常見的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

常見的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

主要內(nèi)容：

實(shí)驗(yàn)一與免疫相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)的觀察實(shí)驗(yàn)二沉淀反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)三凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)四溶血反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)五T、B淋巴細(xì)胞分離試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)六豚鼠T淋巴細(xì)胞的測定

實(shí)驗(yàn)七酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)八抗原和免疫血清的制備

實(shí)驗(yàn)九血球凝集和血球凝集抑制試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)十白細(xì)胞移動抑制試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)十一淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)十二NK細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn)十三流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)

實(shí)驗(yàn)十四殺傷細(xì)胞功能的檢測實(shí)驗(yàn)十五吞噬功能試驗(yàn)

附錄

實(shí)驗(yàn)一與免疫相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)的觀察

目的要求：

觀察與免疫相關(guān)的幾種細(xì)胞的形態(tài)，了解它們在機(jī)體免疫反應(yīng)中的作

用。

實(shí)驗(yàn)器材：

顯微鏡

血液涂片（瑞氏染色）

結(jié)締組織切片

方法：

油鏡觀察

一.血涂片的觀察

(A)紅細(xì)胞：淡紅色，無核的圓形細(xì)胞，因紅血球?yàn)殡p凹形，故

邊緣部分染色較深，中心較淺，直徑7—8微米。

(B)顆粒白血球

嗜中性顆粒白血球：體積略大于紅細(xì)胞，細(xì)胞核被染成紫色分葉狀,

可分1—5葉，核葉之間聯(lián)以染色質(zhì)細(xì)絲，染色質(zhì)染成粉色，其中充

滿細(xì)小的大小均勻的顆粒被染成紫紅色。直徑10—12微米。

嗜酸性顆粒白血球：略大于嗜中白血球，細(xì)胞核染成紫色，通常為2

葉，胞質(zhì)充滿嗜酸性大圓顆粒，被染成鮮紅色。直徑10—15微米。

嗜堿性顆粒白血球：體積略小于嗜酸性白血球，細(xì)胞質(zhì)中有大小不等

被染成紫色顆粒，顆粒數(shù)目較嗜酸性白血球的顆粒少，核為1—2葉

染成淡蘭色。直徑10—11微米。

(C)無顆粒白血球

淋巴細(xì)胞：涂片中可觀察到中、小型兩種。小淋巴細(xì)胞與紅血球大小

相似，圓形。其中含致密的核，染成深紫色。周圍僅有一薄層嗜磴性

染成淡藍(lán)的細(xì)胞質(zhì)。中淋巴細(xì)胞較大，有較寬層的細(xì)胞，核圓形。6-8

微米。

單核細(xì)胞：體積最大，細(xì)胞圓形。胞質(zhì)染成灰藍(lán)色。核呈腎形或馬蹄

形，染色略淺于淋巴細(xì)胞的核。直徑14-20微米。

二.肥大細(xì)胞的觀察(示教)

胞體較大，呈卵圓形，胞質(zhì)內(nèi)充滿粗大均等的嗜磴性顆粒。其中含肝

素、組織胺等物質(zhì)。常成群地分布于血管的周圍。

三.漿細(xì)胞的觀察（示教）

細(xì)胞呈圓形或卵圓形，胞質(zhì)豐富，呈嗜敏性。核圓形，著色深，多偏

于細(xì)胞的一側(cè)，染色質(zhì)核膜呈車輪分布。正常組織漿細(xì)胞少，慢性炎

癥時增多。漿細(xì)胞合成和分泌抗體，對免疫有重要意義。

四.巨噬細(xì)胞：又稱組織細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。常伸出短而鈍突起,

有很強(qiáng)的吞噬能力。

附：

瑞特氏染色：

1.染色液配置

稱取瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中，過濾。貯褐色瓶中備用。（配

置時，要先將瑞特氏染料置研缽體內(nèi)邊研邊滴加甲醇，使染料溶液得

更好。）

2.瑞特氏染色法：

取小鼠骨動脈血，涂制玻片。干后用玻璃筆在涂處之兩側(cè)劃線（限制

染液流掉）。于劃線內(nèi)部滴加染液3-4滴，經(jīng)3-5分鐘后，再滴加等量

的蒸儲水，輕輕晃動混合。經(jīng)5分鐘后，用蒸儲水洗凈，待干后用油

鏡檢查。

實(shí)驗(yàn)二沉淀反應(yīng)

可溶性抗原與相應(yīng)的抗體混合，在電解質(zhì)存在的條件下，兩者比例適

合，即可有沉淀物出現(xiàn)，叫沉淀反應(yīng)（Precipitation）.由于沉淀反應(yīng)抗

原多系膠體溶液。沉淀物主要是由抗體蛋白所組成。

為了求得抗原與抗體的適宜比例，保證有足夠的抗體，而且抗原分子

小，具有較大的反應(yīng)面積，因此操作上通常是稀釋抗原，不稀釋抗體。

沉淀反應(yīng)的種類有環(huán)狀沉淀、絮狀沉淀、莢膜膨脹、瓊脂擴(kuò)散及免疫

電泳等。此外還有放射性同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記等測定法。

（一）環(huán)狀沉淀反應(yīng)

當(dāng)抗原與相應(yīng)抗體形成一個接觸面時，如二者比例適當(dāng)，接觸面上可

形成一個乳白色的環(huán)狀物即為陽性沉淀反應(yīng)。

材料：

1.免疫血清：免疫兔抗人血清

2.抗原：人血清

3.小沉淀管、毛細(xì)吸管、橡皮頭、生理鹽水。

方法：

1.取小沉淀管2只，以毛細(xì)吸管吸取抗人血清約0.2毫升,

加入第一管，加時注意不能有氣泡。

2.以毛細(xì)吸管吸取生理鹽水0.2毫升加入第二管。

3.用毛細(xì)吸管吸入血稀釋0.2毫升加入各管，加時應(yīng)注意使

抗原溶液緩緩由管壁流下，輕浮于血清面上，使成一明顯界面，切勿

使之相混。

4.置室溫中10—20分鐘，觀察液面有無乳白色沉淀環(huán)，若

有則為陽性。

（二）.瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

瓊脂擴(kuò)散是抗原抗體在凝膠中所呈現(xiàn)的一種沉淀反應(yīng)。

抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠中相遇時，便出現(xiàn)可見的白色沉淀線。

這種沉淀線是一組抗原抗體的特異性復(fù)合物。如果凝膠中有多種不同

抗原抗體存在時，便依各自擴(kuò)散速度的差異，在適當(dāng)部位形成獨(dú)立的

沉淀線，因此廣泛地用于抗原成分的分析。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)可根據(jù)抗原

抗體反應(yīng)的方式和特性分為單向免疫擴(kuò)散、雙向免疫擴(kuò)散、免疫電泳、

對流免疫電泳、單向及雙向火箭電泳試驗(yàn)。

⑴單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

材料：

1.診斷血清（抗體：抗人IgG或IgA免疫血清）

2.待檢血清（抗原）：人血清

3.參考血清：全國統(tǒng)一人血清免疫球蛋白參考血清（批號不同，免疫

球蛋白含量不同）。

4.其它：生理鹽水、瓊脂粉、微量進(jìn)樣器、打孔器、玻璃板、濕盒

等。

方法：

1.將適當(dāng)稀釋（事先滴定）的診斷血清與予溶化的2%瓊脂在60C水浴

預(yù)熱數(shù)分鐘后等量混合均勻制成免疫瓊脂板。

2.在免疫瓊脂板上按一定距離（1.2—1.5厘米）打孔，見圖1。

圖1單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗原孔位置示意圖

1-5孔加參考血清，6-7孔加待檢血清

3.向孔內(nèi)滴加1:2,1：4,1：8,1：16,1：32稀釋的參考血清

及1:10稀釋的待檢血清，每孔10微升，此時加入的抗原液面應(yīng)與

瓊脂板一平，不得外溢。

4.已經(jīng)加樣的免疫瓊脂板置濕盒中37c溫箱擴(kuò)散24小時。

5.測定各孔形成的沉淀環(huán)直徑(mm),用參考血清各稀釋度測定值繪出

標(biāo)準(zhǔn)曲線，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出被檢血清中免疫球蛋白的含量。

