人體肌肉干細(xì)胞分離制備規(guī)范（征求意見稿）

1T/XXXXXXX—XXXX人體肌肉干細(xì)胞分離制備規(guī)范本文件規(guī)定了人體肌肉干細(xì)胞的基本要求、樣本采集、樣本運(yùn)輸、樣本接收、分離與培養(yǎng)、記錄、質(zhì)量控制、質(zhì)量評(píng)價(jià)與放行。本文件適用于人體肌肉干細(xì)胞的分離制備與質(zhì)量控制。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T37864生物樣本庫(kù)質(zhì)量和能力通用要求GB50073潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范GB50346生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范GB50591潔凈室施工及驗(yàn)收規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義、縮略語(yǔ)3.1術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1.1人體肌肉干細(xì)胞humanmuscle-derivedstemcells從人體肌肉組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。3.1.2供者donor提供用于細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)用細(xì)胞的個(gè)體，可以是健康人，也可以是患者。3.1.3樣本specimen在特定時(shí)間從受試者或捐獻(xiàn)者中采集的器官、組織等標(biāo)本。3.1.4質(zhì)量控制qualitycontrol為達(dá)到臨床級(jí)人源干細(xì)胞入庫(kù)質(zhì)量要求所采取的操作技術(shù)和管理程序。3.1.5細(xì)胞活率cellviability能夠增值、保持正常代謝活性的細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比。3.1.6臺(tái)盼藍(lán)trypanblue細(xì)胞活性染料，常用于檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性，檢測(cè)細(xì)胞是否存活。注：活細(xì)胞因細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整會(huì)排斥臺(tái)盼藍(lán)，而喪失3.1.7放行檢驗(yàn)releasetesting在干細(xì)胞已完成質(zhì)量檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)每種類型的每批次干細(xì)胞，在凍存入庫(kù)及出庫(kù)前所進(jìn)行的相2T/XXXXXXX—XXXX對(duì)快速和簡(jiǎn)化的檢驗(yàn)。3.2縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。HAV：甲型肝炎病毒（HepatitisAVirus）HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV：人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HTLV：人類嗜T細(xì)胞病毒(HumanThymicLeukemiaVirus)EBV：人類皰疹病毒（Epstein-barrVirus）CMV：巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus）4基本要求4.1場(chǎng)地與設(shè)施人體肌肉干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)的場(chǎng)地和設(shè)施應(yīng)滿足以下要求：a)選址應(yīng)符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求，空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合GB3095標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)；b)實(shí)驗(yàn)室或廠房應(yīng)由具有潔凈實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建設(shè)資質(zhì)的工程公司設(shè)計(jì)與建造，并應(yīng)符合GB19489、GB50073、GB50346和GB50591的規(guī)定。