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文檔簡介
第十四章真核生物的遺傳分析主要內容第一節(jié)真核生物基因組第二節(jié)真核生物基因組DNA序列的復雜性第三節(jié)基因家族第四節(jié)表觀遺傳學第五節(jié)遺傳標記第一節(jié)真核生物基因組
一、基因組的概念一個物種的單倍體染色體所攜帶的一整套基因(細胞遺傳學)一個生物物種所有的不同核酸分子的總和(分子遺傳學)一個生物物種結構和功能的所有遺傳信息的總和,包括全部的基因和調控元件等核酸分子(現(xiàn)代生物學)原核生物與真核生物基因組特點的異同相同點生物基本單位中的所有核酸序列組成都有重復序列和單一序列都是生物的遺傳物質異同點1.真核生物基因組指一個物種的單倍體染色體組(1n)所含有的一整套基因.還包括葉綠體.線粒體的基因組.
原核生物一般只有一個環(huán)狀的DNA分子.其上所含有的基因為一個基因組.2.原核生物的染色體分子量較小.基因組含有大量單一順序(unique-sequences).DNA僅有少量的重復順序和基因.
真核生物基因組存在大量的非編碼序列.包括:內含子和外顯子、基因家族和假基因、重復DNA序列.真核生物的基因組的重復順序不但大量.而且存在復雜譜系.3.原核生物的細胞中除了主染色體以外.還含有各種質粒和轉座因子.質粒常為雙鏈環(huán)狀DNA.可獨立復制.有的既可以游離于細胞質中.也可以整合到染色體上.轉座因子一般都是整合在基因組中.
真核生物除了核染色體以外.還存在細胞器DNA.如線粒體和葉綠體的DNA.為雙鏈環(huán)狀.可自主復制.有的真核細胞中也存在質粒.如酵母和植物.4.原核生物的DNA位于細胞的中央.稱為類核(nucleoid).
真核生物有細胞核.DNA序列壓縮為染色體存在于細胞核中.5.真核基因組都是由DNA序列組成.原核基因組還有可能由RNA組成.如RNA病毒.第一節(jié)真核生物基因組
二、基因組大小與C值C值:一個物種單倍體基因組的DNA含量是相對恒定的,它通常稱為該物種DNA的C值。
最小的C值:支原體(106bp),
最大的C值:某些顯花植物和兩棲動物(1011bp)
真核生物的基因組比較龐大
人:單倍體基因組3.16×109bp按1000個堿基編碼一種蛋白質計:理論上,有300萬個基因,實際大概10萬個基因
說明:有許多DNA序列并不轉錄成mRNA指導合成蛋白質。
C值悖理(Cvalueparadox):C值的大小并不能完全說明生物進化的程度和遺傳復雜性的高低,也就是說,物種的C值和它進化復雜性之間沒有嚴格的對應關系。三、真核生物基因組的結構特點真核生物基因組(EukaryoticGenome,EG)與原核生物基因組(ProkaryoticGenome,PG)相比有很大差異:(1)EG位于細胞核中,由數(shù)條具有多級空間結構的染色體組成;(2)具有多個復制起點,基因內有內含子;(3)存在著大量的非編碼DNA序列;(4)編碼蛋白質的基因多位于單拷貝序列中,同時還有大量的重復序列;(5)具有基因簇和基因家族;(6)具有生命所必須的細胞器基因組四、真核生物基因組DNA序列分類基因序列與非基因序列編碼序列與非編碼序列單一序列與重復序列第二節(jié)真核生物基因組DNA序列的復雜度真核生物基因組重復序列分類
(一)單拷貝序列(uniquesequence)亦稱非重復序列(nonrepetitivesequence):在一個基因組中只有一個拷貝或2-3個拷貝(二)中度重復序列(moderatelyrepetitivesequence)(三)高度重復序列(highlyrepetitivesequence)(二)重復序列1、串聯(lián)重復DNA序列只存在于真核基因組,由2~200bp的重復單位組成衛(wèi)星DNA(SatelliteDNA):在進行密度梯度離心時,某些高度重復DNA序列由于堿基組成和浮力密度與主體DNA有區(qū)別,會形成一系列的衛(wèi)星帶主帶:多由單拷貝序列組成,GC含量接近于基因組均值隱蔽衛(wèi)星DNA可變數(shù)目串聯(lián)重復序列Variablenumberoftandemrepeat,VNTR衛(wèi)星DNA中,有一類重復單位在11~60bp,總長度為幾百到幾千bp的重復序列,多位于近端粒處根據(jù)重復單位的大小又可分為:衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA三類,這類DNA多不具備轉錄能力衛(wèi)星DNA一般位于異染色質區(qū),通常位于著絲粒在染色體中可能有某種結構功能長度為100kb~數(shù)Mb衛(wèi)星DNA(satelliteDNA)重復順序:由2-10bp組成重復單位,重復單位成串排列而成由于這類序列的堿基組成不同于其他部份,可用等密度梯度離心法將其與主體DNA分開,因而稱為衛(wèi)星DNA(或隨體DNA)在人細胞組中,衛(wèi)星DNA約占5-6%,按其浮力密度不同,可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四種;果蠅的衛(wèi)星DNA順序已經(jīng)清楚,可分為三類,都是由7bp組成的高度重復順序:衛(wèi)星Ⅰ為:5’ACAACTT3’