(2)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

材料：

1.診斷血清：兔抗人血清

2.待測血清：人血清

3.陰性對照血清

4.其它：生理鹽水、瓊脂粉、載玻片、打孔器、微量進(jìn)樣器等。

方法：

1.取一清潔載玻片，傾注3.5—4.0毫升加熱熔化的1%食鹽瓊脂制成

瓊脂板。

2.凝固后，用直徑3毫米打孔器，孔間距為5毫米?？椎呐帕蟹绞?/p>

如圖2所示。

圖2雙向瓊脂擴(kuò)散原抗體孔位置示意圖

3.用微量進(jìn)樣器于中央孔加抗體，于周圍孔加各種抗原。加樣時勿

使樣品外溢或在邊緣殘存小氣泡，以免影響擴(kuò)散結(jié)果。

4.加樣后的瓊脂板收入濕盒內(nèi)置37℃溫箱中擴(kuò)散24-48小時。

5.結(jié)果觀察：若凝膠中抗原抗體是特異性的，則形成抗原一抗體復(fù)

合物，在兩孔之間出現(xiàn)一清晰致密白色的沉淀線，為陽性反應(yīng)。若在

72小時仍未出現(xiàn)沉淀線則為陰性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)時至少要做一陽性對照。

出現(xiàn)陽性對照與被檢樣品的沉淀線發(fā)生融合，才能確定待檢樣品為真

正陽性。

6.結(jié)果分析：瓊脂擴(kuò)散結(jié)果受許多因素影響。

①抗原特異性與沉淀線形狀的關(guān)系:在相鄰兩完全相同的抗原與抗體

反應(yīng)時，則可出現(xiàn)兩單沉淀線的融合。反之，如相鄰抗原完全不同時,

則出現(xiàn)沉淀線之交叉；兩種抗原部分相同時，則出現(xiàn)沉淀線的部分融

合。見圖3。

圖3雙擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果示意圖

A：已知抗體a、b：陽性對照

c^d、e、f：被檢材料

②抗原濃度與沉淀先導(dǎo)形狀的關(guān)系：兩相鄰抗原濃度相同，形成對稱

相融合的沉淀線；如果兩抗原濃度不同，則沉淀線不對稱，移向低濃

度的一邊。見圖4。

圖4抗原特異性與沉淀線形狀的關(guān)系

a、b：抗體A、A'、B：抗原

A、B完全不同A、A'部分相同

③溫度對沉淀線的影響：在一定范圍內(nèi)，溫度擴(kuò)散快。通常反應(yīng)在

0-37℃下進(jìn)行。在雙向擴(kuò)散時，為了減少沉淀線變形并保持其清晰度,

可在37℃下形成沉淀線，然后置于室溫或冰箱（4℃）中為佳。

④瓊脂濃度對沉淀線形成速度的影響：一般來說，瓊脂濃度越大，沉

淀線出現(xiàn)越慢。

⑤參加擴(kuò)散的抗原與抗體間的距離對沉淀線形成的影響：抗原、抗體

相距越遠(yuǎn)，沉淀線形成的越慢，所以在微量玻片法時，孔間距離以

0.25-0.5cm為好，距離遠(yuǎn)影響反應(yīng)速度。當(dāng)然孔距過遠(yuǎn)，沉淀線的密

度過大，容易發(fā)生融合，有礙對沉淀線數(shù)目的確定。

⑥時間對沉淀線的影響：沉淀線形成一般在1-3天出現(xiàn)，14-21天出

現(xiàn)的數(shù)目最多。玻片法可在1-2小時出現(xiàn)，一般觀察72小時，放量

過久可出現(xiàn)沉淀線重合消失。

（三）對流免疫電泳試驗(yàn)

對流免疫電泳是在瓊脂擴(kuò)散基礎(chǔ)上結(jié)合電泳技術(shù)而建立的一

種簡便而快速的方法。此方法能在短時間內(nèi)出現(xiàn)結(jié)果，故可用于快速

診斷，敏感性比雙向擴(kuò)散技術(shù)高10-15倍。

血清蛋白在PH8.6條件下帶負(fù)電荷，所以在電場作用下都向E極移動。

但由于抗體分子在這樣的PH條件下只帶微弱的負(fù)電荷，而且它的分

子量又較大（為r球蛋白）。所以游動慢。更重要的是抗體分子受電滲

作用影響較大，也就是說點(diǎn)滲作用大于它本身的遷移率。所謂電滲作

用是指在電場中溶液對于一個固定固體的相對移動。瓊脂是一種酸性

物質(zhì)，在堿性緩沖液中進(jìn)行電泳，它帶有負(fù)電荷，而與瓊脂相接觸的

水溶液就帶正電荷，這樣的液體便向負(fù)極移動?？贵w分子就是隨著帶

正電荷的液體向負(fù)極移動的。而一般的蛋白質(zhì)（如血清抗原）也受電滲

作用的影響，使泳動速度減慢，但它的電泳遷移率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于電滲作用。

這樣抗原體就達(dá)到了定向?qū)α?在兩者相遇且比例合適時便形成肉眼

可見的沉淀線。

材料：

1.診斷血清：免抗人免疫血清

2.待檢血清：人血清

3.陰性對照血清

4.PH8.6,離子強(qiáng)度0.05M的巴比妥緩沖液配置

巴比妥鈉10.3克

巴比妥1.84克

蒸儲水1000毫升

5.緩沖瓊脂板：將純化的瓊脂用PH8.6離子強(qiáng)度0.025的巴比妥緩

沖液（用0.05M的巴比妥緩沖液稀釋一倍即可）配成1.5%的瓊脂，加入

0.01-0.02%流柳汞防腐，保存冰箱內(nèi)備用。

6.電泳儀

7.其他：生理鹽水、打孔器、微量進(jìn)樣器。

方法：

1.瓊脂板的制備根據(jù)需要可選用大玻板（6厘米又9厘米）和（小玻片）

兩種。大玻板約需瓊脂10毫升，小玻片約需3.5毫升，凝固后按圖

打孔，方法同瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

2.加樣：左側(cè)孔內(nèi)加患者血清（原血清及10倍稀釋血清各占一孔），

右側(cè)內(nèi)加抗血清，每片應(yīng)有陽性對照。

圖5對流免疫電泳抗原孔、抗體孔位置示意圖

3.電泳

用國產(chǎn)普通電泳儀。其內(nèi)加0.05mPH8.6的巴比妥緩沖液，加至電泳

槽高度的三分之二處，注意兩槽內(nèi)液面盡量水平。將加好樣品的玻板

置于電泳槽上，抗原端接負(fù)極，抗體端接正極，用2—4層濾紙浸濕

作鹽橋，濾紙與瓊脂板聯(lián)接處為0.5厘米。以板寬度計算電流，以板

的長度計算電壓。要求電流量為2—3毫安/厘米，即大板為20毫安,

小板為10毫安。電壓為4一6伏/厘米。通電45分鐘一2小時后觀察

結(jié)果。

4.結(jié)果觀察：在黑色背景上方，用散射光多個角度觀察，在對孔之

間有白色沉淀線即為陽性對照應(yīng)出現(xiàn)明顯的白色沉淀線。如果抗原，

兩極微沉淀條紋不清晰，于37℃保溫數(shù)小時可增強(qiáng)沉淀條紋的清晰

度。

5.影響結(jié)果的因素

(1)抗原抗體的比例：抗原抗體比例適應(yīng)時容易出現(xiàn)沉淀帶，反

之不易發(fā)生。當(dāng)抗體濃度恒定時，被檢血清含甲胎蛋白濃度高時，作

10倍、20倍或更高倍數(shù)稀釋可以提高陽性率。隨稀釋度的增加，抗

原抗體的比例發(fā)生變化，沉淀線由靠近抗血清孔向逐步移向兩孔中

間，并可出現(xiàn)不典型的沉淀線如弧形、八字須形、斜線形，這些也是

陽性，應(yīng)予注意。

(2)幾組電泳緩沖液其電泳結(jié)果以巴比妥鈉一鹽酸緩沖液靈敏

度最高。巴比妥一巴比妥鈉次之。Tris緩沖液更差。

（3）電壓與電流時電泳時間需要長些：電壓電流增大時，電泳時

間可更短。但電壓過高則孔徑變形，電流過大抗原抗體蛋白易變性,

干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一般選擇每厘米5毫升，電泳時間改為1.5小時。

（四）免疫電泳實(shí)驗(yàn)

免疫電泳實(shí)驗(yàn)是先將抗原物質(zhì)在瓊脂凝膠中做電泳分離,然后于凝膠

槽中加入抗體血清。使抗原抗體進(jìn)行雙向擴(kuò)散，在比例適宜部位形成

特異的抗原抗體沉淀弧線。每條沉淀弧線代表一組抗原抗體復(fù)合物,

故可用抗原成分分析;且可以根據(jù)其遷移率與抗體所出現(xiàn)的特異反應(yīng)