建設(shè)完成后，各功能區(qū)域的潔凈級(jí)別應(yīng)由專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)并出具合格證明；c)各功能區(qū)應(yīng)按肌肉干細(xì)胞制備工藝進(jìn)行各區(qū)域設(shè)計(jì)，符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》的要求。d)應(yīng)配備獨(dú)立質(zhì)量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，并符合GB19489和GB50346的規(guī)定。4.2設(shè)備和耗材人體肌肉干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)的設(shè)備和耗材應(yīng)滿足以下要求：a)應(yīng)優(yōu)先選用符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，獲得國(guó)家資質(zhì)認(rèn)證的設(shè)備、儀器、耗材和試劑；b)應(yīng)對(duì)設(shè)備、儀器、耗材和試劑供應(yīng)商進(jìn)行資質(zhì)審核認(rèn)證，要求供應(yīng)商提供產(chǎn)品質(zhì)量報(bào)告和批次檢驗(yàn)報(bào)告，并對(duì)耗材及試劑進(jìn)行質(zhì)量抽檢，避免采購(gòu)質(zhì)量不合格的產(chǎn)品；c)設(shè)備和儀器正式使用前應(yīng)做安裝確認(rèn)(IQ)、運(yùn)行確認(rèn)（OQ）和性能確認(rèn)(PQ)，并定期進(jìn)行第三方校準(zhǔn)，不得使用有安全隱患的儀器操作樣本及細(xì)胞制品；d)應(yīng)對(duì)設(shè)備與儀器進(jìn)行編號(hào)建檔，并建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程(SOP)，確保使用、運(yùn)行、保養(yǎng)、維修記錄完整可追溯，對(duì)于關(guān)鍵工藝相關(guān)設(shè)備參數(shù)應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，及時(shí)對(duì)狀態(tài)異常的設(shè)備進(jìn)行校對(duì)和維修。4.3人員管理人體肌肉干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)人員管理應(yīng)滿足以下要求：a)應(yīng)分別設(shè)立干細(xì)胞制備負(fù)責(zé)人、質(zhì)量管理負(fù)責(zé)人和質(zhì)量授權(quán)人崗位。由法人授權(quán)任命，任職資質(zhì)應(yīng)符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，定期接受崗位專業(yè)培訓(xùn)，制備負(fù)責(zé)人與質(zhì)量管理負(fù)責(zé)人、質(zhì)量授權(quán)人不得相互兼任；b)干細(xì)胞制備和質(zhì)量技術(shù)人員應(yīng)具備的健康要求：HAV、HBV、HCV、HIV及梅毒的抗體檢測(cè)應(yīng)為陰性，并且(矯正)視力正常，無(wú)色盲、色弱；c)干細(xì)胞制備和質(zhì)量技術(shù)人員應(yīng)半年接受體檢一次，有呼吸道感染或發(fā)熱等疾病狀態(tài)下不得進(jìn)入潔凈操作區(qū)，需完全康復(fù)后方可恢復(fù)崗位操作；d)干細(xì)胞制備和質(zhì)量技術(shù)人員上崗前應(yīng)經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)，內(nèi)容包括但不限于干細(xì)胞理論與實(shí)踐、生命倫理、干細(xì)胞法律法規(guī)、GMP管理、GCP資質(zhì)、制劑基本知識(shí)、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)、生物安全、儀器設(shè)備使用與維護(hù)方法、物料管理與清潔衛(wèi)生、崗位職責(zé)、操作規(guī)范等內(nèi)容。3T/XXXXXXX—XXXX5樣本采集5.1一般要求5.1.1人體肌肉樣本采集與處理應(yīng)符合GB/T37864的要求。采集和處理程序可供樣本采集人員使用。