基因工程簡(jiǎn)答題總結(jié)

基因工程原理復(fù)習(xí)題思考題

5、簡(jiǎn)單敘述同尾酶和同裂酶的差別。

同尾酶：來源不同，識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端,連接后不能被相關(guān)

的酶同時(shí)切割6

同裂醒:識(shí)別序列相同,切割位點(diǎn)有些相同，有些不同。分完全同裂的和不完全同裂

函

（PS:完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。

不完全同裂酶；識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。）

6、連接酶主要有哪些類型？有何異同點(diǎn)？影響連接酶連接效果的因素主要有哪

些？

類型：DNA連接前和RNA連接酶

異同點(diǎn)：

相同點(diǎn)：都能以DNA為模板，從5,向3'進(jìn)行核昔酸或脫氧核昔酸的聚合反應(yīng)。

不同點(diǎn)：DNA聚合酶識(shí)別脫氧核糖核甘酸，在DNA復(fù)制中起作用；而RNA聚合酶

聚合的是核糖核甘酸，在轉(zhuǎn)錄中起作用。

7,試分析提高平端DNA連接效率的可能方法。（傳說中的網(wǎng)上答案）

1、低溫下長(zhǎng)時(shí)間的連接效率比室溫下短時(shí)間連接的好。

2、在體系中加一點(diǎn)切載體的酶，只要連接后原來的酶切位點(diǎn)消失。這樣可避免載體自

連，應(yīng)該可以大大提高平端連接的效率6

3、足夠多的載體和插入片段是最重要的o

4、平端的連接對(duì)于離子濃度很敏感

5、盡可能縮小連接反應(yīng)的體積

6、建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比14度好

8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些?

1）大腸桿菌DNA聚合酶

2）Klenowfragment

3）T7DNA聚合酶

4）T4DNA聚合酶

5）修飾過的T7DNA聚合酶

6)逆轉(zhuǎn)錄酶

7)TaqDNA聚合酶

第四章基因克隆的載體系統(tǒng)

1、作為基因工程載體,其應(yīng)具備哪些條件？

具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性(可轉(zhuǎn)移性)；

具有合適的篩選標(biāo)記；

具有較高的外源DNA的載裝能力；

具有多克隆位點(diǎn)(MCS);

具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)。

3、載體的類型主要有哪些?在基因工程操作中如何選擇載體?

基因工程中常用的載體(vector)主要包括質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)

三大類。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進(jìn)行

篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。

4、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原理，影響轉(zhuǎn)化率的因素有哪些？

A、化學(xué)法（CaCI2法）轉(zhuǎn)化原理：是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu),

后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，質(zhì)粒或DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)

（感受態(tài)細(xì)胞\

B、電穿孑席化轉(zhuǎn)化原理;將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的

樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng),在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙,質(zhì)

?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

影響轉(zhuǎn)化率的主要影響因素：

1）載體本身的性質(zhì)及其空間均象：超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高；

2）插入片段的大?。翰迦肫卧酱螅D(zhuǎn)化效率越低；

3）受體細(xì)胞的類型及預(yù)處理；

4）轉(zhuǎn)化方法：電擊法高于化學(xué)法。

5、重組體分子的選擇方法主要有哪些？并簡(jiǎn)單闡述其原理。

從總體上看，重組體分子的選擇與鑒定方法基本上可以分為如下幾個(gè)類型：

（1）基于載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)法

在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時(shí),載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標(biāo)記基

因,轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后可以使后者呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，據(jù)此可進(jìn)行轉(zhuǎn)化

子或重組子的初步篩選。

（2）基于克隆DNA序列檢測(cè)法

Southern印跡雜交：根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移

并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過與已標(biāo)記的單鏈DNA探針的雜交作用以檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)

移的DNA片段。

（3）基于外源基因產(chǎn)物檢測(cè)法

如果目的基因產(chǎn)物能降解某些藥物使菌株呈現(xiàn)出抗性標(biāo)記，或者基因產(chǎn)物與某些藥物

作用是顯顏色反應(yīng),則可根據(jù)抗性或顏色直接篩選含目的基因的克建子。

第五章基因的克隆一般方法

1、基因的克隆方法主要有哪些？并闡述其克隆原理（至少3種，都是書上找的,自

選哈，建議必選DDRT-PCR和SSH,原因請(qǐng)看下題）？

1）差減雜交（SH）

通過DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理富集目的基因序列，并以此構(gòu)建減數(shù)文庫(kù)的方式來進(jìn)行目

的基因分離克隆的。

2）抑制性差減雜交（SSH）

SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測(cè)子CDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交

步驟結(jié)合為一體的技術(shù).其中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測(cè)子中的cDNA單鏈豐度,而消減雜交

步驟去除了檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間的共同序列，使檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴(kuò)增.