衛(wèi)星Ⅱ為:5’ACAAATT3’蟹的衛(wèi)星DNA為只有AT兩個堿基的重復順序組成。小衛(wèi)星DNA核心重復序列由10~25bp組成總長度為0.1~30kb多位于靠近染色體末端的區(qū)域,也稱端粒小衛(wèi)星,微衛(wèi)星DNA由1~6個核苷酸為核心序列分散于整個基因組總長度<150bp高度重復順序的功能1.調節(jié)反向序列常存在于DNA復制起點區(qū)的附近。另外,許多反向重復序列是一些蛋白質(包括酶)與DNA的結合位點2.參與基因表達的調控DNA的重復順序可以轉錄到核內不均一RNA(hnRNA)分子中,并形成發(fā)夾結構,這對穩(wěn)定RNA分子,免遭分解有重要作用
3.參與轉位作用
幾乎所有轉位因子的末端都包括反向重復順序,長度由幾個bp
到1400bp,形成回文結構,在轉位作用中既能連接非同源的基因,又可以被參與轉位的特異酶所識別。4.與進化有關不同種屬的高度重復順序,具有種屬特異性,但相近種屬又有相似性。如:人與非洲綠猴的α衛(wèi)星DNA長度僅差1個堿基(前者為171bp,后者為172bp),而且堿基序列有65%是相同的,表明它們來自共同的祖先5.同一種屬中不同個體的高度重復順序的重復次數(shù)不一樣,這可以作為每一個體的特征,即DNA指紋6.α衛(wèi)星DNA成簇的分布在染色體著絲粒附近,可能與減數(shù)分裂時染色體配對有關,即同源染色體之間的聯(lián)會可能依賴于具有染色體專一性的特定衛(wèi)星DNA順序二、DNA序列分析方法DNA測序技術早在DNA雙螺旋結構(WatsonandCrick,1953)發(fā)現(xiàn)后不久就有報導(Whitfeld,1954),當時的測序的方法為降解法(sequencingbydegradation,SbD),但由于操作復雜,并沒有形成規(guī)模化的應用。1965,Cornall大學以S.W.Holle,為首的科學家小組,首次完成75個核苷酸的酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定。即利用各種RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸,經(jīng)分離純化后,再分別測定短片段順序。1968年華裔生物化學、生物學家吳瑞博士(Dr.RayWu)獨創(chuàng)性地設計出一種嶄新的引物一延伸測序策略,并于1971年首次成功地測定了λ噬菌體兩個COS末端的完整序列;1977,F(xiàn).Sanger在該策略的基礎上,發(fā)展出了快速測定DNA序列的末端中止法;K.Mullis采納他的方法,完善了PCR擴增DNA的方法;M.Smith發(fā)明了堿基定點突變技術。這三位科學家全都獲得了諾貝爾獎。Sanger等(1977):末端終止法,該技術引入了聚合酶和測序膠,使DNA測序走向了大規(guī)模實用化。經(jīng)過Melamede,1985;Cheesman,1991;Metzkeretal.,1994等,改良后成為迄今為止應用最為廣泛的測序技術。隨著技術的改進和創(chuàng)新(Juetal.,2000;Church,2002;Barnesetal.,2002;Mitraetal.,2003),聚合酶測序法又有了新的發(fā)展。另外,還有許多其他的測序策略:如連接酶測序法(sequencingbyligation,SbL)(Whiteleyetal.,1984;LandegrenandHood,1988;Drmanac,1992)、焦磷酸測序法(pyrosequencing)(Hyman,1988)雜交測序法(sequencingbyhybridization,SbH)(Drmanacetal.,1989;1998;2001)隨著基因組計劃和基因組學的進展,對原有技術的改造和新技術的發(fā)明,促使了新一代測序(nextgenerationsequencing,NGS)理念和測序儀的誕生,基因組學和功能基因組學進入了一個低成本、大規(guī)模、高通量測序的時代。1、Sanger測序法
雙脫氧末端終止法利用DNA聚合酶的兩種酶催反應特性:1、利用單鏈DNA模板,合成DNA互補鏈;2、利用2’,3’雙脫氧核苷三磷酸作底物,參入到寡核酸鏈的末端,從而終止DNA鏈的生長。有時也稱引物合成法,或酶催引物合成法。反應:同時加入引物和模板、DNA聚合酶1、一種ddNTP、以及四種dNTP(有一種帶放射性標記)。變性膠電泳分離反應混合物。放射自顯影術,檢測單鏈DNA片段的放射性帶。結果判讀,從放射性X光底片上,直接讀出DNA的核酸順序。GTACGTTGACGCCddATPddTTPddGTPddCTPddCTP
ddATP
ddGTP