進(jìn)行鑒定。

材料：

1.待檢標(biāo)本（抗原）：正常人血清。

2.抗體：正常人血清的家兔免疫血清。

3.1.5%離子瓊脂（系用巴比妥緩沖液配制的）

4.電泳儀

5.巴比妥緩沖液：

巴比妥1.84克

巴比妥鈉10.3克

蒸儲水1000毫升

PH8.6,離子強(qiáng)度（M）0.05

6.其它：載物玻片，直徑3毫米打孔器，20mmx2mm玻璃鑄型，

微量進(jìn)樣器。

方法：

1.取載物玻片（7.5x2.5厘米）加上3.5毫升1.5%瓊脂凝膠，制成2毫

米厚的瓊脂板。

2.按圖位置，在瓊脂板未凝固時，放入抗血清槽鑄型，注意勿使鑄型

全部浸入瓊脂中，待凝固時再打孔。

3.加待檢標(biāo)本：用微量進(jìn)樣器往孔中加1—5微升。

4.電泳：電壓9一7伏/厘米，泳動15—20小時。

5.電泳后取出抗血清槽鑄型，加入抗血清，進(jìn)行雙擴(kuò)散，一般在24

小時內(nèi)沉淀弧出全。

6.觀察結(jié)果：或描繪、拍照或進(jìn)行染色，染色后的標(biāo)本便于結(jié)果分

析及保存。

圖6免疫電泳抗原孔和抗體槽位置示意圖

（五）火箭電泳試驗(yàn)

火箭電泳實(shí)際是一種定量免疫電泳。其原理為：在電場作用下，抗原

在含定量抗體的瓊脂介質(zhì)中泳動,二者比例在合適時在較短時間內(nèi)形

成狀似火箭或錐形的沉淀線，而此沉淀線的高度常與抗原量成正比關(guān)

系，因此本法可以測定樣品中抗原的含量。

材料：

1.診斷血清（抗體）：抗人IgG或IgA免疫血清

2.待檢血清（抗原）：人血清

3.參考血清

4.pH8.6,離子強(qiáng)度0.05M巴比妥緩沖液配制（見對流免疫電泳試驗(yàn)）

5.其它：瓊脂粉，微量進(jìn)樣器，打孔器，玻璃板，電泳儀

方法：

1.抗體瓊脂板的制備

同單向擴(kuò)散法，但注意稀釋液應(yīng)用PH8.6離子強(qiáng)度0.05M的巴比妥

緩沖液。

2.打孔見下圖

圖7火箭電泳抗原孔位置圖

3.將用緩沖液稀釋的適宜濃度的參考血清及適當(dāng)稀釋的抗原（人血清）

分別加入各孔中，每孔10或20微升，要求加量準(zhǔn)確而不外溢。

4.把加完樣的免疫瓊脂板放入電泳槽中進(jìn)行電泳，電壓4—6伏/厘

米，電泳時間1—5小時，直到大部分抗原孔前端出現(xiàn)頂端尖窄而完

全閉合的火箭狀沉淀線，關(guān)閉電源。

5.取下瓊脂板，以抗原孔中心為起點(diǎn)，量出各火箭狀沉淀線的高度。

同單向瓊脂擴(kuò)散法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出待檢血清中1g含量。

實(shí)驗(yàn)三凝集反應(yīng)

當(dāng)顆粒性抗原與其相應(yīng)抗血清混合時，在有一定濃度的電解質(zhì)環(huán)境

中，抗原凝集成大小不等的凝集塊，叫做凝集反應(yīng)。

凝集反應(yīng)廣泛地應(yīng)用于疾病的診斷和各種抗原性質(zhì)的分析。即可用已

知免疫血清來檢查未知抗原，亦可用已知抗原檢測特異性抗體。

直接凝集反應(yīng)

顆?？乖c抗體直接結(jié)合出現(xiàn)凝集現(xiàn)象叫直接凝集反應(yīng)。

（一）玻片凝集反應(yīng)

材料：

1.診斷血清：1:10稀釋的傷寒桿菌診斷血清

2.菌種：傷寒桿菌、痢疾桿菌24小時瓊脂斜面培養(yǎng)物

3.生理鹽水、載玻片、毛細(xì)吸管

方法：

1.取清潔玻片一張，用蠟筆劃為三格，并注明號碼。無菌操作下，

用接種環(huán)于1、2格內(nèi)加1：10稀釋傷寒桿菌診斷血清1-2滴，第三

格加1-2滴生理鹽水。

2.無菌操作下，用接種環(huán)取傷寒桿菌培養(yǎng)物少許，混于第三格中，

再混于第一格中（不能先混第一格再混第三格，因?yàn)檫@樣將使診斷血

清混入鹽水而影響對照結(jié)果），將細(xì)菌與鹽水或血清混合均勻使呈乳

狀液。此時取菌量不可過多，使懸液呈輕度乳濁即可。

3.同法取枯草桿菌培養(yǎng)物少許，于第二格內(nèi)混勻。

4.輕輕搖動玻片，經(jīng)1-2分鐘后肉眼觀察，出現(xiàn)乳白色凝集塊者，

即為陽性反應(yīng)；仍為平等的乳濁液者，即為陰性反應(yīng)。如結(jié)果不夠清

晰，可將玻片放于低倍顯微鏡下觀察。

（二）試管凝集反應(yīng)

為一種定量試驗(yàn)，用已知抗原檢查血清中有無特異抗體，并測定其

相對含量。

材料：

1.診斷血清1:10稀釋傷寒桿菌“H”血清，1：10稀釋傷寒桿菌“O”

血清。

2.菌液：傷寒桿菌“H”菌液，傷寒桿菌“O”菌液。

3.生理鹽水，小試管，吸管。

方法：

1.取潔凈小試管14只分兩排排列于試管架上，每排7只依次用蠟筆

注明號碼，于每管中分別加入0.5毫升生理鹽水。

2.在第1排1管中加入1：10稀釋傷寒H血清0.5毫升，于管內(nèi)連

續(xù)吹吸3次，使血清與鹽水充分混合，而后吸出0.5毫升注入第2管,

同樣予以混勻后吸出0.5毫升注入第3管。依次類推，稀釋到第6管，

自第6管吸出0.5毫升棄去。此時，自第1管至第6管的血清稀釋倍

數(shù)為1:20,1：40,1；80,1：160,1：320,1:640。第7管不加

血清作為對照。

3.同法用吸管吸取1:10稀釋傷寒桿菌。血清加入第2排第1管，

并依次如上法予以稀釋。

4.用移液管吸取傷寒桿菌H菌液,加收第1排各管中每管0.5毫升（由

鹽水對照管開始，依次由后向前加入）此時血清稀釋倍數(shù)又增加了一

倍。

5.同法于第2排各管中加入傷寒。菌液0.5毫升。

6.將各管振蕩混勻，放37℃水浴箱中2—4小時或37℃孵育箱中過

夜次日取出觀察結(jié)果。

觀察結(jié)果：

1.觀察切勿搖動試管，以免凝集塊分散。

2.先看對照管，此管應(yīng)無凝集現(xiàn)象，管內(nèi)液體仍成混濁狀態(tài)。但如

放置時間較長，細(xì)菌堆于管底成小圓點(diǎn)狀，為陰性反應(yīng)。

3.試驗(yàn)管應(yīng)自第1管看起，如有凝集時則于管底有不同大小的圓片

狀邊緣不整齊的凝集物，上清則澄清透明或不同程度混濁。凝集的強(qiáng)

弱可用“+”號表示如下：

“++++”凝集很強(qiáng)，管內(nèi)液體完全澄清，凝集塊完全沉于管底；

“+++”凝集強(qiáng)，管內(nèi)液體不完全澄清稍有輕度混濁,凝集塊沉于管底;