3）差異顯示PCR（DDRT-PCR）

利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY（A）結(jié)構(gòu)，在其3'端設(shè)計(jì)象5'-TllGA樣引物,

該弓I物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時(shí)結(jié)合5,

端的隨機(jī)引物（20條10-mer）,可以使不同長(zhǎng)度的基因得到擴(kuò)增。

4）DNA代表性差異分析（DNARDA）

代表性差別分析是通過突變型（驅(qū)趕DNAdriverDNA）與野生型（檢測(cè)DNAjester

DNA）基因組之間的差異來分離和鑒定突變基因的方法。

5）擴(kuò)增限制性片段長(zhǎng)度多樣性（AFLP）

基因組DNA經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生粘性末端。使用人工合成的短的雙鏈接

頭,該接頭一端具有同樣的內(nèi)切能識(shí)別粘性末端,互補(bǔ)連接后成為DNA模板。接頭和與

接頭相鄰的酶切片斷的幾個(gè)堿基序列作為引物的結(jié)合位點(diǎn)。

2、簡(jiǎn)單闡述差異顯示PCR克隆基因的原理及其優(yōu)缺點(diǎn),有何應(yīng)用？

主要原理利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY（A踣構(gòu)在其3,端設(shè)計(jì)象5'-TllGA

樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合,從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時(shí)

結(jié)合5'端的隨機(jī)引物（20條10-mer）,可以使不同長(zhǎng)度的基因得到擴(kuò)增。

優(yōu)點(diǎn)：

簡(jiǎn)便、靈敏、高效、省時(shí)，能快速顯示mRNA的組成。

所需的mRNA最少。

各樣本mRNA的差異可同時(shí)進(jìn)行比較.

擴(kuò)出的CDNA可直接用于測(cè)序、文庫(kù)篩選等。

缺點(diǎn)：

假陽(yáng)性條帶多,對(duì)低豐度的基因表達(dá)不容易檢測(cè)。

工作量大。

無(wú)法定量研究。

擴(kuò)出的條帶往往是3'端比較短的UTR區(qū)的一段序列，提供的信息較少。

利用該技術(shù)，目前已有越來越多的差別表達(dá)基因得以分離和鑒定，在分子生物學(xué)和基

因工程研究領(lǐng)域發(fā)揮了極大的作用。（P221）

3、抑制性差減雜交的原理與應(yīng)用。

原理：SSH的核心'技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測(cè)子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消

減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測(cè)子中的cDNA單鏈豐度,而消

城雜交步驟去除了檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間的共同序列，使檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間不同的序列得

到擴(kuò)胤

應(yīng)用：

基因突變體的研究：如基因的表達(dá)與不表達(dá)；

基因時(shí)空表達(dá)的研究：如根、莖、葉；

不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異：如施肥與不施肥、光照與不光照°

4、酵母雙雜交技術(shù)、噬菌體表面展示技術(shù)的原理.

A.酵母雙雜交技術(shù)原理：大部分真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可

分隔開的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是DNA特異結(jié)合域(DNA-bingingdomain.BD),一個(gè)是轉(zhuǎn)錄激

活域這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能,互不影響，但一

(transcriptionalactivationdomain,AD)0

個(gè)完整的、具有激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，否則無(wú)法完成

其激活功能。不同來源的激活因子的BD區(qū)與AD區(qū)結(jié)合后則能特異地激活BD結(jié)合基因

的表達(dá)。

B.噬菌體表面展示技術(shù)原理：當(dāng)外源DNA片段插入絲狀噬菌體基因組的一個(gè)外被蛋

白基因中時(shí)，如果兩者讀碼框結(jié)構(gòu)保持一致，這個(gè)外源DNA片段所編碼的產(chǎn)物可與此外

被蛋白一起以融合蛋白的形式表達(dá),并顯示在噬菌體的表面。利用抗此外源基因編碼產(chǎn)物

（多肽或蛋白）的抗體，通過親和純化,就能從大量的噬菌體中富集、分離出含有所要的

基因的融合噬菌體.然后，通過基因擴(kuò)增，得到大量所要的目的基因.

5、T-DNA標(biāo)簽法克隆基因的一般技術(shù)路線。

農(nóng)桿菌侵染植物得到轉(zhuǎn)化畝,篩選出表現(xiàn)某種突變性狀的個(gè)體6

建立突變體基因組文庫(kù)及野生型基因組文庫(kù).

用T-DNA片段做probe篩選突變體文庫(kù)，獲得陽(yáng)性克隆。

用獲得的陽(yáng)性克隆篩選野生型基因組文庫(kù)，獲得野生型的陽(yáng)性克隆。

把陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化突變體進(jìn)行功能互補(bǔ)及進(jìn)行測(cè)序分析。

第七章克隆基因的表達(dá)

1、通過比較，分析大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)各有何優(yōu)缺點(diǎn)。

大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)：

全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開放型閱讀框架;

基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟、完善；

繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定；

被FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物。

大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)：

缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能；

缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)；

內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白；

周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素。

甲醵酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)：

具有強(qiáng)的受嚴(yán)格調(diào)控的A0X1啟動(dòng)子

表達(dá)蛋白的翻譯后的加工和修飾

營(yíng)養(yǎng)要求低，工業(yè)化生產(chǎn)成本低

可高密度發(fā)酵

表達(dá)蛋白可存在于胞內(nèi)和胞外

酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)：酵母表達(dá)蛋白有時(shí)會(huì)出現(xiàn)蛋白切割問題（這個(gè)找不到，百度的）

2、如何提高克隆基因的表達(dá)水平？

U表達(dá)載體的優(yōu)化設(shè)計(jì)；

21提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性；

3\密碼子偏愛性；

4\表達(dá)環(huán)境條件的優(yōu)化。

3、克隆基因目的蛋白的表達(dá)的形式主要有哪些類型？

表達(dá)蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白和可溶性蛋白兩類，具體包括如下幾種結(jié)

