教版高中生物選修一專題五《DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)》知識點歸納

專題五ＤＮＡ和蛋白質(zhì)技術(shù)課題一ＤＮＡ的粗提取及鑒定一、提取的溶解性原理包括哪些方面？1在不同濃度溶液中溶解度不同；不溶于酒精。①在不同濃度溶液中溶解度有何特點？要使溶解，須要運用什么濃度？要使析出，又須要運用什么濃度？在時溶解度最??；較高濃度可使溶解；可使析出。②在溶解細(xì)胞中的時，人們通常選用2溶液；將分子析出的方法是向溶有的溶液中緩慢注入蒸餾水，以稀釋溶液。酒精是一種常用有機溶劑，但卻不能溶于酒精〔特殊是95％冷卻酒精〕，但細(xì)胞中蛋白質(zhì)可溶于酒精。2.從理論上分析，預(yù)冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點。一是抑制核酸水解酶活性，防止降解；二是降低分子運動，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加分子柔韌性，削減斷裂。3.采納不溶于酒精的原理，可以到達什么目的？將和蛋白質(zhì)進一步別離。 4.提取還可以利用對酶、高溫柔洗滌劑的耐受性原理。利用該原理時，應(yīng)選用怎樣的酶和怎樣的溫度值？蛋白酶，因為酶具有專一性，蛋白酶只水解蛋白質(zhì)而不會對產(chǎn)生影響。溫度值為60～80℃，因為該溫度值蛋白質(zhì)變性沉淀，而不會變性。補充：的變性是指分子在高溫下解螺旋，其溫度在80℃以上，如在技術(shù)中變性溫度在95℃。5.洗滌劑在提取中有何作用？洗滌劑將細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，從而瓦解細(xì)胞膜。6.當(dāng)鑒定提取出的物質(zhì)是否是時，須要運用什么指示劑進展鑒定？在沸水浴條件下，遇二苯胺呈現(xiàn)藍(lán)色。 原理總結(jié)：通過利用不同濃度溶液溶解或析出，可以從細(xì)胞中提取和提純；再利用酒精進一步將及蛋白質(zhì)別離開來，到達提純的目的；最終利用二苯胺試劑鑒定提取的物質(zhì)是否是。二、試驗材料的選取不同生物的組織中含量不同。在選取材料時，應(yīng)本著含量高、材料易得、便于提取的原則。本試驗用雞血細(xì)胞做試驗材料有兩個緣由。一是因為雞血細(xì)胞核的含量豐富，材料易得；二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動物肝臟細(xì)胞作試驗材料經(jīng)常須要勻漿和離心，對設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時較長。雞血細(xì)胞裂開以后釋放出的，簡單被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了削減的損失，最好運用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液。三、裂開細(xì)胞，獲得含的濾液1、假設(shè)選用雞血和洋蔥作試驗材料，則怎樣獲得含的濾液？在雞血細(xì)胞液中參與一定量蒸餾水并用玻棒攪拌，過濾后收集濾液；切碎洋蔥，參與一定量洗滌劑和食鹽，攪拌研磨，過濾后收集濾液。2.為什么參與蒸餾水能使雞血細(xì)胞裂開？答：蒸餾水對于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細(xì)胞的裂開(細(xì)胞膜和核膜的裂開)，從而釋放出。3．在以上試驗中，參與蒸餾水、洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？過濾時應(yīng)中選用〔濾紙、尼龍布〕。血細(xì)胞在蒸餾水中大量吸水而張裂；洗滌劑瓦解細(xì)胞膜；食鹽溶解物質(zhì)；選用尼龍布進展過濾。4.在處理植物組織時須要進展研磨，其目的是什么？研磨不充分產(chǎn)生什么結(jié)果？裂開細(xì)胞壁，使核物質(zhì)簡單溶解在溶液中；研磨不充分會使的提取量削減，影響試驗結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。詳細(xì)做法。10雞血＋20蒸餾水→同方向攪拌→3層尼龍布過濾→濾液三、去除濾液中的雜質(zhì)1.為什么反復(fù)地溶解及析出，能夠去除雜質(zhì)？用高鹽濃度的溶液溶解，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解及析出，就能夠除去及溶解度不同的多種雜質(zhì)。最初獲得的濾液含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)，須要進一步提純。方案一的原理是在不同濃度溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解；方案三的原理是蛋白質(zhì)和的變性溫度不同。方案二及方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的及蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，及別離。四、析出及鑒定1.在濾液中仍舊含有一些雜質(zhì)，怎樣除去這些雜質(zhì)呢？得到的呈何顏色？濾液及等體積的冷卻酒精混合勻稱，靜置2～3分鐘，析出的白色絲狀物就是。呈白色。2.怎樣鑒定析出的白色絲狀物就是呢？詳細(xì)做法。試管2支，編號甲乙→各加等量5溶液→甲中放入少量白色絲狀物，使之溶解→各加4二苯胺，混合勻稱→沸水浴5→視察顏色變化五、試驗操作制備雞血細(xì)胞液…………加檸檬酸鈉，靜置或離心↓裂開細(xì)胞，釋放…加蒸餾水，同一方向快速通方向攪拌↓→過濾，除去細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等。溶解核內(nèi)…………參與至2，同一方向緩慢攪拌↓析出………………加蒸餾水至，過濾，在溶解到2溶液中↓→除去細(xì)胞質(zhì)中的大局部物質(zhì)。初步純化…………及等體積95％冷卻酒精混合，析出白色絲狀物↓→除去核蛋白、、多糖等。鑒定………………二苯胺，沸水浴，呈現(xiàn)藍(lán)色考前須知：在雞血中參與檸檬酸鈉防止凝固；雞血靜置或離心以提高細(xì)胞懸液濃度；運用塑料燒杯；運用尼龍布過濾；玻棒沿同一方向攪拌；玻棒攪拌要緩慢〔細(xì)胞裂開快速攪拌〕；玻棒不要遇到燒杯壁；二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配等。課題二多聚酶鏈?zhǔn)椒错憯U增片段根底知識技術(shù)擴增的過程，及細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程類似：1．細(xì)胞內(nèi)復(fù)制條件分析：條件組分作用模板的兩條單鏈供應(yīng)復(fù)制的模板原料四種脫氧核苷酸合成子鏈的原料酶解旋酶聚合酶翻開雙螺旋催化合成子鏈能量為解螺旋和合成子鏈供能引物為聚合酶供應(yīng)合成的3’端起點2．細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程的解析：解旋：解旋酶、，兩條鏈翻開，形成兩條單鏈。引物結(jié)合：在單鏈3’端及反向配對結(jié)合。聚合酶結(jié)合：聚合酶及模板鏈結(jié)合，標(biāo)記著單鏈合成開場。子鏈合成：聚合酶從引物3’端開場，將配對的脫氧核苷酸連接起來。后續(xù)加工：聚合酶I將引物切去，并合成空缺處的單鏈，再由連接酶將不連續(xù)的子鏈連接起來〔半不連續(xù)合成。先導(dǎo)鏈，滯后鏈〕3．分子復(fù)制的人工限制試驗操作步驟照反響體系配方配制反響液；②將反響體系50μL用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管〔0.5〕中；③將微量離心管放到儀中；④設(shè)置儀的工作參數(shù)。