5.1.2人體肌肉樣本采集方應(yīng)具備相關(guān)的資質(zhì)和設(shè)施環(huán)境。5.1.3人體肌肉樣本采集應(yīng)通過(guò)倫理審查批準(zhǔn)并履行知情同意程序，應(yīng)建立適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量管理體系確保符合用戶需求并持續(xù)改進(jìn)。5.2供者健康5.2.1人體肌肉樣本采集方應(yīng)對(duì)供者的基本信息與健康信息進(jìn)行詳細(xì)采集與記錄，同時(shí)做好對(duì)供者的隱私保護(hù)，相關(guān)記錄入檔保留至少30年。5.2.2供者應(yīng)無(wú)血液系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤史、性傳播疾病及高危人群史、吸毒史，不應(yīng)具有包括但不限于以下疾病或健康狀況：a)一般傳染性疾病或其他遺傳疾病：HIV、HBV、HCV、梅毒、HTLV、EBV與CMV抗體與核酸檢測(cè)應(yīng)為陰性；b)傳染性皮膚病(未治愈的)；c)大面積皮膚損傷(未治愈的)；d)鼻/咽喉傳染病(未治愈的)。e)采集前12個(gè)小時(shí)內(nèi)用過(guò)酒精，鎮(zhèn)靜藥等。5.3采集場(chǎng)所人體肌肉的采集場(chǎng)所應(yīng)達(dá)到Ⅲ級(jí)潔凈手術(shù)室要求。5.4采集人員采集人員應(yīng)具有醫(yī)師職業(yè)證，且經(jīng)過(guò)相應(yīng)的技術(shù)培訓(xùn)。5.5采集流程5.5.1信息填寫5.5.1.1采集人員應(yīng)按照要求填寫個(gè)人信息，個(gè)人信息表應(yīng)包括但不限于：姓名、性別、有效身份證件、聯(lián)系方式、緊急聯(lián)絡(luò)人、住址等。5.5.1.2采集人員在采集前填寫健康調(diào)查表。5.5.2采集前準(zhǔn)備5.5.2.1肌肉組織采集前應(yīng)由醫(yī)師制定手術(shù)方案和術(shù)前術(shù)后的防感染措施。5.5.2.2應(yīng)確定供者身體健康，精神狀態(tài)良好，保持供者的血壓、血糖控制在較好的范圍內(nèi)。5.5.2.3采集前的三天內(nèi)應(yīng)停用抗凝藥、激素、阿司匹林、維生素E等。5.5.2.4采集術(shù)前兩天應(yīng)清淡飲食，合理安排作息時(shí)間。5.5.2.5采集前應(yīng)對(duì)客戶進(jìn)行身體檢查，包括但不限于：病毒全套、血常規(guī)、凝血系列、心電圖等。5.5.3耗材器械確認(rèn)采集人員應(yīng)按照采集套裝清單核查器材種類和數(shù)量，一次性使用物品在有效期內(nèi)且包裝完好。手術(shù)前應(yīng)對(duì)采集器材進(jìn)行復(fù)核，復(fù)核內(nèi)容主要包括：——手術(shù)包：無(wú)破損、無(wú)滲漏、無(wú)污染，處于有效期內(nèi)；——消毒劑：.一般選用含碘消毒液，對(duì)碘過(guò)敏者可選用其他消毒劑；.應(yīng)處于有效期內(nèi)；.應(yīng)標(biāo)明啟用日期；——采集容器上均已粘貼供者識(shí)別碼。5.5.4采集過(guò)程4T/XXXXXXX—XXXX由醫(yī)師行肌肉切取手術(shù)，置于無(wú)菌采集瓶中，密封保存，并粘貼條形碼作為唯一標(biāo)識(shí)。5.6采集后注意事項(xiàng)5.6.1.1采集后盡量平躺休息60分鐘，盡量減少肢體運(yùn)動(dòng)。5.6.1.2采集后一周建議溫水擦浴，傷口不要碰水。5.6.1.3采集后三天內(nèi)禁止飲酒，飲食以清淡為主。5.6.1.4保持心情舒暢，合理飲食，作息時(shí)間規(guī)律。5.6.1.5特殊情況（如感染、血腫、疼痛等）及時(shí)復(fù)診。6樣本運(yùn)輸6.1一般要求6.1.1樣本運(yùn)輸人員應(yīng)是經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)合格的人員，對(duì)樣本運(yùn)輸應(yīng)制定規(guī)范及應(yīng)急預(yù)案，并對(duì)樣本運(yùn)輸全程做記錄，包括但不限于運(yùn)輸?shù)姆绞健l件、路徑、時(shí)間、人員、地址及樣本信息，相關(guān)記錄入檔保留至少30年。6.1.2樣本運(yùn)輸應(yīng)采用平穩(wěn)、安全、快速的運(yùn)輸途徑，宜采用冷藏運(yùn)輸車或?qū)Ｓ脴?biāo)本冷藏運(yùn)輸箱運(yùn)輸。6.1.3運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)防滲漏、防輻射、抗震動(dòng)、耐壓、耐熱等，樣本包裝應(yīng)貼上條形碼作為唯一標(biāo)識(shí)。