“++”凝集中等強(qiáng)度，液體半澄清，凝集塊沉于管底；

“+”凝集弱，管內(nèi)液體混濁，少量凝集塊沉于管底；

“一”不凝集，管內(nèi)液體和對照管同樣混濁，無凝集塊。

4.輕輕振蕩各管，觀察凝集塊的狀態(tài)，對照管的細(xì)菌在振蕩時呈煙

霧狀上升，隨即消散，細(xì)菌分散仍呈混濁狀態(tài)。“H”菌液的凝集塊

疏松呈棉狀，大片沉于管底輕搖即升起，并極易破碎?！?”菌液凝

集呈緊密顆粒狀，沉于管底堅實(shí)致密，輕輕振搖不易升起，凝集顆粒

較小不易搖碎。

5.記錄觀察的結(jié)果并制定凝集效價。通常以能產(chǎn)生明顯凝集（++）的

血清大稀釋倍數(shù)作為該血清的凝集效價。如血清的最低稀釋度（即第

1管1：40）仍無凝集應(yīng)報告為低于1：40o如血清的最高稀釋度（即第

6管1：1280）仍顯完全凝集現(xiàn)象。，應(yīng)報該血清效價高于1:1280o

二.間接凝集反應(yīng)

將可溶性抗原吸附于一種與免疫無關(guān)的顆粒載體上，然后與相應(yīng)的抗

體結(jié)合，也可出現(xiàn)顆粒載體的凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應(yīng)。間接凝

集反應(yīng)比直接凝集反應(yīng)敏感性為高，可用于微量抗體或抗原的檢查。

（一）間接血球凝集試驗(yàn)

間接血球凝集試驗(yàn)是根據(jù)紅血球表面的吸附作用而建立起來的。將細(xì)

菌可溶性抗原提出使之吸附于紅血球表面，此時紅血球即稱為“致敏

紅血球這種致敏的紅血球具有細(xì)菌的抗原性，與相應(yīng)的抗血清相

遇可產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。

間接血凝抗原的制備可用加堿或加熱的方法使菌體中的多糖物質(zhì)浸

出，去除類脂以免干擾紅血球的吸附作用。但如系蛋白質(zhì)時則用來吸

附的紅血球需先用糅酸予以處理。

材料：

1.抗原一傷寒桿菌?？乖?/p>

2.免疫血清：傷寒桿菌0901免疫兔血清

3.25%綿羊紅血球懸液，生理鹽水，試管吸管等

方法：

L“0”抗原的制備：

將每毫升100億的傷寒桿菌“O”菌懸液，置100C水浴中2小時，

離心沉淀吸取上清夜，分裝無菌試管，放4c冰箱備用。

2.致敏紅血球懸液制備：

取一定稀釋度的抗原加等量2.5%綿羊紅血球懸液，混合后放37c水

浴箱中，每隔15分鐘取出振搖一次，共經(jīng)2小時。然后取出，用生

理鹽水洗滌3次，而配制成0.5%懸液即成。

3.試驗(yàn)步驟：

(1)小試管9只標(biāo)好號碼于試管架上。

(2)第1管加入0.9毫升生理鹽水，其余各管各加入0.5毫升。

⑶以吸管吸取已加熱滅菌的免疫血清0.1毫升加入第1管，混勻后吸

取0.5毫升注入第2管，同樣第2管的血清與鹽水混勻后吸取0.5毫

升注入第3管。如此依次稀釋直至第8管。自第8管吸出0.5毫升棄

去。第9管不加血清作對照。

⑷于每管加入0.5毫升已經(jīng)致敏的0.5%綿羊紅血球懸液，混勻后放

入37℃水浴中2小時后觀察結(jié)果。凡最高血清稀釋度的免疫血清試

管中呈現(xiàn)完全血凝者，即為該血清的間接血清效價。

(二)間接凝集抑制試驗(yàn)

若使可溶性抗原與相應(yīng)抗體先混合，充分作用后再加入有關(guān)的免疫微

球，因抗體已被可溶性抗原結(jié)合,不再出現(xiàn)免疫微球的被動凝集現(xiàn)象,

叫間接凝集抑制試驗(yàn)，臨床化驗(yàn)檢查中常用的免疫妊娠試驗(yàn)就是一種

間接凝集抑制試驗(yàn)。

妊娠試驗(yàn)：

孕婦尿中絨毛膜促性腺激素的含量比正常尿高。因此當(dāng)往尿中加入抗

絨毛膜促性腺激素抗體時，由于發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果，抗體被消

耗，此時再往尿中加入膠乳抗原（吸附有人類絨毛膜促性腺激素的聚

苯乙烯乳膠顆粒）。不發(fā)生反應(yīng)，抗原仍呈乳狀液體，即為妊娠試驗(yàn)

陽性。反之，被檢尿中絨毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）不足以

把加入的抗體消耗，當(dāng)膠乳抗原加入后，抗體便與抗原結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。

出現(xiàn)均勻細(xì)小顆粒，妊娠試驗(yàn)為陰性。

材料：

1.抗原：吸附有人類絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯抗原

2.抗體：抗人類絨毛膜促性腺激素抗體血清

3.被檢材料：孕婦尿

4.正常尿作對照用

5.黑反應(yīng)板1塊

6.滴管3只

方法：

1.用清潔滴管在反應(yīng)板上滴加一滴被檢尿。

2.再往尿滴加抗血清一滴，輕輕搖動，充分混勻。

3.滴加一滴膠乳抗原，緩慢搖動3—5分鐘，在較強(qiáng)光線下，觀察結(jié)

果。出現(xiàn)均勻一致的細(xì)小顆粒為陰性反應(yīng)，懷孕。

注意事項：

1.試驗(yàn)材料用具用前使溫度接近室溫（20℃左右）

2.被檢尿太混濁，需要小心過濾。

3.尿中有蛋白及血液時，不宜進(jìn)行此試驗(yàn)。

（三）協(xié)同凝集試驗(yàn)

金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁成分中的A蛋白能與人及多種哺乳動物（豬、

兔、羊、鼠等）血清中IgG類抗體的Fc段結(jié)合。IgG的Fe段與SpA

結(jié)合后，兩個Fab段暴露在葡萄球體表面，仍保持其抗體活性和特異

性當(dāng)其與特異性抗原相遇時，也出現(xiàn)特異凝集現(xiàn)象。在以凝集反應(yīng)中，

金黃色葡萄球菌菌體成了IgG抗體的載體，稱為協(xié)同凝集反應(yīng).本反應(yīng)

也可用于檢測微量抗原.

A.材料：

1.抗原:可溶性傷寒桿菌0抗原

2.免疫血清：傷寒桿菌0901免疫兔血清

3.10%CoWanl株金黃色葡萄球菌（含大量蛋白A）的菌液

4.PBS0.5%甲醛PBS,吸管、滴管、玻片等

B.方法：

1.10%葡萄球菌菌懸液的制備：CoWanl株葡萄球菌接種于柯氏瓶，

37℃培養(yǎng)18-24小時，用PBS洗下菌苔，每分鐘2500轉(zhuǎn)速度離心20

分鐘。沉淀菌用PBS洗兩次后，用0.5%甲醛（用PBS配置）在室溫中固

定3小時。置于80℃水浴中4分鐘以破壞菌體的自源性分解酶。再

用PBS洗滌2次后配成10%菌懸液。

2.致敏葡萄球菌：

1毫升10%的菌懸液加0.1毫升傷寒O抗血清充分混合放入37c水

浴中30分鐘（中間需搖動兩次）。取出后經(jīng)每分鐘2500轉(zhuǎn)速度離心20

分鐘，棄去上清液，沉淀菌用PBS洗滌2次后配成10%菌懸液。

3.協(xié)同凝集試驗(yàn)

?取傷寒“O”可溶性抗原一滴致敏葡萄球菌懸液，一滴在載波片上

混勻，觀察約2分鐘。一般在幾秒鐘內(nèi)即可發(fā)生凝集。

?滴一滴致敏葡萄球菌懸液于玻片上，用接種環(huán)取傷寒O菌培養(yǎng)物

少許置于懸液中使成均勻孔狀，觀察約2分鐘，記錄有無凝集。

?用傷寒“O”桿菌培養(yǎng)物與未致敏的葡萄球菌菌液或用痢疾桿菌培

養(yǎng)物與致敏的葡萄球菌菌液作玻片凝集,均為陰性反應(yīng),不出現(xiàn)凝集。

三.凝集吸收

腸道桿菌中的許多細(xì)菌都有部分相同的抗原結(jié)構(gòu)。因之一種細(xì)菌可與

另一種細(xì)菌相應(yīng)的抗血清發(fā)生交叉凝集反應(yīng)。用一種過量的細(xì)菌抗原

與發(fā)生交叉凝集反應(yīng)的抗血清相結(jié)合?？蓪⑵涔餐贵w吸去，剩下抗

體只能與特異性抗原起反應(yīng)，這種試驗(yàn)即稱凝集吸收試驗(yàn)。

利用凝集吸收試驗(yàn)可制備單價因子血清，以進(jìn)行細(xì)菌抗原結(jié)構(gòu)的分析

及鑒定菌型。

材料：

免疫血清：1:10稀釋傷寒桿菌免疫血清。

菌液：腸炎桿菌菌液，傷寒桿菌菌液。

試管、吸管、毛細(xì)吸管。

方法:

1.Vio稀釋傷寒桿菌免疫血清分別與腸炎桿菌與傷寒桿菌進(jìn)

行玻片凝集，可見傷寒免疫血清與兩種菌均有凝集，說明二菌具有共

同抗原結(jié)構(gòu)，故發(fā)生交叉凝集反應(yīng)。

2.將一定量的腸炎桿菌菌液加入1:10稀釋傷寒桿菌免疫血清

中，放37℃水浴箱中作用2小時，取出后離心沉淀，吸取上清夜，

棄去沉淀。

3.將吸收過的上清夜與稀釋腸炎桿菌菌液做玻片凝集，觀察結(jié)

果。如仍有凝集時則將此上清夜再加濃腸炎桿菌菌液進(jìn)行吸收，方法

如上。

4.重復(fù)吸收過的上清夜分別與稀釋腸炎桿菌及傷寒桿菌菌液

進(jìn)行玻片凝集。如與前者無凝集而與后者有凝集，則表示傷寒桿菌免

疫血清中的抗腸炎抗體已被完全吸收。

實(shí)驗(yàn)四溶血反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

—.溶血反應(yīng)

免疫血清與其相應(yīng)的抗原細(xì)胞（血球、細(xì)菌及其組織細(xì)胞相遇，并在

補(bǔ)體的參與下可出現(xiàn)溶細(xì)胞反應(yīng)。依抗原、抗體的種類不同可有溶血

反應(yīng)、溶菌反應(yīng)等。

溶菌反應(yīng)只在某些細(xì)菌中出現(xiàn)（如霍亂弧菌）。應(yīng)用溶血反應(yīng)是補(bǔ)體結(jié)

合反應(yīng)中不可少的因素。溶血反應(yīng)是由于抗原（紅血球）和抗體（溶血素）

進(jìn)行特異性的結(jié)合，并吸著了補(bǔ)體，而使紅血球在補(bǔ)體的作用下被溶

解，于是產(chǎn)生了溶血現(xiàn)象。

材料：

1.抗原：2%綿羊紅血球。

2.抗體：溶血素

3.補(bǔ)體：取健康豚鼠血清作為補(bǔ)體。

4.小試管、生理鹽水、水浴箱。

方法：

1.取小試管3只，按下表加入各物（容量單位為毫升）

試管2%紅血球溶血素（2單位）補(bǔ)體（2單位）生理鹽水結(jié)果

0.5

20.40.5——1.0

30.5——0.51.0

2.將上述3試管放在37℃水浴箱內(nèi)15-30分鐘觀察有無凝血現(xiàn)象。

二.補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)

當(dāng)抗原與其對應(yīng)的抗體結(jié)合時,所生成的抗原抗體復(fù)合物能從溶液中

將補(bǔ)體吸著此即謂補(bǔ)體結(jié)合。參與補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的抗原是透明的溶

液，故補(bǔ)體結(jié)合現(xiàn)象不能被肉眼看出來，因此必須借助溶血系統(tǒng)（溶

血素及相對應(yīng)的羊血球）作為指示劑，來判定媒質(zhì)中有無游離的補(bǔ)體,

近而推定媒質(zhì)中未知抗原（或抗體）和已知抗體（或抗原）是否進(jìn)行了特

異性的結(jié)合。本反應(yīng)具有很高的敏感性及特異性，因之常應(yīng)用于傳染

病的診斷，特別診斷病毒疾病和梅毒。

由于參與本反應(yīng)的各種成分間有著一定量的關(guān)系，因此在作本試驗(yàn)

之前，必須通過一系列的預(yù)備實(shí)驗(yàn)來確定各成分的使用量，故本反應(yīng)

的實(shí)驗(yàn)方法較為復(fù)雜。

本次實(shí)驗(yàn)以傷寒桿菌免疫血清與其相對應(yīng)的抗原補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)為例。

材料：

1.抗原：傷寒的抽出液

2.抗體：傷寒桿菌的免疫血清

3.補(bǔ)體：豚鼠血清

4.溶血素：抗綿羊血細(xì)胞的兔血清

5.2%綿羊紅血球

6.小試管、試管架、水浴鍋。

方法：

（一）預(yù)備試驗(yàn)（示教說明）

預(yù)備試驗(yàn)包括溶血素效價的滴定，補(bǔ)體效價的滴定，抗原效價的滴定

及被檢血清的處理。

（1）溶血素效價的滴定

按照下表加入各物

管號溶血素(ml)溶血素

稀釋倍數(shù)1：20

補(bǔ)體(ml)生理

鹽水(ml)2%羊血球(ml)假定結(jié)果

10.51：300搖勻后置37℃水浴一小時全溶解

20.51：500全溶解

30.51：800全溶解

40.51：1000全溶解

50.51：1200全溶解

60.51：1600全溶解

70.51：2000全溶解

80.51：2400全溶解

90.51：3200全溶解

100.51：4000

110.51：4800

120.51：6000

對照

凡最高稀釋度的溶血素可呈現(xiàn)完全溶血者為一個單位。依上表結(jié)果第

10管（即1:4000倍稀釋）0.5毫升溶血素為一個單位，在溶血反應(yīng)中

常用0.5毫升中含有2個溶血素單位的溶液，所以試驗(yàn)時應(yīng)取1:2000

倍稀釋的溶液。

(2)補(bǔ)體單位滴定

依下表加入各試劑：

管

號補(bǔ)體

(1：20)(ml)抗原

(ml)生理鹽水(ml)置

于

37

℃

水

浴

45

分鐘溶血素

(2單位)(ml)2%羊血球懸液(ml)置

于

37

℃

水

浴

15

分鐘結(jié)果

00.50.5不溶血

50.50.5稍溶血

30.300.5全溶血

40.30.5全溶血

50.400.5全溶血

60.450.51.050.50.5全溶血

70.500.51.000.50.5全溶血

8-0.51.500.50.5不溶血

能引起完全溶血的最小補(bǔ)體量稱為準(zhǔn)確單位，上表中第3管(即0.3

毫升)，但因補(bǔ)體的效價可能有部分損失，故普通稍高的一管為實(shí)用

單位，實(shí)際試驗(yàn)時須用兩個實(shí)用單位。

上表的結(jié)果為：

補(bǔ)體標(biāo)準(zhǔn)單位：03毫升

補(bǔ)體實(shí)用單位：0.35毫升

補(bǔ)體兩個實(shí)用單位：0.70毫升

因試驗(yàn)時是兩個實(shí)用單位的補(bǔ)體0.5毫升，可依下列比例關(guān)系換算：

20：0.7=x：0.5

x=14.3

即須將補(bǔ)體稀釋14.3倍,用0.5毫升則含有兩個實(shí)用單位。

(3)抗原的滴定

在用已知抗原測定未知抗體時,必須先滴定抗原效價以決定本試驗(yàn)時

所需抗原的最適濃度（反之用已知抗體測定未知抗原時，則需滴定抗

體效價）

試管號

劑123456

1:5稀釋血清------

傷寒抗原2U0.5----0.5-----

痢疾抗原1:80—0.5----------

補(bǔ)體2U

生理鹽水——1.5

搖勻放置37℃水浴中30min

溶血素2U0.50.5—

2%羊血球

搖勻放置37℃水浴中15min

說明試驗(yàn)管特異性對照血清

對照抗原

對照溶血素對照羊血球?qū)φ?/p>

如血清對照管呈完全或部分不溶血是為抗補(bǔ)體現(xiàn)象。血清嚴(yán)重污染細(xì)

菌，混有淋巴液或顯著溶血時，常產(chǎn)生很強(qiáng)抗外體作用。又如試管、

吸管不清潔，也可出現(xiàn)抗補(bǔ)體。若有抗補(bǔ)體發(fā)生，應(yīng)抽血重試驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)五T、B淋巴細(xì)胞分離試驗(yàn)

淋巴細(xì)胞主要分T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞兩大亞群，它們具有不同

的特性和功能，為此在進(jìn)行某些免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)時，首先需分離出純的T

淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。本試驗(yàn)的原理為：淋巴細(xì)胞與用溟花二氨

