DB34T∕ 2815-2017 羽絨羽毛中沙門氏菌檢測方法 酶聯(lián)免疫法

DB34DB34/T2815—2017羽絨羽毛中沙門氏菌檢測方法酶聯(lián)免疫法MethodfordetectionofSalmonellaindownandfeather:Euzymelinkedimmunosorbentassay（ELISA）2017-03-30發(fā)布2017-04-30實施安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1GB/T6682分析實驗室用水規(guī)能吸附于宿主細胞表面或凝集豚鼠紅細胞。沙門氏菌具有復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)，一般沙門氏菌具有菌體(O)硝酸纖維素薄膜（0.45μm）、抽濾器、無菌錐形瓶、無菌塑料袋無菌吸管10ml(具0.1微量移液器及吸頭、無菌培養(yǎng)皿、無菌試管、pH計或pH試紙、全自動免疫酶標(biāo)分析儀、全自動微生27檢驗程序毛毛12g樣品+1200mLBPW兩份濾膜+100mLBPWXLD或沙門氏顯色挑取可疑菌落陽性酶聯(lián)免疫篩選陰性圖1羽絨羽毛中沙門氏菌的檢驗程序8操作步驟8.1試樣前處理用無菌鑷子和剪刀取出兩個各12g樣品，稱量，精確到0.1g,放入燒杯中，每個燒杯加入1200ml0.1%蛋白胨生理鹽水，室溫下，搖床搖勻(160rpm)或機械(加玻璃珠)攪拌3h,無菌紗布過濾后混合濾液，取2000ml原始濾液，用過濾器經(jīng)孔徑0.45μm濾膜過濾，濾膜取下，放入裝有1008.2沙門氏菌分離培養(yǎng)輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品前增菌混合液，移取1ml,轉(zhuǎn)種于10mlTTB中，于42℃±1℃培養(yǎng)18~24h。同時，另取1ml,轉(zhuǎn)種于10mlSC中，于36℃±1℃培養(yǎng)18～24h。3XLD瓊脂平板）。于36℃±1℃培養(yǎng)18～24h（沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或40～48h（BS瓊脂用SC或TTB前增菌的混合液，可直接用于全自動免疫酶標(biāo)分析儀進行初篩，初篩陰性可直接判初篩陽性的混合液用接種環(huán)劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板（或在選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)表2沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧KA+KA-AA+AA+/-+/--KK+/-+/-+/-，－：－：素瓊脂（pH7.2）、氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接將已挑菌落的平板儲存于2℃~5℃或室溫至少保留24h，以備必要時復(fù)查。4+---+++--+----+/-，－：－：反應(yīng)序號A2：補做甘露醇和山梨醇試驗，沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項實驗結(jié)果均反應(yīng)序號A3：補做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌，同時賴氨酸脫羧酶陽性，甲型副----+++-+ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ++--+-+++++----+----+-+--++------++-一般采用1.21.5％瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗用的抗原。O血清不凝集時，將菌株接種在5株接種在0.550.65％半固體瓊脂平板的中央，菌落蔓延生長時，在其邊緣部分取菌檢％～上部，在其中一個區(qū)域下部加1滴多價菌體（O）抗血清，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為用A～F多價O血清做玻片凝集試驗，同時用生理鹽水做對照。在生理鹽水中自凝者為被A～F多價O血清凝集者，依次用O4；O3不被A～F多價O血清凝集者，先用9種多價O血清檢查，如有其中一種血清凝集，則BBadi2無6——H多價2eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，——H多價3k，r，y，z，z10，lv，lw，lz1——H多價5z4z23，z4z24，z4z32每一個H抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)H單因子血清的檢查結(jié)果，沒有H單因子血清的要用兩用Vi因子血清檢查。已知具有Vi抗原的菌型有：傷寒沙門氏菌，丙型副傷寒沙門氏菌,都柏林7培養(yǎng)基和試劑ggggA.2.1基礎(chǔ)液硫代硫酸鈉（含5個結(jié)晶水）高壓滅菌121℃,20min。A.2.3碘溶液8加熱煮沸至完全溶解，高壓滅菌121℃,20min。A.3亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液使溶解，再加無菌蒸餾水至100mL即成，如9磷酸氫二鈉將前三種成分加入300mL蒸餾水（制作基礎(chǔ)液），硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉分別加入mL蒸餾水中，檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉分別加入另一20mL和30mL蒸餾水中，瓊脂加入餾水中。然后分別攪拌均勻，煮沸溶解。冷至80℃左右時，先將硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉混勻混合均勻，冷至50℃~55℃。加入煌綠溶液，充分混勻后立即傾注平皿。注：本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避免降ggggggggggg除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入400m蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入指示劑，待冷至50℃~55℃傾注平皿。注：本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，硫代硫酸鈉除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入400mgg將上述成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)A.7.2.1柯凡克試劑：將5g對二甲氨基A.7.2.2歐-波試劑：將1g對二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95％乙醇內(nèi)。然后緩慢加入濃鹽挑取小量培養(yǎng)物接種,在36℃±1℃培養(yǎng)1d～2d，必要時可培養(yǎng)4d～5d。加入柯凡克試劑約0.5mL，輕搖試管,陽性者于試劑層呈深紅色；或加入歐-波試劑約0.5mL，沿管壁流下，覆蓋于培養(yǎng)mL蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入gggg將除氰化鉀以外的成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，分裝后121℃高壓滅菌15min。放在冰箱內(nèi)使），試管內(nèi),每管約4mL,立刻用無菌橡皮塞塞緊,放在4℃冰箱內(nèi),至少可保存兩個月。同時，將不加氰化注：氰化鉀是劇毒藥,使用時應(yīng)小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分裝培養(yǎng)基應(yīng)在冰箱內(nèi)進行。試驗失敗的主要原A.10.1成分ggg從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察結(jié)果。氨基酸脫羧酶陽性者A.11.1成分A.11.2.1葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后，調(diào)節(jié)pH。按0.5％加入葡萄糖，分裝于有一個倒置小管種糖類分別配好10％溶液，同時高壓滅菌。將5mL糖溶液加入于100mL培養(yǎng)基從瓊脂斜面上挑取小量培養(yǎng)物接種，于36℃±1℃培養(yǎng),一般2d～3d。遲緩反應(yīng)需觀察14d~A.12.1成分A.13.1成分A.14.1成分S.paratyphiAaS.kisanganiaa-S.paratyphiBbS.limetebS.abonybS.wienbS.burycdS.readingS.chesterS.derbyS.agona-67]S.budapest-iS.kilwaⅡrzS.ituriS.oslo6,7,14a6,7,14bbS.paratyphiCcccS.lomita6,7,146,7,14-6,7,14-6,7,14i6,7,14kS.irumuS.mkambaS.bonn6,7,14S.gdansk6,7,1466,7,14r6,7,14ry6,7,14yy6,7,14y6,7,14106,7,146,7,146,7,1410abS.gatunibddS.kottbusiiiS.chaileyS.bardo8S.emek-iS.sendaiaS.typhid-dS.israel