構(gòu)形態(tài)：包涵體型蛋白、融合型蛋白、分泌型蛋白

5、表達(dá)載體和基因工程一般克隆載體在元件構(gòu)成上有何差別？

表達(dá)教體：?jiǎn)?dòng)子；終止子；核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）；篩選標(biāo)記；復(fù)制子（質(zhì)粒

拷貝數(shù)）；多克隆位點(diǎn)

克隆載體：篩選標(biāo)記；復(fù)制子（質(zhì)粒拷貝數(shù)）；多克隆位點(diǎn)

第八章植物基因工程

2、外源基因?qū)胫参锏姆椒ㄖ饕心男?/p>

物理方法：電擊法、基因槍法（biolistic）、顯微注射法、微激光束法

化學(xué)方法：PEG介導(dǎo)法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法

生物學(xué)方法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法

四.問答題

（一）簡(jiǎn)答

4.某學(xué)生在用EcoRI切割外源DNA片段時(shí)，出現(xiàn)了星號(hào)活性，請(qǐng)分析可能的原因。

答：鹽離子濃度不對(duì),溫度不對(duì)，甘油濃度過高。

5.在序列5XGAACATATGGAGT-3中含有一個(gè)6bp的II類限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)

別序列,該位點(diǎn)的序列可能是什么？

答：回文序列是5'-CATATG3°

6.下面幾種序列中你認(rèn)為哪一個(gè)（哪些）最有可能是H類能的識(shí)別序列：GAATCG.

AAATTT.GATATC.

ACGGCA?為什么？

答；GATATC和AAATTT,因?yàn)樗鼈兪腔匚男蛄小?/p>

7,用Klenow酶填補(bǔ)的辦法可使51黏性末端轉(zhuǎn)變成平末端,這種方法常使DNA上

的某些限制酶的識(shí)別位點(diǎn)消失。請(qǐng)問，對(duì)于下列限制酶，用這種方法處理會(huì)不會(huì)使它們的

識(shí)別序列都消失?BamHI(GIGATCC),TaqI(TICGA),BssHII(GICGCGC).

答：BssHII不會(huì)。

四、問答題

2.DNA連接前的作用特點(diǎn)有哪些？

①連接反應(yīng)需要在一條DNA鏈的3'末端具有一個(gè)游離的-0H,而另一條DNA鏈

的5'末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)［P)的情況下，才能發(fā)揮其連接DNA分子的功能作用，而

在末端帶有5'-羥基和3'-羥基；5'-磷酸和3'一二脫氧核昔基團(tuán)的兩個(gè)DNA片段之

間不起連接作用。

②連接反應(yīng)中需要ATP或NAD+和Mg2+為輔助因子和激活因子；

③DNA連接酶不能夠連接兩條單鏈的DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋

的一部分。

?DNA連接酶只封閉雙螺族DNA骨架上的缺口(Nick)，即在雙鏈DNA的某一條

鏈上兩個(gè)相鄰核甘酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂，而不能封閉雙鏈DNA

的某一條鏈上失去一個(gè)或數(shù)個(gè)核甘酸所形成的裂口(Gap\

3.影響DNA連接酶連接反應(yīng)的因素主要有哪些？

答：1）反應(yīng)溫度：最佳反應(yīng)溫度37P,但黏性末端之間退火形成的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定,

連接黏性末

端的最佳溫度，一般認(rèn)為4~20T比較合適。

2）DNA片段末端：不僅要考慮反應(yīng)體系中DNA末端的總濃度，還要考慮載體與插

入片段的末端濃度的比例。原則上應(yīng)保證一個(gè)DNA分子的末端有較高的幾率與另一

DNA分子連接,減少同一個(gè)分子兩個(gè)末端之間的自身連接。載體輸入片段3:1-1:

3）連接酶濃度：平末端DNA分子的連接反應(yīng),最適酶量大約是1~2單位；而鉆末

端DNA片段間的連接,在同樣的條件下，僅為0.1單位時(shí)，便能得到最佳連接效率。

四、問答題

1.YAC載體具有什么樣的？為什么在克隆大片段時(shí)，YAC具有優(yōu)越性？

答：（1）功能性DNA序列：

①來自于酵母的125bpDNA片段的著絲點(diǎn)序列（CEN4）°

②來自酵母的自主復(fù)制序列（ARS1）,起始在酵母中的DNA復(fù)制。

③來自酵母的端粒序列，它是（5-TGTGGGTGTGGTG-3）的多拷貝重復(fù)，它對(duì)染色體

的復(fù)制和維持是必需的。

④在酵母中進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因，URA3（尿喀碇生物合成基因）和TRP1（色氨酸合

成基因\寄主是這些墓因的營(yíng)養(yǎng)缺陷性，只有帶有這些基因的轉(zhuǎn)化體才能在選擇培養(yǎng)基上

生活

⑤具有細(xì)菌的復(fù)制起始點(diǎn)和選擇標(biāo)記基因。YAC載體通常含有ColEl的。日和氨節(jié)

青霉素抗性標(biāo)記基因，可以在大腸桿菌中復(fù)制和繁殖,所以它也是一種穿梭載體。

（2）優(yōu)越性：YAC能夠容納長(zhǎng)達(dá)上千kb的外源DNA,這是質(zhì)粒和黏粒辦不到的。

大片段的插入更有可能包含完整的基因，在艙體步移中每次允許更大的步移距離，同時(shí)