6.1.4樣本運(yùn)輸溫度應(yīng)維持在2℃~8℃,運(yùn)輸時(shí)間不超過(guò)12小時(shí)。6.2運(yùn)輸箱運(yùn)輸箱應(yīng)有相應(yīng)的標(biāo)識(shí)，標(biāo)識(shí)內(nèi)容應(yīng)完整、清晰，標(biāo)識(shí)至少包括以下內(nèi)容：——采集方名稱及聯(lián)系方式；——最大承重量；——放置方向、防摔、防曬、防雨標(biāo)識(shí)；——最多疊放層數(shù)；——樣本的品名、運(yùn)輸起始地和目的地、樣本保存溫度；——生物危害標(biāo)識(shí)；——禁止輻射標(biāo)識(shí)。6.3質(zhì)量監(jiān)控6.3.1樣本運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)有可供追溯的記錄，記錄應(yīng)包括下列內(nèi)容：——品名、數(shù)量、規(guī)格；——狀態(tài)是否正常；——運(yùn)輸?shù)氖及l(fā)地和目的地；——采集機(jī)構(gòu)交接人、時(shí)間和日期；——運(yùn)輸承接人、時(shí)間和日期；——運(yùn)輸方式和運(yùn)輸箱編號(hào)及溫度狀態(tài)；——運(yùn)輸箱的外觀和標(biāo)識(shí)是否完整。6.3.2運(yùn)輸前應(yīng)檢查冷藏運(yùn)輸箱及控溫設(shè)備的性能和運(yùn)行狀態(tài)是否符合要求。6.3.3運(yùn)輸設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)控和評(píng)估：a)溫度：隨機(jī)抽取運(yùn)輸箱進(jìn)行腔體空載和滿載條件下的測(cè)定，確認(rèn)其滿足性能要求；b)微生物：對(duì)箱體的內(nèi)壁進(jìn)行取樣開展微生物培養(yǎng)，不得檢出致病性的微生物。6.3.4運(yùn)輸過(guò)程的記錄應(yīng)放入樣本檔案，保存至樣本使用或銷毀后10年以上。7樣本接收7.1樣本接收人員應(yīng)是經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)合格的人員，應(yīng)遵從安全與準(zhǔn)確的原則對(duì)樣本接收制定規(guī)范及應(yīng)急預(yù)案，并對(duì)樣本接收過(guò)程進(jìn)行記錄，相關(guān)記錄入檔保留至少30年。7.2樣本接收時(shí)，接收人員應(yīng)做好自我防護(hù)工作，接觸樣本之前應(yīng)佩戴手套與口罩，并對(duì)接收?qǐng)鏊M(jìn)行消毒。5T/XXXXXXX—XXXX7.3接收樣本后應(yīng)先觀察樣本容器外包裝的外觀，檢查有無(wú)破損。檢查外觀后，工作人員應(yīng)檢查樣本采集信息記錄表是否齊全，同時(shí)確認(rèn)記錄表上信息是否填寫完整，檢查信息記錄表信息是否與樣本信息一一對(duì)應(yīng)，樣本及記錄表上應(yīng)貼有一致對(duì)應(yīng)的條形碼，做到樣本與供者信息相對(duì)應(yīng)，確認(rèn)無(wú)誤后進(jìn)行接收。7.4樣本接收后，使用75%醫(yī)用酒精消毒清理容器外表面，如不能及時(shí)對(duì)樣本進(jìn)行處理，需把樣本保存在2℃~8℃條件下，最長(zhǎng)時(shí)間不超過(guò)12小時(shí)。7.5樣本量應(yīng)能夠滿足制備和檢測(cè)的最低要求。7.6樣本接收后應(yīng)及時(shí)將信息反饋給樣本發(fā)送方。7.7制備機(jī)構(gòu)應(yīng)制定樣本拒收標(biāo)準(zhǔn)，按照樣本拒收標(biāo)準(zhǔn)處理樣本。8分離與培養(yǎng)8.1基本要求8.1.1人體肌肉干細(xì)胞分離與培養(yǎng)應(yīng)符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨慶前研究指導(dǎo)原則》要求的車間內(nèi)進(jìn)行。8.1.2所有操作應(yīng)事先制定標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，由經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)的技術(shù)人員嚴(yán)格遵照?qǐng)?zhí)行，并進(jìn)行記錄登記，相關(guān)記錄入檔保留至少30年。