HPLC培訓(xùn)教材資料

HPLC培訓(xùn)教程

我國(guó)藥典收載高效液相色譜法項(xiàng)目和數(shù)量比較表:

數(shù)量

方法項(xiàng)目

1985年版1990年版1995年版2000年版

鑒別934150

HPLC法檢查1240160

含量測(cè)定760117387

鑒于HPLC應(yīng)用在藥品分析中越來越多，因此每一個(gè)藥品分析人員應(yīng)該掌握并應(yīng)用HPLCo

I.概論

一、液相色譜理論發(fā)展簡(jiǎn)況

色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于

與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用(吸附、分配、離子吸引、排阻、親和)的大小、

強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析

法。

色譜法最早是由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特(Tswett)在1906年研究用碳酸鈣分離植物

色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、

薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。

液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相，

稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)(常有幾個(gè)小時(shí))。高效液相色譜法(High

performanceLiquidChromatography,HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年

代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒

小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液

相色譜法(HighPressureLiquidChromatography,HPLC)。又因分析速度快而稱為高

速液相色譜法(HighSpeedLiquidChromatography,HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。

二、HPLC的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)

HPLC有以下特點(diǎn)：

高壓一壓力可達(dá)150~300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm2以上。

高速一流速為0.1~10.0ml/mino

高效一可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。

高靈敏度一紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.Olngo同時(shí)消耗樣品少。

HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：

速度快一通常分析一個(gè)樣品在15~30min,有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。

分辨率高一可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。

靈敏度高一紫外檢測(cè)器可達(dá)0.Olng,熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.lpgo

柱子可反復(fù)使用一用一根色譜柱可分離不同的化合物。

樣品量少，容易回收一樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

三、色譜法分類

按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于

分離揮發(fā)性化合物。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC),

其中以GLC應(yīng)用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。

LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC),

它以超臨界流體(界于氣體和液體之間的一種物相)為流動(dòng)相(常用C02),因其擴(kuò)散系

數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析時(shí)間短，特別適用于手性化合物的拆分。

按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜

法(EC,又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC)和親和色譜法。(此外還

有電泳。)

按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。

四、色譜分離原理

高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與

反相)、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分子排阻色譜法。

1.液固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相

對(duì)組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個(gè)吸附一解吸附的平衡過程。常用的吸附

劑為硅膠或氧化鋁，粒度510tlm。適用于分離分子量2001000的組分，大多數(shù)用于非

離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。

2.液液色譜法使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而

形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。

分離過程是一個(gè)分配平衡過程。

涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從

擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號(hào)流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動(dòng)相

中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失,

現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氟基柱和苯

基柱。

液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法

(RPC)o

正相色譜法采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與晴基鍵合相)；流動(dòng)相為相對(duì)非

極性的疏水性溶劑(烷燒類如正己烷、環(huán)己烷)，常加入乙醇、異丙醇、四氫吠喃、三氯

甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類、胺

類、默基類及氨基酸類等)。

反相色譜法一般用非極性固定相(如C18、C8)；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲

醇、乙晴、異丙醇、丙酮、四氫吠喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分

離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整

個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。

隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣

品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH

值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5(2~8),太高的pH值會(huì)使

硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在pH1.5~10范圍操

作。

正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法反相色譜法

固定相極性高?中中?低

流動(dòng)相極性低?中中?高

組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出

從上表可看出，當(dāng)極性為中等時(shí)正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線(如氨基

鍵合固定相)。

3.離子交換色譜法固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚

合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上竣基、磺酸基(稱陽離子交換樹脂)或季氨基(陰離

子交換樹脂)。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相

同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的

電荷吸引力而分離。

緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟

組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度

影響。pH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動(dòng)相的鹽濃度大，

則離子強(qiáng)度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。

離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。

4.離子對(duì)色譜法又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測(cè)組分

離子與離子對(duì)試劑離子形成中性的離子對(duì)化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從

而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。

分析堿性物質(zhì)常用的離子對(duì)試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另

外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對(duì)。

分析酸性物質(zhì)常用四丁基季鏤鹽，如四丁基澳化鍍、四丁基鏤磷酸鹽。

離子對(duì)色譜法常用ODS柱(即C18),流動(dòng)相為甲醇-水或乙月青-水，水中加入3~10

mmol/L的離子對(duì)試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測(cè)組分保時(shí)間與離子對(duì)性質(zhì)、

濃度、流動(dòng)相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。

5.排阻色譜法固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶

劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長(zhǎng)；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，

直接隨流動(dòng)相流出。它利用分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分

離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。

被分離組分在柱中的洗脫原理

II.基本概念和理論

一、基本概念和術(shù)語

1.色譜圖和峰參數(shù)