能夠減少完整基因組文庫(kù)所需的克隆數(shù)目。

3.舉例說明什么是穿梭載體？

答：穿梭載體是含有細(xì)菌質(zhì)粒和克隆的真核生物DNA片段的雜種質(zhì)粒,有兩個(gè)復(fù)制

起點(diǎn)和能在兩種不同細(xì)胞中進(jìn)行選擇的選擇標(biāo)記，所以，很容易從一宿主轉(zhuǎn)到另一個(gè)宿主

（來回穿梭）。

5.什么是YAC?YAC克隆載體常出現(xiàn)哪些問題？

答：YAC即醉母人工染色體（YeastArtificialChromosome）的縮寫,是人工構(gòu)建

的染色體樣大容量克隆載體，基本組成有著絲點(diǎn)、能在細(xì)菌和醉母中進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制起始

點(diǎn)和選擇標(biāo)記及端粒。最大克隆片段可達(dá)到

DNA2000kbo

問題有：⑴YAC有嵌合現(xiàn)象，一個(gè)YAC中克隆的DNA片段可能來自兩個(gè)或多個(gè)不

同的染色體。在基因組文庫(kù)中,嵌合體占克隆總數(shù)的10%~60%。

(2)YAC內(nèi)部有重組現(xiàn)象，插入的DNA較大，序列發(fā)生重排，導(dǎo)致和原來染色體的

序列不一致，重組很難檢出。

(3)YAC還有缺失現(xiàn)象,影響YAC文庫(kù)的代表性。

(4)YAC結(jié)構(gòu)和酵母天然染色體結(jié)構(gòu)相似,使用常規(guī)方法不易將YAC和醉母天然染色

體分開。

⑸構(gòu)建好的YAC轉(zhuǎn)化原生質(zhì)化的酵母菌，轉(zhuǎn)化效率低。

(6)建好庫(kù)后保存方便，但要篩選某個(gè)基因時(shí)工作量大

6，什么是BAG?BAC載體的組成與優(yōu)缺點(diǎn)有哪些？

①細(xì)菌人工染色體(BAC)是從大腸桿菌F因子改造構(gòu)建而來的，能夠攜帶大約

300kb的DNA插入片段。

②載體具有F因子的復(fù)制起始點(diǎn)(oriS),可使載體維持每個(gè)細(xì)胞一個(gè)拷貝的水平。

③載體包括有個(gè)維持復(fù)制和拷貝數(shù)目的基因

4DNAzrepE,parA,parBandparC9

?具有一個(gè)抗生素選擇標(biāo)記基因，和lacZ'基因。在lacZ'基因中組裝有一多克隆

位點(diǎn)，便于外源片段的插入和藍(lán)白反應(yīng)篩選克隆子。

⑤插入的DNA片段非常穩(wěn)定，可以在大腸桿菌細(xì)胞中維持?jǐn)?shù)百代，而且不易發(fā)生

亙組和從寄主細(xì)胞中丟失。

⑥主要缺點(diǎn)是每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)少（1~2個(gè)），使得分離和篩選較為困難。

7.利用PBR322質(zhì)粒插入失活分離帶有外源DNA片段的重組克隆的原理是什么？

①外源DNA片段插入在pBR322質(zhì)粒tetr基因的編碼序列內(nèi)（BamHI）位點(diǎn),

使該基因失活；

②體外重組反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ampstets菌株,并涂布在amp瓊脂平板上,

凡獲得了PBR322質(zhì)粒和重組質(zhì)粒（AmprTets）的寄主細(xì)胞都可長(zhǎng)成菌落；

③將amp瓊脂上的菌落原位影印在tet瓊脂平板上生長(zhǎng)，對(duì)比這兩個(gè)平板的菌落

生長(zhǎng)情況，凡在amp平板上能夠生長(zhǎng)而在tet平板上不能生長(zhǎng)的菌落，便是屬于帶有重

組體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子克隆；挑出這樣的陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增分離帶有外源DNA插入片段的重組

體質(zhì)粒。

8.pUC質(zhì)粒利用a■互補(bǔ)作用篩選重組子原理是什么？

答：pUC系列質(zhì)粒載體是在PBR322質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上改造來的，它用lacZ'基因

取代了PBR322質(zhì)粒載體上的tetr基因。lacZ，基因編碼由半孚糜昔陶的N末端1?63個(gè)

氨基酸（a-肽鏈）的DNA片段,在lacZ'基因內(nèi)組入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）,但不影

響lacZ'基因的功能。pUC教體的宿主（E.coli）攜帶一個(gè)編碼但半乳糖首酶C端序列

的基因片段，它們本身用這個(gè)基因片段產(chǎn)生的由半乳糖昔酶片段是無(wú)活性的，但它們可以

通過a-互補(bǔ)作用在體內(nèi)相互彌補(bǔ),即兩部分產(chǎn)物可以結(jié)合形成有活性的0-半乳糖首酶6當(dāng)

pUC質(zhì)粒引入大腸桿菌中，在含有指示劑X-gal和IPTG的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，菌落

成藍(lán)色°如果在MCS插入外源DNA片段（基因），破壞了lacZ基因的功能（插入失

活),不再產(chǎn)生a-肽鏈，不能和宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽片段形成有活性的。-半乳糖甘酶,形成

的菌落是無(wú)(白)色的.因此，根據(jù)這種3半乳糖苦酶的顯色反應(yīng)，便可以檢測(cè)出含有外源

DNA插入序列的重組體克隆.