8.1.3分離與培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)標(biāo)識(shí)干細(xì)胞的名稱、代次、批次、操作日期、培養(yǎng)條件、操作人員姓名等信息。8.1.4所使用試劑應(yīng)采用符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》、《中華人民共和國(guó)藥典》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求的藥品輔料或已獲批的藥品，應(yīng)出具產(chǎn)品質(zhì)檢合格報(bào)告，并對(duì)各批次試劑進(jìn)行質(zhì)量抽檢。8.1.5應(yīng)避免人源或動(dòng)物源性血清及蛋白，不得使用同種異體人血清或血漿。如必須使用動(dòng)物血清，應(yīng)確保其無(wú)特定動(dòng)物源性病毒污染。嚴(yán)禁使用海綿體狀腦病流行區(qū)來(lái)源的牛血清。8.2分離前準(zhǔn)備工作8.2.1環(huán)境確認(rèn)：潔凈室和潔凈工作臺(tái)或生物安全柜應(yīng)使用紫外燈滅菌30分鐘，并啟動(dòng)凈化風(fēng)機(jī)和空調(diào)系統(tǒng)自凈20分鐘以上。8.2.2工作人員核對(duì)樣本與采集信息內(nèi)容一致性，用75%的乙醇對(duì)采集瓶外表面自下而上進(jìn)行清潔消毒，并放置傳遞窗自凈15分鐘后，傳入分離、處理區(qū)域。8.2.3物料準(zhǔn)備：取出所需的試劑及耗材放置物料推車上，放置于潔凈化工作臺(tái)或生物安全柜旁邊，待用。核查確認(rèn)所用試劑及耗材的批號(hào)及是否在有效期內(nèi)。8.2.4培養(yǎng)液準(zhǔn)備：自配培養(yǎng)液使用前確認(rèn)微生物培養(yǎng)72小時(shí)以上結(jié)果為陰性；商品化的細(xì)胞培養(yǎng)液使用前應(yīng)核查確認(rèn)合格證和有效期。8.3分離與培養(yǎng)方法將肌肉組織剪碎至糜狀，以膠原酶、中性酶和胰酶消化法分離原代細(xì)胞，采用貼壁法（膠原蛋白包埋的培養(yǎng)板）進(jìn)行人肌肉間充質(zhì)干細(xì)胞（鐵壁快，24小時(shí)之內(nèi)）和肌肉干細(xì)胞（貼壁慢，48小時(shí)之后)的分離。8.4細(xì)胞換液8.4.1換液操作應(yīng)嚴(yán)格遵照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無(wú)外源微生物污染，相關(guān)操作均進(jìn)行記錄并入檔保存至少30年。8.4.2換液時(shí)間及頻次應(yīng)根據(jù)肌肉干細(xì)胞生長(zhǎng)情況及培養(yǎng)基狀態(tài)進(jìn)行判斷，以保障肌肉干組胞生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)水平，并消除代謝物毒害作用。8.4.3換液操作時(shí)吸棄培養(yǎng)瓶中原有的部分或全部培養(yǎng)液，再加入新鮮培養(yǎng)液。首次換液需要在鏡下觀察到原代細(xì)胞完全貼壁和延展后方可進(jìn)行。8.4.4培養(yǎng)基成分應(yīng)符合肌肉干細(xì)胞分離與培養(yǎng)基本要求，盡量采用已獲國(guó)家批準(zhǔn)的臨床級(jí)產(chǎn)品或藥品輔料。6T/XXXXXXX—XXXX8.5細(xì)胞傳代8.5.1傳代操作應(yīng)嚴(yán)格遵照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無(wú)外源微生物污染，相關(guān)操作均進(jìn)行記錄并入檔保存至少30年。8.5.2一般情況在達(dá)到65%～80%融合度可講行傳代操作，傳代操作應(yīng)密度適宜、及時(shí)，迅速。8.5.3傳代所使用消化酶應(yīng)符合肌肉干細(xì)胞分離與培養(yǎng)的基本要求，盡量采用國(guó)家已批準(zhǔn)的臨床級(jí)產(chǎn)品。如必須使用動(dòng)物源性消化酶，應(yīng)確保其無(wú)特定動(dòng)物源性病毒污染。8.6細(xì)胞凍存8.6.1凍存操作應(yīng)嚴(yán)格遵照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無(wú)外源微生物污染，相關(guān)操作均進(jìn)行記錄并入檔保存至少30年。8.6.2經(jīng)制備數(shù)量達(dá)到凍存要求的肌肉干細(xì)胞系可進(jìn)行凍存操作，凍存細(xì)胞應(yīng)加入適當(dāng)?shù)膬龃姹Ｗo(hù)液，遵循程序降溫原則，并在液氮中進(jìn)行保存。