ddTTPAGTCAGGATCACC在實際的DNA合成反應中,使用失去了5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶I的Klenow大片段。適當?shù)卣{整ddNTP和dNTP的比例,便能夠獲得良好的電泳譜帶模式。dNTP/ddNTP=1:100時,譜帶分離效果較佳,可讀出多于200個以上的核苷酸順序。2、化學降解法1977年由美國哈佛大學的A.M.Maxam和W.Gilbert發(fā)明,于1980年獲得諾貝爾化學獎原理1、利用末端標記使待測DNA帶放射性,2、利用不同化學藥品使DNA分別在特定堿基處斷裂,3、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離各組大小不同的DNA片段,根據(jù)特定的斷裂位置讀出DNA序列第三節(jié) 基因家族真核基因組中來源相同,結構相似,功能相關的一組基因。可能由某一共同祖先基因(ancestralgene)經(jīng)重復(duplication)和突變產(chǎn)生。家族成員可以分布于不同染色體上可集中于一條染色體上,串聯(lián)排列在一起,形成基因簇(genecluster)有些成員不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物,這種基因稱為假基因(Pseudogene)根據(jù)分布形式分基因簇和散布的基因家族:A基因簇(genecluster)基因家族的各個成員緊密成簇排列成大段的串聯(lián)重復單位,分布在某一條染色體的特殊區(qū)域;它們可同時發(fā)揮作用,合成某些蛋白質。如組蛋白基因家族聚集在第7號染色體長臂3區(qū)內Histonegenefamily
組蛋白基因家族假基因(pseudogene):具有與功能基因相似的序列,但由于有許多突變以致失去了原有的功能,所以假基因是沒有功能的基因,用ψ表示。來源:一般認為是由mRNA反轉錄成cDNA,然后整合在基因組中,假基因不含內含子。B散布的基因家族(interspersedgenefamily)概念:一個基因家族的不同成員成簇地分布不同染色體上,各成員在序列上有明顯差異。這些不同成員編碼一組功能上緊密相關的蛋白質,如珠蛋白基因家族。1)簡單基因家族◆特點:家族成員串聯(lián)排列在一起組成一個轉錄單位◆代表:
rRNA基因家族
(重復單元28S、18S、5.8s-rRNA)根據(jù)基因家族在基因組中的復雜程度分類2)復雜基因家族◆特點:相關基因家族排列在一起,之間有間隔序列,獨立的轉錄單位◆代表:
組蛋白基因家族間隔區(qū)3)發(fā)育相關復雜基因家族◆特點:分布在不同的染色體上獨立的轉錄單位基因順序與表達順序相關◆代表:珠蛋白基因家族根據(jù)基因家族成員序列的相似程度分類A經(jīng)典的基因家族,家族成員序列有高度的同源性,序列一致,拷貝數(shù)高,非轉錄間隔區(qū)短而一致。B基因家族各成員的編碼產(chǎn)物保守(大段的高度保守氨基酸序列);只是DNA序列的相似性低。C基因家族各成員的編碼產(chǎn)物之間只有很短的保守氨基酸序列,DNA序列的相似性更低。D超基因家族,各基因序列之間無同源性,但其基因產(chǎn)物的功能相似。編碼產(chǎn)物之間也無明顯的保守氨基酸序列,但也有一些共同特征。真核生物基因結構示意圖一、DNA與染色體染色體的單線性(mononemy):在真核細胞中每條染色由一個DNA分子組成,即一個DNA分子從染色體一端連續(xù)地走向另一端。單線性的證據(jù):蠑螈卵母細胞在雙線期的燈刷染色體和在黑腹果蠅細胞中抽取的DNA分子的相對分子質量測量。第四節(jié)真核生物基因組的包裝與表觀遺傳學修飾燈刷染色體(lampbrushchromosome)形如燈刷狀,是一類處于伸展狀態(tài)具有正在轉錄的環(huán)狀突起的巨大染色體。常見于進行減數(shù)分裂的細胞中。因此它常是同源染色體配對形成的含有4條染色單體的二價體。燈刷染色體首次由W.弗勒明在1882年報道,但未肯定這是一種染色體。1892年J.呂克特對在鯊魚卵母細胞中的這種巨大染色體的結構進行了研究,并因其形狀酷似歐洲當時擦洗煤油燈罩的燈刷,取名為燈刷染色體。50年代在H.G.卡倫等人改進了研究技術后,燈刷染色體的研究才蓬勃發(fā)展起來。不同物種燈刷染色體的大小十分懸殊。一般說來,凡單套染色體中DNA的含量(C值)高的動物,燈刷染色體大,側環(huán)長,而且燈刷染色體持續(xù)時間也比較長。兩棲類的具有最高的C值,燈刷染色體也最大,是研究燈刷染色體的常用材料,其中研究得最為詳盡的是某些有尾兩棲類。(1)燈刷染色體是兩棲類卵母細胞在進行減數(shù)分裂的第一次分裂時停留在雙線期的染色體,它是一個二價體,包含4條染色單體,此時同源染色體尚未完全解除聯(lián)會,因此可出現(xiàn)幾處交叉,當用RNA酶和胰蛋白酶去掉染色體中的RNA和蛋白質后,每條染色單體是一條連續(xù)的纖絲,其直徑為2-3nm,相當于一條DNA雙螺旋的直徑,進一步用DNase處理后,該纖絲斷裂,由此證明染色單體中每條染色單體的主體是一條連續(xù)的DNA雙螺旋分子。(2)野生型黑腹果蠅的細胞用去垢劑溶解并用蛋白酶消化,可得到近乎完整的染色體DNA分子。發(fā)現(xiàn)染色體大小與DNA分子相對分子質量密切相關,染色體愈大,所含DNA分子的相對分子質量愈大二、核小體結構與包裝模型(一)核小體模型核小體是構成染色質的基本結構單位,使染色質中DNA、RNA和蛋白質組成一種致密的結構。