9,自然界中具備理想條件的質(zhì)粒載體為數(shù)不多,即使是ColEl和pSCIOl這兩個(gè)自

然質(zhì)粒也不盡如人意,通常需要進(jìn)行改造。請(qǐng)問質(zhì)粒改造包括哪些基本內(nèi)容？

答：

基本內(nèi)容包括：

(1)刪除一些非必要的區(qū)段及對(duì)宿主有不良影響的區(qū)段；削減載體的分子質(zhì)量，使載

體具有更大的容納外源片段的能力。

(2)加上易于選擇或檢測(cè)的標(biāo)記。

(3)限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)的改造,便于外源基因插入到載體中的特定位置。

(4)加上一些調(diào)控元件,有利于克隆基因的表達(dá)。

(5)安全性改造，限定載體的宿主范圍。

10.質(zhì)粒制備的基本原理？

答：帶有質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞在SDS作用下裂解，并在堿性條件下使DNA變性。調(diào)節(jié)

pH值至中性時(shí)質(zhì)粒DNA首先復(fù)性，而細(xì)菌基因組DNA不能復(fù)性而與SDS=蛋白質(zhì)形成

復(fù)合體，可以被離心沉淀除去.上清液中的質(zhì)粒DNA分子可被酒精沉淀或其他方法沉淀

純化出來.

四、問答題

L入噬菌體DNA被包裝到噬菌體的頭部需要哪些基本條件？為什么？

答：①兩個(gè)cos位點(diǎn);②線性DNA;③分子大小在人噬菌體基因組的75%~105%。

2.為什么野生型的人噬菌體DNA不宜作為基因工程教體？

答：(1)噬菌體DNA沒有容載能力，因?yàn)槭删w的頭部對(duì)DNA包裝的量是有限制

的，不能大于基因組的105%,所以要將人噬菌體改造成載體，必須削減本身的分子大小；

(2)野生型的人DNA對(duì)于一些常用的酶都有多個(gè)識(shí)別和切割位點(diǎn)，不便于克隆；

(3)沒有可供選擇的標(biāo)記；

(4)野生型的人噬菌體具有感染性，因此不夠安全。

4.人噬菌體載體具有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足？

答：優(yōu)點(diǎn)：(1)人基因組中有1/3的非必需區(qū)可以被置換。改造成教體后,克隆的片

段較大(可達(dá)20kb),而質(zhì)粒載體的克隆片段只有幾個(gè)kb;

(2)用噬菌體入DNA作為載體，即使不進(jìn)行體外包裝，轉(zhuǎn)染的頻率也比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的效

童高，包裝后的效率就更高了;

(3)入可通過溶原化反應(yīng)整合到寄主染色體上，當(dāng)不需要外源基因大量表達(dá)時(shí)，可讓它

以溶原性存在，若要表達(dá)，可通過誘導(dǎo)即可進(jìn)入裂解途徑，釋放出大量的噬菌體,得到的

直組DNA的拷貝數(shù)就會(huì)很多。

缺點(diǎn)：(1)包裝比較麻煩，包裝率不穩(wěn)定，購(gòu)買包裝蛋白的費(fèi)用高；

(2)沒有質(zhì)粒的用途廣泛。

5.以置換型人噬菌體作為載體進(jìn)行克隆時(shí)，為什么說能夠形成噬菌斑的就一定是重組

體？

答：改造的置換型噬菌體載體，重組入外源片段之后，總體積不能超過入基因組的

105%,不能小于又基因組的75%。以置換型人噬菌體DNA作為載體，首先要分離左、

右兩臂同外源DNA重組。如果沒有外源片段，僅是兩臂連接，長(zhǎng)度短于久基因組的75%,

不能被包入噬菌體顆粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑.如果插入了外源片段后,

總長(zhǎng)度超過人基因組105%后，也不能包入噬菌體顆粒，自然也不能形成噬菌斑。

6.M13系列載體具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？

答：M13克隆系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn)：

(1)克隆的片段大:M13噬菌體的DNA在包裝時(shí)不受體積的限制，所以容載能力大。

有報(bào)道，有些噬菌體顆?？梢园b比野生型絲狀噬菌體DNA長(zhǎng)6~7倍的DNA(插入片

段可達(dá)40kb，

⑵可直接產(chǎn)生單鏈DNA,這對(duì)于DNA測(cè)序、DNA誘變、制備特異的單鏈DNA探

針都是十分有用的.

