclcicacid)；PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerasechainreaction)；bp：堿基對(duì)(basepair)；4準(zhǔn)備4.1設(shè)備、試劑和材料樣品DNA提取所需設(shè)備、試劑和材料的準(zhǔn)備按GB/T19495.3的規(guī)定執(zhí)行。PCR檢測(cè)所需設(shè)備、試劑和材料的準(zhǔn)備見(jiàn)本文件的附錄A。4.2引物同時(shí)使用4條PCR引物，兩條3’末端位于突變位點(diǎn)上的分屬不同基因型的方向相反的內(nèi)引物（引物2和引物3），兩條位于突變位點(diǎn)外側(cè)并與突變位點(diǎn)距離不等的外引物（引物1和引物4）。內(nèi)引物用來(lái)檢測(cè)等位基因型，外引物在PCR反應(yīng)中不但作為陽(yáng)性參照而且和內(nèi)引物分別配對(duì)有選擇性地?cái)U(kuò)增，通過(guò)擴(kuò)增片段大小和有無(wú)即可判斷個(gè)體的基因型。引物信息見(jiàn)附錄B。5育種程序5.1技術(shù)路線技術(shù)路線圖見(jiàn)附錄C。5.2親本選擇5.2.1輪回親本選擇當(dāng)?shù)刎S產(chǎn)性好、抗病性強(qiáng)、抗倒伏、米質(zhì)優(yōu)、綜合性狀較好的品種作為輪回親本（P1)。5.2.2供體親本選擇含有香味基因Badh2的香型優(yōu)質(zhì)水稻品種作為供體親本(P2)。5.3雜交以P1為母本，以P2為父本，去雄授粉按照DB21/T3079規(guī)定執(zhí)行，成熟后雜交粒全部收獲，脫粒、記錄、保存，獲F1代種子。5.4回交6DBXX/TXXXX—XXXX以P1為母本，以F1為父本，人工授粉回交，獲BC1F1代種子。5.5BC1F1香味基因Badh2雜合個(gè)體篩選BC1F1一般種植10株以上，單株栽插。5.5.1采樣待植株長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，按單株采取葉片進(jìn)行樣品制備，樣品編號(hào)要與田間單株一一對(duì)應(yīng)。5.5.2DNA提取與純化按照按GB/T19495.3的規(guī)定執(zhí)行。5.5.3PCR擴(kuò)增具體檢測(cè)方法見(jiàn)附錄D。5.5.4分型與結(jié)果判讀電泳圖中擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為499bp和171bp，判定該品種為香型純合體；擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為499bp和364bp，則判定該品種為非香型純合體；擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為499bp、364bp和171bp，則判定該品種為香型雜合體。5.5.5篩選根據(jù)電泳圖中顯示擴(kuò)增結(jié)果，篩選香味基因Badh2的雜合個(gè)體。5.6BC1F1回交以P1為母本，以5.5收獲的香型雜合個(gè)體為父本，回交，獲BC2F1代種子。5.7BC2F1自交BC2F1一般種植10株以上，單株栽插，自交，混收，獲BC2F2代種子。5.8BC2F2群體中香味基因純合個(gè)體篩選BC2F2一般種植1000株左右，單株栽插，按照5.5中方法采樣、提取DNA、PCR擴(kuò)增、判讀結(jié)果，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)篩選香味基因Badh2的純合個(gè)體，分單株收獲種子形成株系。5.9常規(guī)系選分株系種植BC2F3代，自交獲得BC2F4代，篩選株高、穗型整齊，抽穗期一致，抗性好的株系。5.10米質(zhì)鑒定、抗病鑒定按NY/T83米質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定米質(zhì)性狀，利用谷粒分析儀和食味分析儀測(cè)定樣品的食味值，按GB/T15682大米食用品質(zhì)感官評(píng)價(jià)方法，結(jié)合人工品嘗，確定食味品質(zhì)，按照NY/T596香稻米檢驗(yàn)方法，選擇香味綜合評(píng)分≥60，食味值≥75，粳稻品質(zhì)等級(jí)達(dá)到NY/T593規(guī)定的三等以上的優(yōu)良品系，在稻瘟病自然發(fā)病嚴(yán)重區(qū)進(jìn)行田間稻瘟病綜合抗性鑒定，篩選出優(yōu)質(zhì)抗病香型粳稻品系。7DBXX/TXXXX—XXXXPCR檢測(cè)所需要的設(shè)備、試劑的準(zhǔn)備A.1設(shè)備準(zhǔn)備A.1.1PCR儀。A.1.2凝膠成像系統(tǒng)。A.1.3瓊脂糖電泳槽及電泳儀等電泳裝置。A.1.4移液槍和吸頭（200μL和10μL）。A.2試劑和材料準(zhǔn)備A.2.12×TaqPCRMasterMix（包含TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mgcl2、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)的增強(qiáng)劑和優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑，濃度為2×。DNA擴(kuò)增時(shí)，只需加入模板，引物和水，使MasterMix溶液的A.2.2DL2000（標(biāo)準(zhǔn)分子量的核酸標(biāo)記，可以清楚地區(qū)分100bp～1000bp的DNA片段）。A.2.31×TAE緩沖液（1X的電泳緩沖液）。A.2.4Goldenview（核酸染料）。8DBXX/TXXXX—XXXX擴(kuò)增香味基因Badh2的引物表B.1給出了用于本文件規(guī)定的擴(kuò)增香味基因Badh2的引物。表B.1擴(kuò)增香味基因Badh2的引物序列(5’-3’)TGTCATCACACCCTGGTGTAGACACCATAGGAGCAGCTGAAATATCTGGTAAAAAGATTATGGCTTCAGCTCAGTTAAGTGCTTTACAAAGTCCC9DBXX/TXXXX—XXXX香型粳稻分子育種技術(shù)路線圖C.1給出了用于本文件規(guī)定的香型粳稻分子育種技術(shù)路線P1×P2P1×F1P1×香味基因雜合的BC1F1個(gè)體↓↓?香味基因純合的個(gè)體↓?穩(wěn)定株系↓米質(zhì)鑒定、抗病鑒定優(yōu)良品系圖C.1香型粳稻分子育種技術(shù)路線注：圖中×表示雜交；?表示自交。DBXX/TXXXX—XXXX（規(guī)范性）PCR擴(kuò)增步驟D.1PCR反應(yīng)體系將試樣DNA、2×TaqPCRMasterMix、引物1、引物2、引物3、引物4及ddH2O置于冰上融化。在200μL加蓋無(wú)菌離心管中，加入：2×TaqPCRMasterMix10μL引物1(100nM)0.4μL引物2(100nM)1.6μL引物3(100nM)1.6μL引物4(100nM)0.4μL試樣DNA(50ng/μL)1μLddH2O5μL用移