基異硫氫化物(簡稱AET)處理的綿羊紅細(xì)胞(SRBC)混合后，其中全部T

淋巴細(xì)胞均能吸附AET—SRBG形成牢固穩(wěn)定而巨大的E—花環(huán)，較

正常未處理的SRBC形成的E一花環(huán)百分比為高，而且形成快速，不

易脫落，重復(fù)性好。再經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離時，AET-E花環(huán)易沉

于管底，而未形成E一花環(huán)的T淋巴細(xì)胞，用低滲液解花環(huán)周圍的AET

—SRBC,便可獲得純T淋巴細(xì)胞，而B淋巴細(xì)胞可直接取自分層液

的界面。

材料及試劑：

a)新鮮豚鼠血

b)兔紅細(xì)胞(RRBC)

c)溟花二氨基異硫氫化物(AET)

d)淋巴細(xì)胞分層液

e)其它Hanks液，含小牛血清的199培養(yǎng)液，無菌生理鹽

水，3.5%氯化鈉溶液，離心機(jī)等。

方法:

1.AET—RRBC制備

⑴.AET溶液的制備

稱取AET粉劑402毫克，溶于10毫升蒸饋水中，使成為0.143M溶

液，用4NNaOH溶液調(diào)pH9.0。該溶液必須新鮮配制，不宜久存。

（2）.AET處理RRBC

取洗滌好壓積的RRBC,按一份壓積AET—RRBC加入4份新鮮配制的

PH9.0的AET溶液充分混勻置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一

次。取出加冷無菌生理鹽水至離心管口（1—2厘米）1800轉(zhuǎn)/分離心5

分鐘。連續(xù)洗滌3—5次，每洗一次，必須充分搖勻，以減少AET一

RRBC粘附成團(tuán)，并觀察有無溶血。若有溶血現(xiàn)象，則用含小牛血清

的199培養(yǎng)基再洗一次，最后配成10%AET—RRBC懸液，置4℃保存，

不得超過5天。

（3）.1%AET—RRBC的配制：

將預(yù)先配制并保存于4℃冰箱的10%濃度的AET—RRBC,以含10%小

牛血清的199培養(yǎng)液稀釋至1%O

2.從新鮮豚鼠血液分離單個核細(xì)胞，操作見后試驗(yàn)。

3.AET—E花環(huán)試驗(yàn)：

將分離的單個核細(xì)胞（2X10&毫升）與等量1%AET—RRBC混合，置

37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次，分裝數(shù)管，每管2-3毫升,

低速離心（1000轉(zhuǎn)/分鐘）5分鐘后，移至4c冰箱45分鐘。

4.T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的分離

將形成E一花環(huán)的細(xì)胞懸液，再用淋巴細(xì)胞分層液分離，吸取界面云

霧狀的細(xì)胞，即為富含B淋巴細(xì)胞群。沉淀于管底的E—花環(huán)，用

Hanks液洗一次后，加雙蒸水3毫升處理3分鐘，低滲裂解E—花環(huán)

周圍的RRBC,立即加3.5%氯化鈉溶液1毫升，使還原為等滲，低速

離心沉淀，即得富含T淋巴細(xì)胞群。

實(shí)驗(yàn)六豚鼠T淋巴細(xì)胞的測定

——兔紅細(xì)胞玫瑰花環(huán)試驗(yàn)

玫瑰花環(huán)試驗(yàn)，又稱為花結(jié)試驗(yàn)。是測定淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的一種

方法。

人類T和B淋巴細(xì)胞表面具有不同的受體。由于人類T淋巴細(xì)胞表面

具有與綿羊紅細(xì)胞結(jié)合的受體，能與綿羊紅細(xì)胞非特異性結(jié)合，形成

E花環(huán)，因此，T細(xì)胞也成為紅細(xì)胞花瓣形成細(xì)胞。根據(jù)E—玫瑰花

環(huán)形成率，可以間接判斷機(jī)體細(xì)胞免疫力。目前，已廣泛應(yīng)用于臨床,

作為測定人群免疫狀態(tài)的一個指標(biāo)。

材料：

肝素（100單位/毫升）

0.5%兔紅細(xì)胞懸液（用Hanks液配制）

3.吸收過的胎牛血清：

取經(jīng)56℃30分鐘加熱滅活后的胎牛血清加半量壓積兔紅細(xì)胞混合

后，37℃水浴20分鐘，2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液即成。

4.Hanks液

5.豚鼠抗凝血

6.淋巴細(xì)胞分層液

7.滅菌注射器，針頭，試管，吸管等。

方法：

1.淋巴細(xì)胞提取

⑴取豚鼠抗凝血2毫升，加3毫升Hanks液使之稀釋。

加于3毫升淋巴細(xì)胞分層液液面之上（沿管壁輕輕加入，勿使兩液相

混）。

（2）2000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，吸淋巴細(xì)胞層到另一試管中

加5倍體積的Hanks液洗1—2次，（1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘）棄上清

即成。

圖8用分層液離心后的血細(xì)胞層

2.加吸收過的胎牛血清0.1毫升，0.5%兔紅細(xì)胞懸液0.2

毫升，于淋巴細(xì)胞中?；旌虾?，37℃水浴5分鐘。

3.500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，放4c冰箱中2小時后，棄大部

分上清。

4.染色及觀察

輕輕懸浮沉積的細(xì)胞。向懸液中滴一滴美蘭液，混合，10分鐘后取

一滴放載玻片上，加蓋玻片鏡檢。

高倍鏡或油鏡下計數(shù)200個淋巴細(xì)胞,凡結(jié)合3個或3個以上的兔紅

細(xì)胞者為陽性，計算花環(huán)形成細(xì)胞的百分率。

實(shí)驗(yàn)七酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

（ELISA）測定傷寒桿菌“O”抗體

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是用酶標(biāo)記的抗體（或SPA）檢測未知抗原或抗體的

方法。此法敏感性高，特異性強(qiáng)。常用的是ELISA方法，間接法，雙

抗體法和抗原法。本次試驗(yàn)介紹，酶聯(lián)葡萄球菌蛋白A免疫分析法。

ELISA法原理如下，見圖9

圖9ELISA-SPA法原理

1.加抗原使之吸附于固相載體（如塑料反應(yīng)板）

2.洗滌加待測血清

3.洗滌加酶標(biāo)記SpA

4.洗滌加酶的底物。經(jīng)酶的催化產(chǎn)生有色產(chǎn)物。

材料：

1.聚乙烯塑料反應(yīng)板（PH9.6時可吸附蛋白Ag）

2.抗原：傷寒桿菌0901煮沸或超聲波粉碎抗原

3.待測血清

4.凍干酶聯(lián)葡萄球菌A蛋白（HRD-proteinA）純品

鄰苯二胺（OPD）

6.包被液：0.05IVI碳酸鈉一碳酸氫鈉溶液PH9.6

7.稀釋液：10%免疫血清PBS一吐溫20,防止非特異性吸

附

8.洗滌液：0.02MTrisTWeen20,Ph7.4防止非特異性吸附

9.底物溶液：0.02M磷酸氫二鈉25.7毫升

0.1M檸檬酸24.3毫升

蒸儲水50毫升

臨用前新鮮配制，在上述緩沖液中溶解40毫克鄰苯二胺，然后加入

30%雙氧水0.15毫升，底物對光敏感，需要避光并立即使用。

10.終止液；2M硫酸

方法：

1.抗原包被

取潔凈的聚苯乙烯微量反應(yīng)板，于每孔內(nèi)加傷寒抗原0.1毫升（用包

被緩沖液稀釋，蛋白含量10微克/毫升），置37cl小時，棄抗原液,

用洗滌液3次每次3分鐘。

2.加待測血清

于每孔內(nèi)分別加不同稀釋度（如1:5,1：10,1：20-1：80）的待測

血清，PBS空白對照，陰性對照血清，陽性對照血清各0.1毫升。置

37℃30分鐘，洗滌3次。

3.加酶聯(lián)A蛋白

于每孔加酶聯(lián)A蛋白各0.1毫升，置37℃20分鐘，洗滌3次。

4.加臨時配制的底物溶液各0.1毫升，置暗處15分鐘。加2M碳酸

1滴終止反應(yīng)。

5.結(jié)果判斷：（肉眼判斷）

若顏色于陰性對照相同則為陰性，若較陰性對照深則為陽性，根據(jù)顏

色深淺以（+）表示。

綜合設(shè)計性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一抗體產(chǎn)生細(xì)胞的檢測——溶血空斑實(shí)驗(yàn)