(3)單鏈DNA和雙鏈DNA都可以轉(zhuǎn)染宿主，并可根據(jù)人工加上的選擇標(biāo)記進(jìn)行篩

迄

M13克隆系列的不足：

⑴較大的外源片段插入后，在擴(kuò)增過程中往往不夠穩(wěn)定。一般說，克隆的片段越大,

發(fā)生丟失的概率越大。

⑵單鏈載體分子感染的細(xì)胞中，往往是單鏈和雙鏈混雜，分離雙鏈比較麻煩。

7.黏粒載體具有哪些特點(diǎn)與不足？

答：主要特點(diǎn)有：

①柯斯質(zhì)粒是含有人噬菌體COS位點(diǎn)的質(zhì)粒載體。柯斯質(zhì)粒具有質(zhì)粒的復(fù)制子，進(jìn)

入寄主細(xì)胞后能夠像質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制，并且能夠被氯霉素?cái)U(kuò)增。

②具有質(zhì)粒載體的抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記和克隆位點(diǎn)。

③插入片段的消化、連接及后來重組克隆的純化與質(zhì)粒載體相同。

④具有人噬菌體的包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。與質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞不同，重組體像人載體

一樣，需體外包裝后轉(zhuǎn)染細(xì)菌。

⑤包裝后形成的X顆粒用來感染大腸桿菌，重組DNA像入DNA一樣注入細(xì)菌細(xì)

胞，并以COS位點(diǎn)環(huán)化.由于缺乏人的其他DNA序列，環(huán)化DNA在細(xì)菌體內(nèi)以質(zhì)粒一

樣維持。

⑥簡(jiǎn)化了篩選。載體體積小，承載外源DNA片段大。如果載體的分子質(zhì)量在5kb的

話，得到的轉(zhuǎn)導(dǎo)子幾乎排除由載體自連的可能性，因?yàn)橐怀晒Πb，至少要7個(gè)分子的

載體自連。盡管如此也是不能被包裝的，因?yàn)镃OS位點(diǎn)太多了。重組體只有達(dá)到32-45kb

才能有效包裝體外包裝,這就提供了對(duì)重組體的正向選擇。

⑦對(duì)轉(zhuǎn)化體的選擇是基于載體上的抗生素標(biāo)記。

⑧感染后形成菌落，而不是曖菌斑。

黏粒載體也有如下不足：

①如果兩個(gè)黏粒之間有同源序列，可能會(huì)發(fā)生重組，結(jié)果會(huì)使被克隆的片段重排或丟

失6

②含不同重組DNA片段的菌落生長(zhǎng)速度不同，會(huì)造成同一個(gè)平板上菌落大小不一。

另外由于不同大小的插入片段對(duì)宿主細(xì)胞的作用不同，會(huì)造成文庫(kù)獷增量的比例失調(diào)。

③包裝過程復(fù)雜，包裝效率不穩(wěn)定，代價(jià)高。

四、問答題

1.怎樣將一個(gè)平末端的DNA片段插入到EcoRI的限制位點(diǎn)中去？

答：可以化學(xué)合成一個(gè)連接子（linker）,即一段長(zhǎng)為lObp含有EcoRI識(shí)別位點(diǎn)的

短的DNA片段，

然后與待克隆片段兩端連接起來，如果用EcoRI切割這種連接片段,就會(huì)產(chǎn)生EcoR

I的單鏈末端。這種片段就可以插入到任何EcoRI的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)中。

2.構(gòu)建基因組文庫(kù)時(shí)為什么要對(duì)基因組DNA進(jìn)行部分酶切，（列舉至少兩條理由）

答：①部分的切可獲得長(zhǎng)度適宜的片段（如獲得中等長(zhǎng)度的前切片段）；②部分能切可

保證切出的DNA片段內(nèi)部依然保留了部分限制醒位點(diǎn)，便于后續(xù)的克隆分析。

3.什么是基因組文庫(kù)（genomiclibrary）?它同遺傳學(xué)上的基因庫(kù)有什么不同？

答：基因組文庫(kù)是用基因工程的方法，人工構(gòu)建的含有某一生物基因組DNA的各種

片段的克隆群。

包括下列過程：高分子質(zhì)量柒色體DNA的制備；體外重組連接；將重組DNA導(dǎo)入

寄主細(xì)胞并擴(kuò)增；篩選。

基因組文庫(kù)同遺傳學(xué)上所講的基因庫(kù)是完全不同的概念6基因庫(kù)（genepool）是指在

進(jìn)行有性生殖的某一群體中，能進(jìn)行生殖的個(gè)體所含總的遺傳信息。在基因組文庫(kù)的構(gòu)建

中,由于使用的載體不同，分為噬菌體載體和黏粒載體構(gòu)建的基因組文庫(kù)、YAC文庫(kù)、BAC

文庫(kù)等。

4?什么是cDNA文庫(kù)？同基因組文庫(kù)有何差別?

答：同mRNA互補(bǔ)的DNA稱為cDNAecDNA文庫(kù)是以某一生物的總mRNA為

模板，在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，首先合成一互補(bǔ)的DNA,即第一鏈，破壞

RNA模板后，再以第一鏈為模板合成第二鏈，得到的雙鏈DNA稱為cDNA。選用適合

的載體，將合成的cDNA重組導(dǎo)入寄主細(xì)胞，經(jīng)篩選得到的cDNA克隆群稱為cDNA文

庫(kù)。由于cDNA技術(shù)合成的是不含內(nèi)含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一種通

用方法。

由于細(xì)胞內(nèi)的基因在表達(dá)的時(shí)間上并非是統(tǒng)一的，具有發(fā)育的階段性和時(shí)間性,有些

則需要特殊的環(huán)境條件,所以，cDNA文庫(kù)是不可能構(gòu)建得十分完全的，也就是說，任何

一個(gè)cDNA文庫(kù)都不可能包含某一生物的全部編碼基因。

cDNA文庫(kù)與基因組文庫(kù)的主要差別是：

(1)基因組文庫(kù)克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列；cDNA文庫(kù)克隆的

是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因，刨翻節(jié)基因。

(2)基因組文庫(kù)克隆的是全部遺傳信息，不受時(shí)空影響；cDNA文庫(kù)克隆的是不完全

的編碼

DNA闞，因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響。

(3)基因組文庫(kù)中的編碼基因是真實(shí)基因，含有內(nèi)含子和外顯子；而cDNA克隆的是

末含內(nèi)含子的基因6

6.如何使用甲基化酶對(duì)克隆DNA進(jìn)行保護(hù)？有什么意義?