(二)染色體包裝的四級結構(1)串聯(lián)排列直徑11nm的核小體的形成是DNA壓縮的第一步(2)在組蛋白H1存在下,核小體進一步螺旋化,每一圈由六個核小體構成外徑300nm,內徑10nm,螺距11nm的中空螺旋管。(3)螺旋管再次螺旋化形成直徑0.4nm的圓筒狀超螺旋管,DNA又壓縮了將近40倍,直徑加粗了10余倍。(4)超螺旋管再螺旋,折疊壓縮5倍而形成2-10的染色單體,即染色體包裝的四級結構。三、表觀遺傳學修飾(見另一PPT)第五節(jié)遺傳標記可識別的等位基因或DNA片段遺傳性和可識別性第五節(jié)遺傳標記一、遺傳標記的概念和類型二、分子遺傳標記的應用一、
遺傳標記的概念及其類型1、形態(tài)學標記2、細胞遺傳標記3、生化與免疫遺傳標記4、分子遺傳標記5、理想的分子遺傳標記應具備的特點一、
遺傳標記的概念及其類型(一)遺傳標記的概念
遺傳標記是指能夠用以區(qū)別生物個體或群體及其特定基因型、并能穩(wěn)定遺傳的物質標志。遺傳標記是一些等位基因或遺傳物質,能在生物體上以各種形式表現(xiàn)出各種變異。遺傳標記的概念經(jīng)歷了從宏觀到微觀、從外部到內部、從蛋白質到DNA的發(fā)展過程。1、形態(tài)學標記形態(tài)學標記(morphologicalmarker)
能夠用肉眼識別和觀察、明確顯示遺傳多樣性的外觀性狀。如,動物的毛色、角形、耳型、體型、外貌等。此法簡單直觀,但標記數(shù)目少、多態(tài)性低、易受環(huán)境影響。特點
簡單直觀,但標記數(shù)目少,多態(tài)性低,易受外界條件的影響;依據(jù)它進行選擇的準確性差,所需時間較長,選擇效率也較低。古代形態(tài)學標記公元前4000年,伊拉克的古代巴比倫石刻上記載了馬頭部性狀在5個世代的遺傳。伯樂相馬按圖索驥2、細胞遺傳標記細胞遺傳標記(cytologicalgeneticmarker)
主要是指染色體核型(染色體數(shù)目、大小、隨體、著絲粒位置、核仁組織區(qū)等)、帶型(Q、G、C、R帶型)和數(shù)量特征的變異等,它們分別反映了染色體在結構上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性。
染色體多態(tài)現(xiàn)象牛Y染色體的多態(tài)性豬銀染核仁組織區(qū)多態(tài)性結構異染色質多態(tài)性家豬X、Y染色體G帶示意圖細胞遺傳標記的特點不易受環(huán)境影響,呈孟德爾方式遺傳。多態(tài)性集中表現(xiàn)在染色體高度重復DNA結構的異染色質所在的部位。細胞遺傳標記經(jīng)常伴有對生物有害的表型效應,難以獲得相應的標記材料,或者觀測和鑒定比較困難,從而限制了細胞遺傳標記的應用。3、生化與免疫遺傳標記免疫遺傳學標記(immunogeneticalmarker)以動物的免疫學特性為標記,包括紅細胞抗原多態(tài)性和白細胞抗原多態(tài)性。
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紅細胞抗原多態(tài)性——血型,以細胞表面的抗原而定
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白細胞抗原多態(tài)性——主要組織兼容性復合體(MHC),以白細胞表面的抗原而定。生化遺傳標記(biochemicalgeneticmarker)主要是指在同一動物個體中具有相同功能的蛋白質存在兩種以上的變異體。有些可以用電泳方法區(qū)分其中的差異。同工酶與等位酶同工酶(isozyme):電泳可區(qū)分的同一種酶(系統(tǒng))的不同變化等位酶(allozyme):由一個位點的不同等位基因編碼的同種酶的不同類型,其功能相同但氨基酸序列不同生化與免疫遺傳標記的特點與形態(tài)學標識和細胞遺傳標記相比,數(shù)量更豐富,受環(huán)境影響更小,檢測手段簡便,是一種較好的遺傳標記。血液型和蛋白質型都是基因表達的產(chǎn)物,局限于反映基因組編碼區(qū)的遺傳信息,且標記的數(shù)量還比較有限,不能很好地覆蓋整個基因組。4、分子遺傳標記分子遺傳標記(moleculargeneticmarker)是一種新的以DNA多態(tài)性為基礎的遺傳標記.在遺傳學研究中廣泛應用的DNA分子標記已經(jīng)發(fā)展了很多種。分子標記的分類一般依其所用的分子生物學技術大致可以分為兩大類:
(1)基于Southern雜交技術的RFLP,為第一代分子標記。(2)基于PCR技術為核心的分子標記,(如RAPD、AFLP、SSR、DNA指紋和mtDNA)等,為第二代分子標記;單核苷酸多態(tài)性(SNP)標記被稱為第三代分子標記。英文縮寫英文名稱中文名稱RFLPRestrictionfragmentIength
polymorphism限制性片段長度多態(tài)性STSSequencetaggedsite序列標簽位點RAPDRandomamplifiedpolymor-PhicDNA隨機擴增多態(tài)性DNAAFLPAmplifiedfrangmentlengthPolymorphism擴增片斷長度多態(tài)性SSRSimplesequencerepeat簡單序列重復SNPSimplemucleotide
polymor-phism單核苷酸多態(tài)性幾種主要的DNA分子標記DNA多態(tài)現(xiàn)象產(chǎn)生的原因單個核苷酸的點突變即核苷酸的替換單一DNA序列的插入或缺失整串DNA序列的插入或缺失基因轉換
(一)限制性片段長度多態(tài)性(restictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)
RFLP是1980年建立的第一代分子遺傳標記。原理:用限制性內切酶切割不同個體的DNA時,如果存在酶切位點的變化,就會產(chǎn)生長度不同的DNA片段,電泳后用克隆探針檢測時,就會出現(xiàn)泳動行為的改變。
基本過程圖14-1RFLP示意圖限制性片段的制備電泳Southern印跡與放射性探針雜交放射性自顯影圖14-2RFLP檢測RFLP標記特點A無表型效應,RFLP標記的檢測不受環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響。BRFLP標記在等位基因之間是共顯性的,因此在配制雜交組合時不受雜交方式的影響。C在非等位的RFLP標記之間不存在上位效應,因而互不干擾DRFLP標記起源于基因組DNA的自身變異,在數(shù)量上幾乎不受限制EDNA需要量大,檢測技術繁雜,難以用于大規(guī)模的育種實踐中。在動物分子標記輔助育種中需要將RFLP轉換成以PCR為基礎的標記。PCR-RFLP將PCR技術用于RFLP分析,即PCR-RFLP。該技術先用1對引物特異性擴增基因組的某一高變區(qū),然后用限制性內切酶消化PCR產(chǎn)物,電泳檢測多態(tài)性。PCR-RFLP分析省去了探針的制備、分子雜交等繁瑣的過程,DNA需求量也少,大大簡化了傳統(tǒng)的RFLP技術。
DNA多態(tài)現(xiàn)象檢測的原理-RFLPsA
B電泳圖譜AABBAB圖14-3PCR—RFLP圖14-4PCR—RFLPPCR-RFLP的應用???
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???√MstⅡ酶切位點×MstⅡ酶切位點消失PCR-RFLPProValGluProGluGlu123正常雜合異常圖14-5
PCR-RFLPAmismatchedPCR-basedtestandRFLPmethodswereusedfordetectionofIGF-IIgenotypes
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accggggcgcGAR2F2:gccgcggcttcgcctaTgAtcF3R3:ccccacgcgctcccgTgctgR1F1PIGF2-intron3引物設計表1目的基因引物序列Table1Theprimersequencesofthetargetgenes引物序列PCR產(chǎn)物/bpPCR條件內切酶名稱PrimersequencesPCRproductsPCRcoditionsNameofenzymeF1:5'--ACCGAGCCAGGGACGAGCC--3'R15'--CGAGGAGGCCCGCGGACT--3'11494℃,2min;30×(94℃,30s,6℃,1min,72℃,1min);72℃,7minTseⅠF2:5--GCCGCGGCTTCGCCTATGATC--3′R2:5--GCTGGAAGGGAGGAAGCCGAGA--3′17094℃,2min;33×(94℃,30s,62℃,45s,72℃,1min);72℃,7minBCLⅠF3:5'--TCCCCAAGCAAAACTGGTTTCGCC--3'R3:5'--CCACGCGCTCCCACGCTG--3'19194℃,3min;30×(94℃,30s,59.5℃,30s,72℃,30s);72℃,7minDraⅢ豬IGF-II基因PCR-RFLP分析
