(高清版)DB34∕T 1433-2011 抗蟲和耐除草劑玉米Bt11及其衍生品種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法　　

ICS65.020.20DB34/T1433—2011抗蟲和耐除草劑玉米Bt11及其衍生品種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法實(shí)施安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB34/T1433—2011本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所和安徽省標(biāo)準(zhǔn)化研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：汪秀峰、楊劍波、馬卉、李莉、張士勝、陸徐忠、倪大虎、宋豐順、楊亞春、倪金龍、陳萍、張毅。I1DB34/T1433—2011抗蟲和耐除草劑玉米Bt11及其衍生品種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T672轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測通用要求和定義NY/T673轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測抽樣農(nóng)業(yè)部869號公告-3-2007抗蟲和耐除草劑玉米BT11及其衍生品種定性PCR方法Bt11轉(zhuǎn)化體特異性序列event-specificsequenceofBt112DB34/T1433—2011是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。4原理5.270%乙醇(V/V)。中，配成10mg/mL的濃度，于100℃加熱15min,緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20℃。5.410mol/LNaOH溶液：在160mL水中加入80.0g氫氧化鈉(NaOH),溶解后再加水定容到200mL。5.5500mmol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液(pH8.0):稱取乙二銨四乙酸二鈉(EDTA-Na2)18.6g,加pH至8.0,加水定容到100mL,在103.4kPa(121℃)滅菌20min。5.6TE緩沖液(pH8.0):1mol/LTris-HCl(pH8.0)10mL和500mmol/L用水定容至1000mL。5.9引物和探針：序列信息應(yīng)按附錄A執(zhí)行。用TE緩沖液(5.6)或重蒸餾水將上述引物和探針稀釋注：探針應(yīng)避光保存。3DB34/T1433—20116儀器6.1分析天平：感量0.1g和0.1mg。6.2普通PCR儀和Real-timePCR儀。7操作步驟的比值在1.7～2.0時(shí)，滿足PCR檢測要求。7.6PCR定性檢測按農(nóng)業(yè)部869號公告-3-2007規(guī)定的執(zhí)行。當(dāng)PCR反應(yīng)體系正常工作時(shí)，試樣中擴(kuò)增出內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb,說明試樣提取的DNA滿足PCR不含有轉(zhuǎn)化體Bt11。試劑要求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。每個(gè)反應(yīng)體系設(shè)置3個(gè)平行。4DB34/T1433—2011或空白對照熒光值低于陰性對照和陽性對照熒光值的15%,表明反應(yīng)體系正常工作；在擴(kuò)增檢測轉(zhuǎn)化a)試樣中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因檢測Ct值≤36,轉(zhuǎn)化體Bt11檢測Ct值≥40,則表明該試樣中不含轉(zhuǎn)基因b)試樣中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因檢測Ct值≤36,轉(zhuǎn)化體Bt11檢測Ct值≤36,則表明該試樣中含有轉(zhuǎn)基因c)試樣中轉(zhuǎn)化體Bt11檢測Ct值在36～40,則需調(diào)整模板濃度，重新檢測。經(jīng)重復(fù)檢測后，當(dāng)檢測體系正常時(shí)，轉(zhuǎn)化體Bt11檢測Ct值<40,則表明該試樣中含有轉(zhuǎn)基因成分Btl1,表述轉(zhuǎn)基因抗蟲和耐除草劑玉米Btl1的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測過程的防污染措施應(yīng)符合NY/T672的規(guī)5DB34/T1433—2011(規(guī)范性附錄)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測引物和探針序列信息表A.1被檢測基因引物或探針序列擴(kuò)增長度/bpzSSIIbzSSIIb-F:5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-388bpzSSIIb-R:5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'zSSIIb-P:5′-FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-TAMRA-3Bt11Btl1-F:5′-GTGTGGAATTGTGAGCGGATAAC-393bpBt11-R:5′-CCGAGGAGGTTTCCCGATATTAC-3′Bt11-P:5′-FAM-AAAGTCTCAATAGCCCTCTGGTCTTCTGACGAG-BHQ1-36DB34/T1433—2011(規(guī)范性附錄)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測反應(yīng)體系終濃度水2×TaqManMix10Hmol/L下游引物0.2Hmol/L25mg/LDNA模板總體積注1:如果PCR緩沖液中含有氯化鎂，則不加氯化鎂溶液，加等體積無菌水。注2:玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PCR檢測反應(yīng)體系中，上下游引物和探針分別為zSSIIb-F/R和zSSIIb-P;轉(zhuǎn)基因玉米Bt11轉(zhuǎn)化體PCR