色譜圖(chromatogram)——樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器，所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線，又稱

色譜流出曲線(elutionprofile)0

基線(baseline)——經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測(cè)器測(cè)出一段時(shí)間的

流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。

噪音(noise)——基線信號(hào)的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過載、檢測(cè)器不穩(wěn)定、

流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致。

漂移(drift)——基線隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及

流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會(huì)產(chǎn)生漂移。

色譜峰(peak)——組分流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部

分。正常色譜峰近似于對(duì)稱形正態(tài)分布曲線(高斯Gauss曲線)。不對(duì)稱色譜峰有兩種：

前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)□前者少見。

拖尾因子(tailingfactor,T)——T=,用以衡量色譜峰的對(duì)稱性。也稱為對(duì)稱因子

(symmetryfactor)或不對(duì)稱因子(asymmetryfactor)□《中國(guó)藥典》規(guī)定T應(yīng)為

0.95^1.05oTVO.95為前延峰,T>1.05為拖尾峰。

峰底一基線上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。

峰高(peakheight,h)一峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。

峰寬(peakwidth,W)一峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。W=4。

半峰寬(peakwidthathalf-height,Wh/2)一峰高一半處的峰寬。Wh/2=2.355o

標(biāo)準(zhǔn)偏差(standarddeviation,o)一正態(tài)分布曲線x=±1時(shí)(拐點(diǎn))的峰寬之半。

正常峰的拐點(diǎn)在峰高的0.607倍處。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分

散程度。。小，分散程度小、極點(diǎn)濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，。大，峰形胖、

柱效低。

峰面積(peakarea,A)一峰與峰底所包圍的面積。A=XoXh=2.507oh=l.064Wh/2h

2.定性參數(shù)(保留值)

死時(shí)間(deadtime,t0)——不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相(溶劑)通過色譜柱的時(shí)

間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測(cè)定死時(shí)間。

死體積(deadvolume,Vo)——由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測(cè)器流動(dòng)池未被固定相所占據(jù)的空間。

它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙(被流動(dòng)相占據(jù)，Vm)、

柱出口管路體積、檢測(cè)器流動(dòng)池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只

起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。Vo=FXto(F為流速)

保留時(shí)間(retentiontime,tR)——從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)

間。

保留體積(retentionvolume,VR)---從進(jìn)樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)流

出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR=FXtE

調(diào)整保留時(shí)間(adjustedretention結(jié)構(gòu)time,t'R)扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間。也

稱折合保留時(shí)間(reducedretentiontime)□在實(shí)驗(yàn)條件(溫度、固定相等)一定時(shí)，

t'R只決定于組分的性質(zhì)，因此，t’R(或tQ可用于定性。t'R=tR—10

調(diào)整保留體積(adjustedretentionvolume,V'R)---扣除死體積后的保留體積。V'R

==

VR—V?；騐RFXtR

3.柱效參數(shù)

理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber,N)---用于定量表示色譜柱的分離效率(簡(jiǎn)

稱柱效)。

N取決于固定相的種類、性質(zhì)(粒度、粒徑分布等)、填充狀況、柱長(zhǎng)、流動(dòng)相的種

類和流速及測(cè)定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。如果峰形對(duì)稱并符合正態(tài)分布,N可近似表示為：

N=()2=16()2=5.54()2

N為常量時(shí)，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當(dāng)，

則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。

用半峰寬計(jì)算理論塔數(shù)比用峰寬計(jì)算更為方便和常用，因?yàn)榘敕鍖捀诇?zhǔn)確測(cè)定，

尤其是對(duì)稍有拖尾的峰。

N與柱長(zhǎng)成正比，柱越長(zhǎng)，N越大。用N表示柱效時(shí)應(yīng)注明柱長(zhǎng)，如果未注明，則

表示柱長(zhǎng)為1米時(shí)的理論塔板數(shù)。(一般HPLC柱的N在1000以上。)

若用調(diào)整保留時(shí)間(fJ計(jì)算理論塔板數(shù),所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或此及)。

理論塔板高度(theoreticalplateheight,H)每單位柱長(zhǎng)的方差。H=。實(shí)際應(yīng)用

時(shí)往往用柱長(zhǎng)L和理論塔板數(shù)計(jì)算：H=,H有效=。

4.相平衡參數(shù)

分配系數(shù)(distributioncoefficient,K)---在一定溫度下，化合物在兩相間達(dá)到分

配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的濃度之比。K=o

分配系數(shù)與組分、流動(dòng)相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不

同的色譜分離機(jī)制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選

擇性系數(shù)（或稱交換系數(shù)），凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。

在條件（流動(dòng)相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時(shí)（Cs、Cm很?。r(shí),