M123456M12345678注:M為PBR322-MspIdigestDNAmaker,泳道1、3、7為GA基因型,泳道2、5、6、8為AA基因型,泳道3為GG基因型牛β-LG基因的PCR-RFLP分析圖(二)串聯(lián)重復序列標記tandemrepeatedsequence,TRS真核生物基因組中的可變串聯(lián)重復序列(variablenumbertandemrepeatedsequence,VNTR)有兩類:小衛(wèi)星和微衛(wèi)星,兩者具有高度的變異性。圖7-6衛(wèi)星DNA(1)小衛(wèi)星(minisatelliteDNA)小衛(wèi)星DNA是一種可變數(shù)量的串聯(lián)重復,在不同個體和基因組的不同位點上數(shù)目都不同。小衛(wèi)星重復單位的核心序列為15-76bp近緣物種和個體間的小衛(wèi)星核心序列有著一定的同源性,在一定的條件下可以相互雜交。
用內切酶把總DNA切成不同長度的片段(VNTR上沒有酶切位點),再以VNTR中的特殊序列為探針進行Southern雜交,由于不同個體的這種串聯(lián)重復的數(shù)目及位置不同,所以VNTR的Southern雜交譜帶具有高度的個體特異性,故又稱其為DNA指紋(DNAfingerprints)。DNA指紋圖譜原理①選擇在VNTR特異序列上沒有酶切位點的限制性內切酶將動物總基因組DNA切成不同長度的片段②以VNTR中特異序列作為探針,進行Southern雜交,③由于不同個體的串聯(lián)重復序列的數(shù)目和位置不同,形成的雜交譜帶具有個體的特異性,人們稱為DNA指紋圖譜(DNAfingerprinting,DFP)VNTR示意圖123A
B
C123VNTR變異的原理示意圖⑵微衛(wèi)星(microsatelliteDNA,MS)又稱簡單序列重復(simplesequencerepeat,SSR)是高度重復序列,廣泛存在于真核生物基因組,重復單位的核心序列為2~6bp。微衛(wèi)星標記的形成示意圖微衛(wèi)星遺傳標記的原理以微衛(wèi)星DNA標記兩側特異性序列設計專一引物,通過PCR技術擴增微衛(wèi)星片段,擴增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,不同個體間因核心序列的重復次數(shù)不同而產(chǎn)生DNA多態(tài)性。微衛(wèi)星遺傳標記示意圖ABPCR擴增凝膠電泳123
AAAB
BB
S0222
1234567891011
309-
242-238-217-201-190-180-160-147-Lane3:PBR322/MSP1marker;1:(202,202);2:(190,190);4:(202,186);5:(208,182);6:(206,206);7:(204,182);8:(202,186);9:(198,176);10:(202,186);11:(198,176);地方雞種ADL210微衛(wèi)星引物擴增結果一個家系的微衛(wèi)星PCR檢測結果微衛(wèi)星遺傳標記的特點分布廣泛均勻多態(tài)信息含量豐富呈共顯性遺傳穩(wěn)定性好,可重復性好分析技術易于實現(xiàn)自動化開發(fā)成本高微衛(wèi)星標記的應用領域遺傳圖譜的構建連鎖分析特殊的基因(如致病基因)姻親分析樣品鑒定(如父本分析、血緣分析、雜種分析)物種和居群遺傳多樣性群體遺傳學分析(如有效群體大小、群體遺傳結構、群體分化、遷移與基因流動(三)RAPD標記隨機擴增多態(tài)DNA((RandomAmplifiedPolymorphicDNA):其原理是基于PCR技術,由人工隨機合成的DNA分子為引物,以基因組DNA為模板,進行多態(tài)性DNA片段的隨機合成。對擴增產(chǎn)物進行電泳、染色分析,就可直接在紫外光線下看到新合成的DNA分子片段形成的不同條帶。RAPD原理示意圖若位點2處堿基發(fā)生改變,則不同品種雞基因組的RAPD分析圖RAPD的缺點:
RADP圖譜中某些弱帶重復性較差,目前,引物長度和序列及應用的引物數(shù)目、擴增反應條件等實驗技術方面未標準化,影響了不同條件下結果的可比性;每個標記含有的信息量??;有假陽性或假陰性結果;顯性標記,無法區(qū)分從一個位點擴增的DNA片段是純合的還是雜合的,無法進行等位基因分析。用在種以上類群間的比較時無法得到可靠的遺傳距離(四)線粒體DNA標記線粒體基因組具有的獨特優(yōu)點:線粒體DNA分子小、拷貝數(shù)高;結構和組織簡單而高度保守;母系遺傳,缺乏重組;DNA突變率高.(五)單核苷酸多態(tài)性標記(SNP)singlenucleotidepolymorphism是指染色體上的某個存在單個堿基的變化,包括單堿基的轉換、顛換、插入及缺失等。SNPsinhumanpopulationInter-genicregionsCodingregionsEvery1400bpEvery1430bp
SNP與RFLP、STR等標記不同之處在于不以“長度”差別為檢測手段,而是直接以序列的變異作為標記。
基因組DNA某一特定的核苷酸位置上,可能發(fā)生單個堿基的變化,如轉換、顛換等,使得群體中基因組的某些位點上存在差異。
SNP就是指基因組內特定的核苷酸位置上存在兩種以上不同的核苷酸,其中最少一種在群體中的出現(xiàn)頻率不少于1%(低于1%則視為突變)。