⑤在儀中大量擴增。4．試驗考前須知〔1〕防止外源污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等運用前高壓滅菌?！?〕緩沖液和酶分裝成小份，－20℃低溫保存。〔3〕每添加一種反響成分，更換一個移液器的槍頭?！?〕混勻后離心處理，使反響液集中在離心管底部?？偨Y(jié)、點評多聚酶鏈?zhǔn)椒错憯U增片段多聚酶鏈?zhǔn)椒错憯U增片段原理的復(fù)制須要酶、原料、能量、引物的變性和復(fù)性受溫度影響過程變性復(fù)性延長操作步驟配制反響體系移入離心管放入設(shè)置工作參數(shù)擴增測定含量稀釋調(diào)零測定并讀數(shù)計算課題三血紅蛋白的提取和別離一、試驗原理蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形態(tài)、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別，由此提取和別離各種蛋白質(zhì)。1．凝膠色譜法〔安排色譜法〕：〔1〕原理：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流淌快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流淌慢。〔2〕凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖?！?〕別離過程：混合物上柱→洗脫→大分子流淌快、小分子流淌慢→收集大分子→收集小分子洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流淌?！?〕作用：別離蛋白質(zhì)，測定生物大分子分子量，蛋白質(zhì)的脫鹽等。2．緩沖溶液〔1〕原理：由弱酸和相應(yīng)的強堿弱酸鹽組成〔如H23－3，2424等〕，調(diào)整酸和鹽的用量，可配制不同的緩沖液?！?〕緩沖液作用：反抗外界酸、堿對溶液的干擾而保持穩(wěn)定。3．凝膠電泳法：〔1〕原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形態(tài)和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同?！?〕別離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等?！?〕別離過程：在一定下，使蛋白質(zhì)基團帶上正電或負(fù)電；參與帶負(fù)電荷多的，形成“蛋白質(zhì)－復(fù)合物〞，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。二、試驗步驟1．樣品處理紅細(xì)胞的洗滌洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時采納低速短時間離心別離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透亮的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再參與五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10，低速短時間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，說明紅細(xì)胞已洗滌干凈。②血紅蛋白的釋放在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞裂開釋放出血紅蛋白。注：參與蒸餾水后紅細(xì)胞液體積及原血液體積要一樣。參與甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和別離。2．粗別離①別離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透亮的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透亮液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透亮液體。②透析取1的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300的物質(zhì)的量的濃度為20的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。3．純化調(diào)整緩沖液面：翻開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到及凝↓膠面平齊，關(guān)閉出口。參與蛋白質(zhì)樣品：用吸管將透析后的樣品沿管壁環(huán)繞移動加到色譜柱的頂端。加樣后，∣翻開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全滲入凝膠層后，↓關(guān)閉出口。調(diào)整緩沖液面：參與20的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度↓洗脫：連接緩沖液洗脫瓶，翻開下端出口，進展洗脫?！占盅b蛋白質(zhì)：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集。聚丙烯酰胺凝膠電泳〔選做〕三、考前須知電泳技術(shù)電泳技術(shù)就是在電場的作用下，利用待別離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形態(tài)等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而到達對樣品進展別離、鑒定或提純的目的。2.紅細(xì)胞的洗滌假如分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的緣由。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。3．如何檢測凝膠色譜柱的裝填是否勝利由于凝膠是一種半透亮的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支及凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得勻稱。此外，還可以參與大分子的有色物質(zhì)，視察色帶移動的狀況。假如色帶勻稱、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。假如色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消退氣泡，消退不了時要重新裝柱。4．為什么凝膠的裝填要嚴(yán)密、勻稱？假如凝膠裝填得不夠嚴(yán)密、勻稱，就會在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流淌次序，影響別離的效果。5．沸水浴處理參與洗脫液的濕凝膠的目的不但節(jié)約時間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物和解除凝膠內(nèi)的空氣。6．75“G〞代表凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及別離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5g。7．裝填完后，馬上用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填嚴(yán)密8．參與檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要緩慢攪拌？防止血液凝固；防止白細(xì)胞沉淀；防止紅細(xì)胞裂開釋放出血紅蛋白。9．及其他真核細(xì)胞相比，