K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，

得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時(shí)色譜峰為拖尾

峰；而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時(shí)色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減

少進(jìn)樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時(shí)，才能獲得正常峰。

在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時(shí)間長(zhǎng)，后流出色譜柱;

K值小的組分則滯留時(shí)間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數(shù)相差越大，越

容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。

在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng)相

的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時(shí)間，達(dá)到分離的目

的。

容量因子（capacityfactor,k）---化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)

相中的量之比。k=o因此容量因子也稱質(zhì)量分配系數(shù)。

分配系數(shù)、容量因子與保留時(shí)間之間有如下關(guān)系：k===K=,t\=ktoo上式說

明容量因子的物理意義：表示一個(gè)組分在固定相中停留的時(shí)間（t\）是不保留組分保留

時(shí)間（to）的幾倍。k=0時(shí)，化合物全部存在于流動(dòng)相中，在固定相中不保留，t\=0；

k越大，說明固定相對(duì)此組分的容量越大，出柱慢，保留時(shí)間越長(zhǎng)。

容量因子與分配系數(shù)的不同點(diǎn)是：K取決于組分、流動(dòng)相、固定相的性質(zhì)及溫度，

而與體積Vs、Vm無關(guān)；k除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、Vm有關(guān)。由于t:、t0

較Vs、Vm易于測(cè)定，所以容量因子比分配系數(shù)應(yīng)用更廣泛。

選擇性因子（selectivityfactor,a）相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。a

==（設(shè)1<2>。）。因1<=/1!/3則a=，所以a又稱為相對(duì)保留時(shí)間（《美國(guó)藥典》）。

要使兩組分得到分離，必須使a#1。a與化合物在固定相和流動(dòng)相中的分配性質(zhì)、

柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。從本質(zhì)上來說，a的大小表示兩組分在兩

相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。

5.分離參數(shù)

分離度（resolution,R）——相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，

表示相鄰兩峰的分離程度。R=o當(dāng)W1=W2時(shí)，R=o當(dāng)R=1時(shí)，稱為4。分離，兩峰

基本分離，裸露峰面積為95.4%,內(nèi)側(cè)峰基重疊約2虬R=1.5時(shí)，稱為6。分離，裸露

峰面積為99.7虬RN1.5稱為完全分離。

《中國(guó)藥典》規(guī)定R應(yīng)大于1.5。

基本分離方程一一分離度與三個(gè)色譜基本參數(shù)有如下關(guān)系：

R=XX

其中稱為柱效項(xiàng)，為柱選擇性項(xiàng)，為柱容量項(xiàng)。柱效項(xiàng)與色譜過程動(dòng)力學(xué)特性有關(guān)，

后兩項(xiàng)與色譜過程熱力學(xué)因素有關(guān)。

從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：①增加塔板數(shù)。方法之一是增加

柱長(zhǎng)，但這樣會(huì)延長(zhǎng)保留時(shí)間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②

增加選擇性。當(dāng)a=l時(shí)，R=0,無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取

以下措施來改變選擇性:a.改變流動(dòng)相的組成及pH值;b.改變柱溫；c.改變固定相。

③改變?nèi)萘恳蜃印＿@常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來實(shí)

現(xiàn)。k2趨于0時(shí)，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時(shí)間

延長(zhǎng),而且峰形變寬，會(huì)影響分離度和檢測(cè)靈敏度。一般k2在P10范圍內(nèi)，最好為2~5,

窄徑柱可更小些。

二、塔板理論

1.塔板理論的基本假設(shè)

塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學(xué)平衡理論。它把色譜柱看作分

福塔，把組分在色譜柱內(nèi)的分離過程看成在分館塔中的分儲(chǔ)過程，即組分在塔板間隔內(nèi)

的分配平衡過程。塔板理論的基本假設(shè)為：

1）色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)完全服從分配定律，

并很快達(dá)到分配平衡。

2）樣品加在第0號(hào)塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散可以忽略。

3）流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)間歇式流動(dòng)，每次進(jìn)入一個(gè)塔板體積。

4）在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無關(guān)。

雖然以上假設(shè)與實(shí)際色譜過程不符，如色譜過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，很難達(dá)到分配平

衡；組分沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散是不可避免的。但是塔板理論導(dǎo)出了色譜流出曲線方程,

成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點(diǎn)的位置，能夠評(píng)價(jià)色譜柱柱效。