(五)單核苷酸多態(tài)性標記(singlenucleotidepolymorphism,SNP)
SNP是出現(xiàn)頻率最高的標記,人類基因組中平均每1000bp中就有1個SNP,總數(shù)可達300萬個。位于基因表達序列內的SNP可能會影響蛋白質的結構和表達水平,對分析基因與性狀的關系有重要意義。
SNP是單堿基突變,任何用于單堿基突變的技術都可用于SNP檢測,如RFLP、DNA序列分析、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)等。最先進的是微數(shù)列矩陣DNA芯片(DNAchip)技術。
SNP標記的特點⑴高密度
SNP是基因組中最普遍、頻率最高的遺傳標記。單個SNP雖然只有兩個等位基因,多態(tài)信息含量不如微衛(wèi)星位點,但其高密度彌補了其不足。⑵代表性
某些位于基因表達序列內的SNP(coding
SNP,cSNP),有可能直接影響蛋白質結構或表達水平,鑒別cSNP對于復雜表型性狀與基因變異之間的關聯(lián)分析具有重要意義。⑶易實現(xiàn)自動化分析
雙等位標記,檢測時只需“有或無”表示。DNA芯片技術實驗了SNP分析的高通量、微型化和自動化。SSCP單鏈構象多態(tài)性:SSCP(SingleStrandConformationpolymorphism):指等長的單鏈DNA因核苷酸序列的差異而產(chǎn)生的構象變異,在非變性聚丙烯酰胺中表現(xiàn)為電泳遷移率的差別。雞IGFBP2基因的PCR-SSCP分析圖
AGAAAG
CATGCATGCATGPRLR3PRLR6atacttctttccaagaggaagtggatacttctttccaaggggaagtgg5’-UTRgaattaaa…tctccgcccgaatcaaa…tctccacccLeu340Ser基因芯片基因芯片(genechip)
:是指采用原位合成或顯微打印手段,將數(shù)以萬計的DNA探針固化于支持物表面上,產(chǎn)生二維DNA探針陣列,然后與標記的樣品進行雜交,通過檢測雜交信號來實現(xiàn)對生物樣品快速、并行、高效地檢測或醫(yī)學診斷,由于常用硅芯片作為固相支持物,且在制備過程運用了計算機芯片的制備技術,所以稱之為基因芯片技術?;蛐酒膽茫?)基因表達分析;(2)測序;(3)尋找變異、多態(tài)性(SNP);(4)藥物篩選;(5)基因診斷分子遺傳標記的特點無表型效應;不受環(huán)境的限制和影響;普遍存在于所有生物;數(shù)量豐富;遺傳多態(tài)性高;檢測方法簡單快捷;遺傳共顯性,能分離出等位基因的三種基因型。5、理想的分子遺傳標記應具備的特點遺傳多態(tài)性高;檢測手段簡單快捷,易于實現(xiàn)自動化;遺傳共顯性,即在分離群中能夠分離出等位基因的3種基因型。標記遍布整個基因組;準確性,能正確反映動物的真實遺傳,即標記是經(jīng)濟性狀基因,還是與影響重要性的性狀連鎖。實驗重復性好(便于數(shù)據(jù)交換);開發(fā)成本和使用成本盡量低廉。二、分子遺傳標記的應用○個體及親緣關系的鑒定DNA指紋○遺傳資源的評估、監(jiān)測、保護和利用○基因定位和遺傳圖譜的構建○標記輔助選擇第六節(jié)基因組學一、產(chǎn)生背景及概念二、基因組學分類三、結構基因組學四、功能基因組學五、比較基因組學一、產(chǎn)生背景及概念1.背景:
1985年提出人類基因組計劃(HGP),隨著HGP的提出和實施,產(chǎn)生的基因組學。
一、人類基因組計劃完成帶來的挑戰(zhàn)1.100多個物種的基因組測序已經(jīng)完成;2.>4,000個物種的基因組計劃正在進行;3.比較基因組學:比較多個物種的基因、蛋白質的序列來揭示功能的保守性,并發(fā)現(xiàn)新的規(guī)律。DNA雙螺旋基因的結構基因:可遺傳1.遺傳的基本功能單位2.基因由DNA編碼3.一個基因編碼一條蛋白質4.基因序列的改變可能導致功能及表型的改變基因型(Genotype)->
表型(Phenotype)經(jīng)典遺傳學:Antennapedia1.antenna-觸角,pedia-足2.觸足突變3.同源異型基因:homeoticgenes4.Antennapedia:hoxgeneAntennapedia經(jīng)典遺傳學:Huntington'sdisease1.Huntington‘sdisease:亨廷頓舞蹈病2.Huntingtin(11-41):FESLKSFQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQP人類基因組計劃1.搞清楚人類基因組的DNA堿基的內容和順序2.編碼區(qū)(編碼蛋白的DNA序列):占基因組的<2%3.非編碼區(qū):功能?a.非編碼RNA:具有調控功能b.重復片段:維持基因組的結構?c.轉座子基因概念的延伸:生物體的復雜性1.人類基因組:~22,000個基因vs.100,000個蛋白質——可變剪切(AlternativeSplicing)2.表觀遺傳學遺傳信息的傳遞:中心法則1.DNA自身通過復制傳遞遺傳信息;2.DNA轉錄成RNA;3.RNA自身能夠復制(RNA病毒);4.RNA能夠逆轉錄成DNA;5.RNA翻譯成蛋白質。2.基因組學的概念以分子生物學技術、計算機技術和信息網(wǎng)絡技術為研究手段,以生物體內全部基因為研究對象,在全基因背景下和整體水平上探索生命活動的內在規(guī)律及其內外環(huán)境影響機制的科學。3、基因組學的發(fā)展歷程流感嗜血桿菌(haemophilus