8.6.3凍存液成分應(yīng)符合肌肉干細(xì)胞分離與培養(yǎng)的基本要求，盡量采用國(guó)家已批準(zhǔn)的臨床級(jí)產(chǎn)品或藥品輔料，二甲基亞砜含量不得超過(guò)10%，如必須使用動(dòng)物源性血清，應(yīng)確保其無(wú)特定動(dòng)物源性病毒污染，嚴(yán)禁使用海綿狀腦病流行區(qū)來(lái)源的牛血清。8.6.4凍存細(xì)胞應(yīng)標(biāo)明干細(xì)胞名稱、培養(yǎng)條件、代次、批次、操作人員、凍存日期等信息，并具有唯一標(biāo)識(shí)。8.6.5液氮凍存應(yīng)使用符合要求的液氮容器，氣相凍存，由專人負(fù)責(zé)，保證液氮充足，溫度恒定。8.7穩(wěn)定性考察8.7.1細(xì)胞庫(kù)應(yīng)依據(jù)儲(chǔ)存的干細(xì)胞產(chǎn)品的特性，制定年度的儲(chǔ)存細(xì)胞質(zhì)量穩(wěn)定性考察方案和計(jì)劃，并制定穩(wěn)定性考察的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。8.7.2穩(wěn)定性考察的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)包括但不限于以下內(nèi)容：a)凍存容器完整性和密閉性；b)細(xì)胞活率；c)微生物培養(yǎng)；d)細(xì)胞凍存復(fù)蘇回收率；e)細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)；f)細(xì)胞生物學(xué)效力。8.7.3肌肉干細(xì)胞在凍存后1周復(fù)蘇存活率不應(yīng)低于80%，1年復(fù)蘇存活率不應(yīng)低于60%。8.7.4常規(guī)每年至少執(zhí)行一次穩(wěn)定性考察計(jì)劃，如遇特殊情況（例如液相液氮罐故障）可臨時(shí)性增加穩(wěn)定性考察計(jì)劃。8.7.5應(yīng)對(duì)年度性的穩(wěn)定性考察結(jié)果進(jìn)行趨勢(shì)分析，便于監(jiān)測(cè)細(xì)胞儲(chǔ)存的連續(xù)穩(wěn)定性并改進(jìn)細(xì)胞儲(chǔ)存工藝。9記錄9.1原始記錄應(yīng)確保其可追溯細(xì)胞分離、處理和儲(chǔ)存操作所有環(huán)節(jié)，記錄內(nèi)容包含但不限于以下信息：a)供者身份號(hào)碼；b)產(chǎn)品描述碼、采集類型和分類碼；c)產(chǎn)品名稱和組分；d)供者唯一身份辨識(shí)符，如果適用；e)采集日期和時(shí)間；f)生產(chǎn)制備機(jī)構(gòu)的名稱和地址；g)制備、保存、凍存中關(guān)鍵步驟的細(xì)節(jié)及結(jié)果；h)關(guān)鍵步驟的日期和時(shí)間，如果適用；i)每一步驟的操作人員姓名；j)在分離、處理、凍存、儲(chǔ)存過(guò)程中使用的關(guān)鍵物料的名稱、生產(chǎn)商、批號(hào)、有效期限；k)使用試劑的數(shù)量；7T/XXXXXXX—XXXXl)使用設(shè)備編碼。9.2記錄的審核：應(yīng)對(duì)記錄的準(zhǔn)確性和完整性以及標(biāo)準(zhǔn)、法律法規(guī)的符合性進(jìn)行審核。9.3記錄的保存：記錄應(yīng)歸檔于受控區(qū)域進(jìn)行保存，確保整個(gè)保存期間記錄的清晰和完整性，并應(yīng)避免意外或非授權(quán)的調(diào)閱、丟失、損壞、破壞、混淆或篡改。9.4記錄的修改：機(jī)構(gòu)應(yīng)建立并保持合適的記錄修改程序。記錄修改人的簽名及日期應(yīng)記錄下來(lái)；修改前的記錄內(nèi)容應(yīng)清晰可辨認(rèn)。9.5隱私保護(hù)：應(yīng)建立保密機(jī)制，確保供者、員工信息的保密性。9.6記錄保存期限：文件記錄是要保存至細(xì)胞應(yīng)用或處理后20年。10質(zhì)量控制10.1質(zhì)控內(nèi)容10.1.1人體肌肉干細(xì)胞安全性人體肌肉干細(xì)胞安全性檢驗(yàn)項(xiàng)目包括：a)無(wú)菌檢測(cè)：參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則1101無(wú)菌檢測(cè)法執(zhí)行，對(duì)肌肉干細(xì)胞樣本采集、運(yùn)輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、凍存液等）檢測(cè)。