答：在構(gòu)建基因文庫(kù)時(shí)，可用與接頭中限制性內(nèi)切核酸酶相應(yīng)的甲基化酶對(duì)克隆DNA

先進(jìn)行甲基化修飾，將插入片段上該酶可能的識(shí)別序列先行保護(hù)起來.

意義：用這種方法，不僅保護(hù)了插入片段的大小不會(huì)改變，又有利于插入片段的回收，

因?yàn)椴迦肫沃刑囟ㄏ拗菩詢?nèi)切核酸前的識(shí)別位點(diǎn)被保護(hù)起來,重組后可以用特定的限制

性內(nèi)切核酸能將插入片段回收。

8.某一質(zhì)粒載體具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因內(nèi)有一Bgll的酶切位

點(diǎn)現(xiàn)用BglI切割該載體進(jìn)行基因克隆，問：①轉(zhuǎn)化后涂皿時(shí)應(yīng)加什么樣的抗生素？②

培養(yǎng)后長(zhǎng)出的菌落具有什么樣的抗性基因型？③如何利用抗性變化篩選到含有插入片段的

亙組體？

提示：①加四環(huán)素；

②TetrKans和TetrKanr;

③重新點(diǎn)種在含Tet、Kan和只加Tet的平板上，選擇只在Tet平板上生長(zhǎng)的菌落,

即為所

需的重組體。

9.限制性內(nèi)切核酸酶BamHI和PstI切割某一DNA序列..結(jié)果如下所示。

5'……GIGATCC.........3'BamHI……GGATCC……

3'CCTAGtG——5'CCTAGG

5'CTGCAIG……3'PstICTGCAG

3'——GTACGTC——5'——GACGTC——

⑴指出被切割DNA分子的5'端和3'端;

(2)如果你將切割后的DNA同DNA聚合酶、4種dNTP在一起溫育這些DNA末

端會(huì)有什么樣的變化？

(3)經(jīng)過⑵中的反應(yīng)后，你還能夠用T4DNA連接酶將BamHI末端連接起來嗎？

PstI末端呢？(T4DNA連接酶能夠連接平末端和黏性末端。)

(4)在(3)中的連接后，能夠重新形成BamHI位點(diǎn)嗎？PstI位點(diǎn)呢？為什么？

答：(1)切割后分子的5'和3'端(如圖示)：

(2)如圖所示,BamHI的末端能夠被DNA聚合能填補(bǔ)，而PstI的末端卻不能。這

種差異是由DNA聚合髀的作用條件所決定的：dNTP只加到具有3'-0H的引物上，并且

要有一條保證正確添加的模板鏈。BamHI的末端可以滿足這些條件，但PstI的末端卻

不能，因其具有隱蔽的5'端,這種末端是不能作為引物的，故不能被填補(bǔ)。

(3)如圖所示，平末端化的BamHI末端和未被修飾的PstI末端二者都能被T4DNA

連接陶連接。

(4)連接處理過的末端可以再產(chǎn)生PstI的位點(diǎn)，但不會(huì)產(chǎn)生BamHI的位點(diǎn)(畫圖

說明\切割、填補(bǔ)末端并重新連接，常會(huì)產(chǎn)生新的限制酶酶切位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對(duì)于進(jìn)一步

的操作有時(shí)是有用的6

10.從基因組DNA文庫(kù)中分離的一段DNA(如下圖所示)，其中有一編碼基因(黑

框),圖中給出了幾種限制性內(nèi)切核酸酷的作用位點(diǎn)。該圖同時(shí)給出了用作表達(dá)該基因的表

達(dá)載體,彎曲箭頭是啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向，并給出了幾種醒的作用部位。

請(qǐng)根據(jù)此圖，回答下列問題：

⑴給出限制性內(nèi)切核酸前PstI、BamHI、EcoRRHindHI和ClaI所在部位的遺

傳學(xué)名稱。

(2)如果你打算用該表達(dá)載體表達(dá)DNA片段中的基因該片段應(yīng)如何插入表達(dá)載體？

(3)如果只想表達(dá)該基因的一部分，以獲得部分表達(dá)的蛋白質(zhì)用于制備抗體,應(yīng)如何

操作?

(4)如果你需要將整個(gè)基因在表達(dá)載體中表達(dá)，應(yīng)如何操作？是用單酶切還是雙酶

切？

答：(1)多接頭區(qū)域(MCS)，也叫多克隆位點(diǎn),

(2)主要是插入的方向問題。因?yàn)閱?dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向必須與基因的方向一致，所以該

DNA必須倒轉(zhuǎn)180。插入，即5'端必須緊挨啟動(dòng)子。

(3)用EcoRI切割載體和基因組DNA,用連接酶重組后篩選重組體，通過測(cè)序確定

正確方向的重組體進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。

(4)可用PstI和HindIII雙酶切割基因組DNA和表達(dá)載體DNA,這種切割可將基

因組DNA片段定向克隆入表達(dá)載體.'

