DB34∕T 3308-2018 兩系雜交水稻種子純度檢測 分子標記法

DB34DB34/T3308—2018兩系雜交水稻種子純度檢測分子標記法Protocolforpuritydetectionoftwo-linehybridseeds-molecularmarkermethod2018-12-29發(fā)布2019-01-29實施安徽省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I1GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗規(guī)GB/T3543.5農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程真實GB/T6682分析實驗室用水規(guī)CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，DNA：deoxyribonucleicaciddNTPs：deoxyribonucleosidetriphoPAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚PCR：polymerasechainreaction，聚合SSR：simplesequencere具有共顯性，雜交種子具有雙親等位標記互補帶型，針對不同品種篩選其區(qū)別于其它品種的特征SSR標記，通過SSR多態(tài)性分析，可判斷受檢種子是否為雜交種并區(qū)別正常個體與異品種個體。本標準綜合利用兩系不育基因特征標記和不同品種特征SSR標記，鑒定一定數(shù)量送驗樣品中的正常個體數(shù)目或2高壓滅菌鍋、超純水儀、高速離心機、恒溫水浴鍋（30℃~100℃)、核酸蛋白測定儀、組織研磨去離子甲酰胺、溴酚藍、二甲苯青FF、丙烯酰胺、從送檢樣品中分取規(guī)定數(shù)量的試樣，試樣采用單個個體獨立檢測。試樣的抽取應(yīng)有代表性，符合試樣的檢測應(yīng)設(shè)置重復(fù)，重復(fù)的次數(shù)以達到GB/T3543.5規(guī)定的容許誤差范圍內(nèi)為止，每次重復(fù)取待檢樣品的去殼種子、幼苗或葉片約200～300mg置于2.0mL離心管，充分研磨；每管700μL經(jīng)65℃預(yù)熱的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴30mi棄上清液，用70％乙醇溶液洗滌2遍；室溫自然晾干后，加入超純水或T3將種子發(fā)芽至幼苗長度達到3cm左右時剪取0.5cm長的幼苗，或?qū)⑻镩g植株的葉片剪取0.5每個兩系雜交水稻品種至少篩選2對引物進行純度鑒定，包括針對該品種不育基因類型），tms5含有tms5基因的品種較不含tms5基因pms3F:AGGCATGGTGAAGCAAA含有pms3基因的品種較不含pms3基因M:GAAGCAAAGAAATGCATTGTTTpms1含有pms1基因的品種較不含pms1基因4擴增產(chǎn)物加入2L上樣指示劑后于4℃保存。涂有剝離硅烷的一面朝下蓋于無凹槽玻璃板上，兩側(cè)對稱拔下玻璃板上的樣品梳，用清水洗凈點樣槽，再將玻璃板裝上電泳槽，上下槽右，停止電泳，一次性可檢測96×2=192出，在清水中漂洗1分鐘左右；最后取出膠板，晾干，放在膠片觀察燈下觀察，56用TE緩沖液1（或超純水）分別配制正向7A.3.3親和硅烷工作液