（綜合性實(shí)驗(yàn)）

取綿羊細(xì)胞免疫的小鼠脾臟，制成脾細(xì)胞懸液，與一定量的指示細(xì)胞

（綿羊細(xì)胞）和補(bǔ)體結(jié)合，注入自制的小室內(nèi)，經(jīng)37℃孵育后，單個散

在的抗體形成釋放抗體，抗體與周圍的綿羊紅細(xì)胞（抗原）結(jié)合，并在

補(bǔ)體參與下，使綿羊細(xì)胞溶解，結(jié)果在抗體形成細(xì)胞周圍形成肉眼可

見的圓形透明溶血區(qū)——溶血空斑。計算溶血空斑數(shù)目，則可推算脾

內(nèi)存在的抗體產(chǎn)生細(xì)胞總數(shù)。

材料：

1.20—22克健康小鼠

2.解剖器械

3.注射器，平皿，漏斗，紗布，研缽

4.20%綿羊紅細(xì)胞懸液

5.潔凈脫脂載玻片（75x25毫米），蓋玻片（22x22毫米）。

6.Ph7.2的Hanks液，凡士林油。

7.微量加樣器

8.指示細(xì)胞懸液，配制方法如下：

10%綿羊紅細(xì)胞0.5毫升

補(bǔ)體(新鮮豚鼠血清)0.5毫升

含5%小牛血清的Hanks液2毫升混合后水浴備用

方法：

1.免疫動物

取25%綿羊紅細(xì)胞懸液1毫升，無菌操作注入小鼠腹腔中

2.脾細(xì)胞液的制備

⑴小鼠免疫4天后，頸椎脫位處死，取脾臟，去除脂肪組織，放平

皿內(nèi)，用冷Hanks液洗1一2次。

(2)取出脾臟研缽中研碎，加Hanks液2—3毫升，用吸管反復(fù)吹打數(shù)

次，使細(xì)胞分散。將此細(xì)胞懸液經(jīng)4—8層紗布過濾，1500轉(zhuǎn)/分離

心5分鐘，棄上清。

如細(xì)胞太多，可加蒸儲水4毫升迅速混勻，半分鐘后立即加入等量

Hanks液混勻1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清。

⑶沉淀細(xì)胞用Hanks液洗1—2次，棄上清后，加Hanks液使總量達(dá)

5毫升。用乳頭吸管吹打使沉淀細(xì)胞懸起混勻，此即為50倍稀釋的

脾細(xì)胞。

⑷取此懸液0.1毫升放另一小試管中然后加0.9毫升Hanks液使成

500倍稀釋的脾細(xì)胞懸液。

*脾細(xì)胞懸液制備過程中應(yīng)在冰水浴中進(jìn)行。

3.玻片小室的制作

取潔凈（無油）的載玻片，按下圖粘三條透明膠帶，在膠帶上薄涂一層

凡士林（勿涂到小室內(nèi)），然后用鐐子取兩個蓋片，分別放在其上，制

成兩個小室。用鐐子尾端將蓋片壓平貼牢（保持小室一定體積）。用凡

士林將蓋片底端（其中的任一端）封住，頂端作為注入細(xì)胞混合液。

圖10玻片小室示意圖

4.細(xì)胞混合液的配制

取小試管一只，用1毫升吸管吸取0.2毫升指示細(xì)胞懸液，用另一吸

管吸取0.2毫升500倍稀釋的脾細(xì)胞懸液，混勻即為被檢的細(xì)胞混合

懸液。

5.混合細(xì)胞的灌注

用1003的微量加樣器吸取被檢細(xì)胞混合懸液，于小室開口一端輕輕

將液體注滿小室（勿使氣泡產(chǎn)生，勿使液體外溢），記錄實(shí)際注入的細(xì)

胞懸液微升數(shù)（約70ul）

每個樣品注2個小室，取其平均值。

6.用牙簽粘取少許凡士林益封小室開口。

7.將作好的標(biāo)本水平置濕盒中，放37℃溫箱中孵60分鐘

8.溶血空斑計數(shù)

肉眼觀察空斑并計數(shù)兩個小室出現(xiàn)的溶血空斑數(shù)。對模糊不清的空斑

可在低倍鏡下檢查，真正的溶血空斑必須中心有一個淋巴細(xì)胞，周圍

為透明區(qū)。

全脾臟中抗體產(chǎn)生細(xì)胞總數(shù)可依下述公式計算：

實(shí)驗(yàn)八抗原和免疫血清的制備

（設(shè)計性實(shí)驗(yàn)）

抗體是機(jī)體接受抗原刺激后產(chǎn)生的一種具有免疫特異性的球蛋白0在

免疫學(xué)實(shí)踐，為制備抗體常以抗原性物質(zhì)（細(xì)菌、病毒、類毒素、血

清及其他蛋白質(zhì)）給動物注射。經(jīng)過一定時間后，動物血清中可以產(chǎn)

生大量的特異性抗體。這種含有特異性抗體的血清稱為免疫血清。免

疫血清不但對傳染病的診斷、預(yù)防和治療有重要意義，而且對器官移

植，腫瘤以及某些科研工作也有重要意義。

抗體的產(chǎn)生通常與抗原的質(zhì)和量、動物種類以及接種途徑有密切關(guān)

系。因此在制備免疫血清時要根據(jù)抗原的不同選擇適宜的動物種類和

免疫方法。

抗菌血清的制備

材料：

1.動物：家兔

2.菌種：傷寒桿菌H901,傷寒桿菌0901

3.培養(yǎng)基：普通培養(yǎng)基

4.其它：0.5%甲醛鹽水，0.5%石灰酸鹽水，無菌生理鹽水,

標(biāo)準(zhǔn)比濁管，離心機(jī)。

方法：

1.抗原的制備：

標(biāo)準(zhǔn)菌株的選擇：所用的菌種傷寒桿菌H901和傷寒桿菌0901應(yīng)具

有典型形態(tài)菌落及生化反應(yīng)。在生理鹽水中不發(fā)生自身凝集，與特異

血清有高度凝集者可作為菌種。

2.菌液的制備

I.原液制備：

H菌液的制備:將合格的傷寒桿菌H菌株接種于普通瓊脂的克氏瓶或

大試管內(nèi)37℃孵育18—24小時。肉眼觀察有無雜菌生長，必要時作

鏡檢。用無菌甲醛生理鹽水洗下菌苔，將洗下液體裝入無菌試管內(nèi)，

置37℃恒溫箱18—24小時以殺菌。得到原液。用作無菌試驗(yàn)即將菌

液接種于肉湯及瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)4天，無活菌生長者才可使用。

0菌液的制備：將合格的傷寒桿菌H菌株依上法培養(yǎng)后，用無菌0.5%

石灰酸鹽水將菌苔洗下，洗液裝入無菌試管置于37℃溫箱中18—24

小時殺菌得原液。經(jīng)檢查無菌時可以使用(如無傷寒桿菌O菌株也可

用H菌株制備O抗原。即用0.5%石灰酸生理鹽水洗下H菌菌液置

100C水浴60分鐘，破壞其H抗原即為O菌液。

II.應(yīng)用液的制備：

合格的原液用標(biāo)準(zhǔn)比濁管計算含菌落數(shù)目后，用生理鹽水稀釋至每毫

升含菌10億。是為了應(yīng)用液加入適量甲醛使其為0.25%,制備好的

原液及應(yīng)用液均保存在2—10C冰箱中備用，有效期為1年。

菌液濃度的計算及稀釋法：

菌液的濃度可用麥克法倫特氏標(biāo)準(zhǔn)比濁法來測定，方法如下：

(1)分別配制1%硫酸溶液及1%氯化領(lǐng)溶液

(2)取口徑相等質(zhì)地相同的試管10支，依下表所示分別將硫

酸及氯化鋼溶液加入，封固管口，注明號碼備用。

管號12345678910

l%BaCI2(ml)0.70.80.91.0

l%H2SO4(ml)9.0

相當(dāng)菌數(shù)(億/ml)36912151821242730

⑶將洗下的細(xì)菌原液放入與比濁管相同的試管中并予以一

定稀釋。與標(biāo)準(zhǔn)比濁管相比較，視其濁度相當(dāng)于比濁管的第幾管，然

后將比濁管相當(dāng)菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即可得到每毫升中所含細(xì)菌的數(shù)

量。如細(xì)菌原液1:5稀釋后其濁度與第3管相當(dāng)，則原液每毫升含

菌數(shù)為9x5=45億。

⑷菌液的稀釋可按下列公式計算：

=所需加鹽水的毫升數(shù)