四、問答題

L構(gòu)建表達(dá)載體應(yīng)注意些什么？

答：⑴構(gòu)建表達(dá)載體的關(guān)鍵是用于表達(dá)克隆序列的啟動(dòng)子類型，如果目的是基因的

高效表達(dá)，就要選用強(qiáng)的啟動(dòng)子；如果表達(dá)產(chǎn)物對(duì)寄主細(xì)胞有毒性，可選擇弱的啟動(dòng)子，

最好使用可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,使在一定的條件下表達(dá)。

(2)表達(dá)載體還應(yīng)具有以下組成元件：

①攜帶能在寄主細(xì)胞中維持的復(fù)制的起始點(diǎn)。

②具有抗生素選擇標(biāo)記或其他選擇機(jī)制。

③在緊接啟動(dòng)子的下游安排限制性位點(diǎn),用于插入需表達(dá)的基因。

④具有單一的酶切位點(diǎn)來克隆基因,克隆位點(diǎn)應(yīng)位于準(zhǔn)確的位置，以使克隆基因有效

表達(dá)。

3.插入失活法和插入表達(dá)法篩選重組體的主要差別是什么？

答：主要差別是：

(1)插入失活法是直接根據(jù)失活基因的表型變化來篩選重組體。

(2)插入表達(dá)法是根據(jù)一個(gè)基因的失活引起另一個(gè)基因的表達(dá)表型來選擇。

4.一個(gè)攜帶有氨節(jié)和卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒被僅在卡那霉素基因中有識(shí)別位點(diǎn)的

EcoRI消化$消化物與酵母DNA連接后轉(zhuǎn)化對(duì)兩種抗生素都敏感的E.coli菌株，

(1)利用哪一種抗生素抗性蜂接受了質(zhì)粒的細(xì)胞？

(2)怎樣區(qū)分接受了插入酵母DNA的質(zhì)粒的克??？

提示：(1)選擇Ampr的轉(zhuǎn)化子；

所需的克隆是和任何能夠抗這兩種藥物的克隆都是自連的非重組

(2)AmprKansd

質(zhì)粒。

5,用EcoRI和HindIII分別切割同一來源的染色體DNA,并進(jìn)行克隆。在前者的

克隆中篩選到A基因，但在后者的克隆中未篩選到A基因，請(qǐng)說明原因。

提示：因?yàn)镠indHI的切點(diǎn)位于A基因內(nèi)°

7.用一限制性內(nèi)切核酸酶切割Lac+Tet「的質(zhì)粒載體，已知該酶識(shí)別的是4個(gè)堿基

序列，并產(chǎn)生有兩個(gè)堿基突出的單鏈末端,該酶在lac基因內(nèi)有切割位點(diǎn)，并在第二個(gè)氨

基酸密碼子內(nèi)，該位點(diǎn)可以被任何氨基酸所取代而不影響酶活性。用該酶切割后，用DNA

竇合醯將單鏈末端補(bǔ)齊為雙鏈的平末端，然后重新連接成環(huán),轉(zhuǎn)化Lac-Tet-受體菌，篩

選Tetr轉(zhuǎn)化子，問：Lac的基因型是什么？并說明原因。

提示：基因型是lac-,原因是在該密碼子中插入了兩個(gè)堿基，造成了移碼突變，所以

Lac的基因是缺陷的.

10.在基因工程中,為了在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)真核生物的基因產(chǎn)物，為什么通常要用

CDNA而不用基因組DNA?為什么要在cDNA前加上細(xì)菌的啟動(dòng)子？

答：這是因?yàn)榧?xì)菌沒有內(nèi)含子剪接系統(tǒng)，并且不能識(shí)別真核生物的啟動(dòng)子的原因。

11.如何根據(jù)下面的應(yīng)用設(shè)計(jì)探針？

⑴假定你分離純化了一未處功能的蛋白質(zhì)，需要確定是何種組織和細(xì)胞表達(dá)這種蛋

白質(zhì)。

(2)假定你獲得了綿羊的胰島素mRNA如何進(jìn)一步從人的cDNA文庫(kù)中獲得含人胰

島素的克隆并使之在E.coli中表達(dá)？

提示：⑴首先對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行部分測(cè)序，然后根據(jù)測(cè)得的氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。

(2)以該mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA,即可進(jìn)行標(biāo)記用作探針。

13.單鏈RNA作為探針，具有哪些單鏈DNA探針?biāo)鶝]有的優(yōu)點(diǎn)?

答：?jiǎn)捂淩NA探針的下列優(yōu)點(diǎn)是單鏈DNA探針?biāo)鶝]有的：

(1)RNA/RNA和RNA/DNA比DNA/DNA雜交體具有更高的穩(wěn)定性。因此，

雜交可以在更嚴(yán)格的各件下講行，雜交后的信號(hào)也比較強(qiáng)。

(2)單鏈RNA由于不存在互補(bǔ)雙鏈的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,所以雜交效率比較高。

(3)RNA中不存在重復(fù)序列，所以特異