influenzae)
1995年7月第一個細菌基因組全序列發(fā)表,大小為1.8
Mb。含1703個基因或開放閱讀。這是微生物乃至整個生物學領域的一個里程碑.(Science)1997年9月,大腸桿菌的完整基因圖譜已繪制成功,基因組全序列完成,全長為5Mb,共有4288個基因,同時也搞清了所有基因產(chǎn)物的氨基酸序列.啤酒酵母,1997年,第一個真核生物基因組圖譜公布。秀麗線蟲(caenorhabditis
elegans)
1998年12月完成了基因組測序?;蚪M大小100Mb,分布于6條染色體,預測有19,099個基因。果蠅Celera公司2000年3月宣布了基因組全序列為180Mb。有13601個基因,其中一半的基因功能還沒有搞清楚,有1600個堿基跨度區(qū)仍未能完全測序。2000年12月,第一個植物基因組——擬南芥基因組被全部測序,遺傳圖譜、物理圖譜建立,序列大小為125Mb?;蚪M測序區(qū)段覆蓋了全基因組的115.4Mb,分析共含有25498個基因,編碼蛋白來自11000個家族。2001年2月中旬,《Nature》與《Science》分別發(fā)表了人類基因組工作框架圖,報告人類基因組共有30億個堿基對,預測編碼基因31000個,比最初預測的10萬個編碼基因數(shù)大大減少。2002年4月,水稻基因組圖譜公布。2002年
小鼠、瘧原蟲和按蚊基因組測序完成鼠基因組共有約27億個堿基對,比人類少15%,但其包含的基因數(shù)目約在3萬個左右,與對人類基因數(shù)的最新估計非常接近。2003年
人類基因組計劃宣布,人類基因組序列圖繪制成功,人類基因組計劃的所有目標全部實現(xiàn)人類遺傳變異圖譜研究以及黑猩猩基因組測序計劃開始2003年11月,世界上首個復雜生物體的蛋白圖譜--果蠅蛋白圖譜公布,從而實現(xiàn)了只顯示遺傳密碼的基因圖譜到揭示遺傳密碼功能的蛋白圖譜的飛躍。這個果蠅(Drosophilamelanogaster)蛋白圖譜發(fā)表在《科學》雜志的網(wǎng)絡版上這篇研究發(fā)布的這個含有7,000多個果蠅蛋白的圖譜涵蓋了這些蛋白之間超過20,000種不同的互作。這些果蠅蛋白有許多與人類蛋白類似,適于作為研制小分子藥物如用于治療癌癥、心臟病和糖尿病的口服藥片等的靶點2004年3月1日多國科學家組成的兩個研究小組宣布繪制出雞的基因序列草圖和遺傳差異圖譜。
科學家選取了家雞的遠祖——紅原雞為測繪對象,繪制出了草圖中約10億個堿基對,相當于人類的三分之一。科學家在9日出版的《Nature》雜志上載文說,分析發(fā)現(xiàn),紅原雞約有2萬到2.3萬個遺傳基因,與人類數(shù)量基本持平,其中有60%與人類相同。雞基因組的分析還僅僅是開始,不過已經(jīng)得出了一些出人意料的結果??茖W家們發(fā)現(xiàn),控制雞生成角蛋白的基因與預想的不同。角蛋白構成人類的頭發(fā)、指甲,以及鳥類的喙和羽毛,科學家一直認為哺乳動物和鳥類的角蛋白來源相同。但圖譜顯示,雞的角蛋白基因與哺乳動物的區(qū)別很大??茖W家由此推測,角蛋白可能獨立進化出了兩次。意外的發(fā)現(xiàn)另外,此前科學界一致認為雞沒有嗅覺,但是分析結果表明雞具有大量的嗅覺基因,味覺基因卻很缺乏。分析還發(fā)現(xiàn),雞缺乏人類所具有的產(chǎn)生乳汁、唾液和牙齒的基因。意外的發(fā)現(xiàn)雞基因組研究的意義雞是研究低等脊椎動物和人類等哺乳動物的一種比較理想的中介。將人類基因組與雞等其他生物的基因組進行比較,有助于更深入理解人類基因的結構和功能,進而開發(fā)治療疾病的新手段,對于培育優(yōu)質雞種、改善食品安全、控制禽流感病毒的蔓延也有重要意義。雞是種常見的家禽,長期受到進化生物學家的青睞。它的基因序列也有助于科學家了解農(nóng)業(yè)和進化學上重要特性的遺傳學基礎。雞的進化研究轉基因小雞對雞和人類的基因組進行比較后發(fā)現(xiàn)約七千萬個堿基對是共有的。這暗示著在大約三億一千萬年前二個物種從共同祖先分化出來的時候,遺傳物質具有守恒性。雞和所有的哺乳動物多起源于恐龍鳥類的祖先——始祖鳥“分道揚鑣”在鳥類和哺乳動物分離的時候,雞獲得了生成羽毛和喙的蛋白質的基因,而哺乳動物獲得了毛皮蛋白質的基因,喪失了與蛋清和蛋黃有關的基因。雞的基因組比哺乳動物的緊湊的多,它擁有2萬到2.3萬個基因,
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