(原液毫升數(shù)X原液每毫升含菌數(shù))

欲得稀釋液濃度一原液毫升

如原液5毫升，每毫升含菌45億今欲稀釋為每毫升含菌10億的溶液

應(yīng)加生理鹽水的毫升數(shù)：(5義45)/(10-5)=17.5毫升

即細(xì)菌原液5毫升加生理鹽水17.5毫升稀釋即成。

3.免疫方法

(1)選擇體重2—3千克的健康雄兔2—3只，由耳靜脈采血1

毫升，分離血清。與進(jìn)行免疫用的細(xì)菌做凝集試驗(yàn)，測定有無天然凝

集素。如無或微量時，該動物可用于免疫。

（2）將已稀釋的抗原按以下劑量及程序注入兔耳靜脈。

日期第1天第5天第10天第15天第20天

注射劑量0.5mllmll.5ml2ml2.5ml

⑶末次注射后7天耳靜脈采血1毫升，分離血清。用上述菌

液作試管凝集試驗(yàn)，滴定抗菌血清中抗體的效價，效價在1：2000

以上可放血。若效價不高可再增量注射菌液1-2次，再行試血。試

血合格可頸動脈放血（方法見附錄）。分離血清，加入防腐劑（如萬分之

一的硫化汞）放4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

二.抗紅細(xì)胞抗體（溶血素）的制備

材料：

1.動物：家兔

2.紅細(xì)胞懸液

3.其它：無菌生理鹽水，保存液（阿氏液）等

方法：

2.紅細(xì)胞懸液的制備

⑴采血

采取的綿羊血與滅菌的保存液等量混合，置冰箱中，可保存數(shù)周，也

可用抗凝方法

（2）洗滌血球

先將抗凝血液離心沉淀（2000cpmx5分鐘）吸去上清。加入2—3倍的

生理鹽水并用毛細(xì)滴管反復(fù)吹打混勻，離心沉淀5分鐘,吸去上清液。

如此連續(xù)洗3次，最后一次可離心沉淀10分鐘以使血球密集管底。

直至上清液透明無色再吸去上清夜，留密集血球備用。洗滌4次則血

球變脆不適于使用。

⑶用生理鹽水將紅血球配成需要濃度，即為試驗(yàn)用的血球懸

液。如需10%血球懸液時，則吸取1毫升洗滌后的紅血球加生理鹽水

9毫升即成。

3.免疫方法

⑴選擇2—3千克健康雄兔，按如下劑量及程序免疫：

日期劑量(毫升)途徑

第1天全血0.5皮內(nèi)

第3天全血1.0皮內(nèi)

第5天全血1.5皮內(nèi)

第7天全血2.0皮內(nèi)

第9天全血2.5皮內(nèi)

第12天20%紅細(xì)胞懸液全血1.0靜脈

第15天20%紅細(xì)胞懸液全血.0靜脈

(2)末次注入后7天，耳靜脈采血1毫升，滴定血液單位達(dá)1:

2000以上可頸動脈放血，分離血清，放等量甘油防腐，分裝無菌安

瓶，貯于4℃中備用。

三.抗人血清抗體的制備

材料：

1.動物：家兔

2.人血清

3.羊毛脂、石蠟油、卡介苗。

4.其它：無菌生理鹽水，無菌研缽等。

方法：

1.弗氏佐劑的制備

將羊毛脂與石蠟油按1:5比例混合，高壓滅菌。

2.人血清——弗氏完全的制備

將滅菌佐劑一份置研缽中，邊研磨邊滴加等量的含卡介苗3-4毫克/

毫升的抗原液，使成油色水乳劑，研磨要充分，使乳劑滴入冰水中不

擴(kuò)散。

3.免疫動物

可采用一次性免疫法，即將抗原與佐劑制成的乳劑分多個點(diǎn)兔背部皮

膚，也可注入足底2—4針各0.45毫升，總量約3毫升，一個月后試

血。

四.菌脂多糖的制備

脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分，所以抗脂多糖抗體的制

備可用革蘭氏陰性細(xì)菌菌體抗原來制備，因此這里只介紹幾種細(xì)菌脂

多糖提取的方法。

（一）熱酚提取法

原理是將細(xì)菌懸液加于熱酸——水混合液中，冷卻，離心混合液可分

為水溶液層，內(nèi)含水溶性脂多糖及核酸等及酸層、內(nèi)含蛋白質(zhì)。近年

來發(fā)現(xiàn)在酸層中也含糖類。經(jīng)離心后沉淀含細(xì)胞殘體。

方法：

1.細(xì)菌濃懸液用鹽水經(jīng)2500轉(zhuǎn)/分，20分鐘離心洗滌一次。

2.將沉淀的菌混勻于蒸儲水中，放66℃水浴，然后滴加等

量的90%熱酚溶液（預(yù)熱至66℃）,邊加邊搖，而后在66c水浴中攪

拌25分鐘

3.在水浴中冷卻，于4℃冰箱過夜

4.以2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘

5.將上層水溶液吸到另一試管中

6.剩下的酚層及殘渣組分可再加上述同量水在熱水浴中攪

拌30分鐘，冷卻，離心，取上層水溶液。將兩次提的水溶液混合，

置透析袋中于生理鹽水中透析2天，其間換幾次鹽水，以除去酚。

7.透析后的水溶液層經(jīng)濃縮（如用聚乙二醇在透析袋外層

涂抹以除去水分）。即成粗制脂多糖，于冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

（二）超聲波處理法

方法：

1.獲得的菌液經(jīng)2500轉(zhuǎn)/分，20分鐘離心洗滌1一2次，將

沉淀配成2倍于濕菌濃度的濃菌液。

2.用超聲波發(fā)生器中頻（約相當(dāng)于12000cps）處理20分鐘。

3.處理液經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，吸取上清液即為脂

多糖抗原。置4c冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（三）煮沸法

方法：

將培養(yǎng)后得到的濃菌液沸水浴煮沸2小時。置冰箱靜置兩星期以上

（使菌體殘渣自由下沉）。3000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，取上清夜即為粗脂

多糖抗原，置冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

選做實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一機(jī)體的天然免疫機(jī)制

目的要求：

觀察機(jī)體的非特異免疫現(xiàn)象；加深理解機(jī)體的天然免疫機(jī)制。

基本原理：

機(jī)體的天然免疫機(jī)制是通過機(jī)體在種族進(jìn)行過程中由于不斷與病原

微生物進(jìn)行斗爭而建立起來的。這種天然獲得的免疫性首先表現(xiàn)在種

的免疫上，如不同種動物對某些感染具有先天的抵抗力。

機(jī)體的天然免疫機(jī)構(gòu)對消滅侵入的微生物具有重要的作用。如皮膚與

黏膜是抵抗外來侵害的第一道屏障。皮膚具有機(jī)械的阻擋作用，黏膜

可分泌許多液體，如淚液、唾液、胃液、腸液等，其中喊含有溶菌酶,

可溶解和殺死細(xì)菌。正好血清中也含有許多殺菌的因素，如補(bǔ)體。乙

型溶菌素及備解素系統(tǒng)等，可殺死革蘭氏陰性或陽性細(xì)菌。血液中的

白血球及巨噬細(xì)胞對外來異物有吞噬及消化的作用，這種作用也是天

然防御中的重要機(jī)制之一。

一.正常血清的殺菌作用

材料：

1.血清：新鮮無菌免疫血清

2.菌種：傷寒培養(yǎng)液

3.無菌小試管無菌吸管：瓊脂平板37℃水浴箱無菌生理鹽水方法

方法：

1.取無菌小試管2支，分別注明1、2號。

2.用吸管取新鮮無菌兔血清0.5毫升，加入第1管內(nèi)。

3.用另一支吸管吸取無菌生理鹽水0.5毫升，加入第二管內(nèi)。

4.再用吸管吸取傷寒桿菌培養(yǎng)液，分別加入1及2管中各0.1毫升。

加菌液時，防止菌液接觸管壁以免污染管壁，造成結(jié)果的錯誤。然后

振蕩兩支試管使之均勻混合，置37℃水浴箱中。

1.取普通瓊脂平板一塊，用蠟筆在底上劃分為四等分，分別標(biāo)

記為10，，30',60',對照（如圖）。待血清與菌液作用10分鐘后，取

出1號試管加以加以振蕩，使細(xì)菌均勻懸于液體中，然后采一接種菌

液劃線接種于培養(yǎng)基