細(xì)菌和真菌檢測(cè)結(jié)果都應(yīng)為陰性；b)支原體檢測(cè)：參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則3301支原體檢測(cè)法執(zhí)行，對(duì)肌肉干細(xì)胞樣本采集、運(yùn)輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、凍存液等）檢測(cè)。支原體檢測(cè)結(jié)果都應(yīng)為陰性；c)細(xì)胞內(nèi)外源致病因子檢測(cè)：采用血清ELISA檢測(cè)法或核酸檢測(cè)法，對(duì)肌肉干細(xì)胞樣本采集、運(yùn)輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、凍存液、細(xì)胞等）檢測(cè)。HIV抗體、HBsAg、HCV抗體、TP抗體、CMV-IgM、HTLV抗體、HPV抗體、HHV抗體、EBV抗體檢測(cè)應(yīng)為陰性；HCV、HBV、HIV病毒核酸檢測(cè)應(yīng)為陰性；d)內(nèi)毒素檢測(cè)：參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法執(zhí)行，對(duì)肌肉干細(xì)胞樣本采集、運(yùn)輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、凍存液等）檢測(cè)。各類樣本中的內(nèi)毒素檢測(cè)值應(yīng)≤0.5EU/mL。e)致瘤性檢測(cè)：采用免疫缺陷動(dòng)物（裸鼠或SCID鼠），通過(guò)局部或靜脈方式接種肌肉干細(xì)胞，評(píng)價(jià)肌肉干細(xì)胞致瘤性。體內(nèi)致瘤試驗(yàn)嚴(yán)格遵照動(dòng)物倫理要求執(zhí)行，單只小鼠接種肌肉干細(xì)胞數(shù)量≥106細(xì)胞/kg，觀察期≥12周。肌肉干細(xì)胞應(yīng)無(wú)致瘤性。10.1.2人體肌肉干細(xì)胞穩(wěn)定性人體肌肉干細(xì)胞穩(wěn)定性檢測(cè)項(xiàng)目包括：a)細(xì)胞數(shù)量和活率檢測(cè)：選用血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板或細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將待檢測(cè)細(xì)胞使用臺(tái)盼藍(lán)或A0/PI熒光染料染色，讀取細(xì)胞數(shù)并計(jì)算活率。各代數(shù)及批次肌肉干細(xì)胞活細(xì)胞比例≥90%。b)生長(zhǎng)活性檢測(cè)：通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞倍增時(shí)間、細(xì)胞周期、克隆形成率以及端粒酶活性對(duì)肌肉干細(xì)胞生長(zhǎng)活性進(jìn)行測(cè)定，各代數(shù)及批次肌肉干細(xì)胞應(yīng)處于指數(shù)生長(zhǎng)期，GO期細(xì)胞數(shù)≤10%，具有端粒酶活性。c)細(xì)胞純度和均一性檢測(cè)：采用肌肉干細(xì)胞表面標(biāo)志物流式檢測(cè)以及人基因組DNA短片段重復(fù)序列(STR)測(cè)序進(jìn)行檢定。各代數(shù)及批次肌肉干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)應(yīng)符合流式檢測(cè)比例要求，單一細(xì)胞系的肌肉干細(xì)胞各代次及批次細(xì)胞STR檢測(cè)結(jié)果應(yīng)保持一致。10.1.3人體肌肉干細(xì)胞生物學(xué)特征人體肌肉干細(xì)胞生物學(xué)特征檢測(cè)項(xiàng)目包括：a)細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)：顯微鏡下觀察，肌肉干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈短梭形外觀，形態(tài)均一，細(xì)胞之間無(wú)密切接觸；8T/XXXXXXX—XXXXb)細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)：采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定，肌肉干細(xì)胞表面標(biāo)志物Integrinα7、Notch1和細(xì)胞核內(nèi)標(biāo)志物Pax7、myogenin陽(yáng)性率不低于95%；CD31、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105陽(yáng)性率不高于5%。c)分化能力檢測(cè)：采用體外條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下，肌肉干細(xì)胞應(yīng)能夠分化為成肌肉、脂肪、骨、軟骨細(xì)胞。成肌分化經(jīng)觀察多核的肌管的形成鑒定，成脂分化經(jīng)油紅0染色法鑒定，成骨分化經(jīng)茜素紅染色法鑒定，成軟骨分化經(jīng)阿爾辛藍(lán)染色法鑒定。d)染色體核型檢測(cè)：采用G帶分析法進(jìn)行測(cè)定，肌肉干細(xì)胞染色體數(shù)量為46(含XX/XY)，無(wú)染色體缺失、異位和重排現(xiàn)象。10.2質(zhì)控分類10.2.1批次質(zhì)量檢驗(yàn)人體肌肉干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)由同一供體、同一時(shí)間、使用同一工藝采集和分離獲得的干細(xì)胞進(jìn)行例行批次質(zhì)量檢驗(yàn)。當(dāng)制備工藝、耗材、試劑、場(chǎng)地或規(guī)模等條件發(fā)生時(shí)，制備機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)多批次干細(xì)胞制劑進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，確保工藝和質(zhì)量穩(wěn)定合格，記錄入檔保存至少30年。質(zhì)量控制檢測(cè)表參見附錄A。10.2.2放行質(zhì)量檢驗(yàn)每一批次肌肉干細(xì)胞制劑在臨床使用前應(yīng)在完成例行質(zhì)量檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上，由干細(xì)胞臨床研究機(jī)構(gòu)質(zhì)檢平臺(tái)進(jìn)行快速和簡(jiǎn)化的質(zhì)量檢測(cè)，應(yīng)包括但不限于活率、細(xì)胞表型、細(xì)菌、病毒、支原體和內(nèi)毒素含量等，確認(rèn)細(xì)胞合格后方可申請(qǐng)臨床放行使用。相關(guān)記錄報(bào)告應(yīng)入檔保存至少30年。10.2.3復(fù)核質(zhì)量檢驗(yàn)人體肌肉干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)每一批次干細(xì)胞制劑單獨(dú)留樣保存，詳細(xì)記錄批號(hào)、代次、生產(chǎn)日期、來(lái)源等信息。定期由國(guó)家或地方相關(guān)部門授權(quán)的專業(yè)細(xì)胞檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行肌肉干細(xì)胞制劑的質(zhì)量復(fù)核檢驗(yàn)，并出具檢驗(yàn)報(bào)告，入檔保存至少30年。復(fù)核質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告出具時(shí)間應(yīng)在該批次肌肉干細(xì)胞制劑提出放行申請(qǐng)之前，并作為放行檢驗(yàn)參考。11質(zhì)量評(píng)價(jià)與放行11.1質(zhì)量評(píng)價(jià)內(nèi)容11.1.1供者健康篩查結(jié)果應(yīng)符合合格供者要求并簽署了知情同意書。11.1.2肌肉及檢測(cè)標(biāo)本的采集和運(yùn)輸符合標(biāo)準(zhǔn)要求。11.1.3肌肉及檢測(cè)標(biāo)本的接收、標(biāo)識(shí)以及暫存符合標(biāo)準(zhǔn)要求。11.1.4細(xì)胞分離、處理、檢測(cè)區(qū)域應(yīng)滿足操作要求，有潔凈要求的操作環(huán)境應(yīng)滿足相應(yīng)級(jí)別環(huán)境要求，應(yīng)有定期環(huán)境監(jiān)控；細(xì)胞分離、處理各工序完畢后均應(yīng)及時(shí)清場(chǎng)；現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)無(wú)污染及交叉污染，如有傳染病原體或污染物，應(yīng)得到有效隔離或清除。11.1.5細(xì)胞在分離、處理及檢測(cè)等過(guò)程中所涉及的人員均已通過(guò)考核合格后上崗。11.1.6細(xì)胞分離、處理、檢測(cè)等所使用的設(shè)備應(yīng)符合設(shè)備管理要求（標(biāo)識(shí)清晰正確，在合格計(jì)量校驗(yàn)期內(nèi)定期維護(hù)保養(yǎng)等）；與細(xì)胞接