2.色譜流出曲線方程及定量參數(shù)（峰高h(yuǎn)和峰面積A）

根據(jù)塔板理論，流出曲線可用下述正態(tài)分布方程來描述：C=e或C=e

由色譜流出曲線方程可知：當(dāng)土二士口時(shí)，濃度C有極大值，Cmax=oCmax就是色譜

峰的峰高。因此上式說明：①當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)（即。一定），峰高h(yuǎn)與組分的量C。

（進(jìn)樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②當(dāng)進(jìn)樣量一定時(shí)，。越?。ㄖ?/p>

效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。

由流出曲線方程對(duì)V（0~8）求積分，即得出色譜峰面積A=X。XCmax=C。。可見A

相當(dāng)于組分進(jìn)樣量C。,因此是常用的定量參數(shù)。把Cmax=h和Wh/2=2.355。代入上式，

即得A=l.064XWh/2Xh,此為正常峰的峰面積計(jì)算公式。

三、速率理論（又稱隨機(jī)模型理論）

1.液相色譜速率方程

1956年荷蘭學(xué)者VanDeemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動(dòng)

力學(xué)因素結(jié)合起來，提出了色譜過程的動(dòng)力學(xué)理論一一速率理論。它把色譜過程看作一

個(gè)動(dòng)態(tài)非平衡過程，研究過程中的動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬（即柱效）的影響。

后來Giddings和Snyder等人在VanDeemter方程（H=A+B/u+Cu,后稱氣相色

譜速率方程）的基礎(chǔ)上，根據(jù)液體與氣體的性質(zhì)差異，提出了液相色譜速率方程（即

Giddings方程）：H=2入dp++\s\up5（2p+\s\up5（2p+\s\up5（2f

2.影響柱效的因素

1）渦流擴(kuò)散（eddydiffusion）。由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同，分子在色

譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴(kuò)散項(xiàng)A=2入dp,dp為填料直徑，入為填充

不規(guī)則因子，填充越不均勻入越大。HPLC常用填料粒度一般為3~10um,最好3~5Pm,

粒度分布RSDW5虬但粒度太小難于填充均勻（入大），且會(huì)使柱壓過高。大而均勻（球

形或近球形）的顆粒容易填充規(guī)則均勻，入越小。總的說來，應(yīng)采用細(xì)而均勻的載體,

這樣有助于提高柱效。毛細(xì)管無填料，A=0o

2）分子擴(kuò)散（moleculardiffusion）。又稱縱向擴(kuò)散。由于進(jìn)樣后溶質(zhì)分子在柱

內(nèi)存在濃度梯度，導(dǎo)致軸向擴(kuò)散而引起的峰展寬。分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U=2YDHI/U。u為流動(dòng)

相線速度，分子在柱內(nèi)的滯留時(shí)間越長(zhǎng)（U?。?，展寬越嚴(yán)重。在低流速時(shí)，它對(duì)峰形的

影響較大。Dm為分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，由于液相的Dm很小，通常僅為氣相的

10-ri0-5,因此在HPLC中，只要流速不太低的話，這一項(xiàng)可以忽略不計(jì)。Y是考慮到

填料的存在使溶質(zhì)分子不能自由地軸向擴(kuò)散，而引入的柱參數(shù)，用以對(duì)Dm進(jìn)行校正。

Y一般在0.6~0.7左右，毛細(xì)管柱的Y=10

3）傳質(zhì)阻抗（masstransferresistance）。由于溶質(zhì)分子在流動(dòng)相、靜態(tài)流動(dòng)相

和固定相中的傳質(zhì)過程而導(dǎo)致的峰展寬。溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相中的擴(kuò)散、分配、

轉(zhuǎn)移的過程并不是瞬間達(dá)到平衡，實(shí)際傳質(zhì)速度是有限的，這一時(shí)間上的滯后使色譜柱

總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬。液相色譜的傳質(zhì)阻抗項(xiàng)Cu又分為三項(xiàng)。

①流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Hm=Cmd2pu/Dm,Cm為常數(shù)。這是由于在一個(gè)流路中流路中心和

邊緣的流速不等所致?？拷畛漕w粒的流動(dòng)相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子

還未來得及與固定相達(dá)到分配平衡就隨流動(dòng)相前移，因而產(chǎn)生峰展寬。

②靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Hsm=Csmd2pu/Dm,Csm為常數(shù)。這是由于溶質(zhì)分子進(jìn)入處

于固定相孔穴內(nèi)的靜止流動(dòng)相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm對(duì)峰展寬的影響在

整個(gè)傳質(zhì)過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質(zhì)阻力就越小，

傳質(zhì)速率越高。所以改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu)，減小靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力，是提高液相色譜柱效

的關(guān)鍵。

Hm和Hsm都與固定相的粒徑平方d2P成正比，與擴(kuò)散系數(shù)Dm成反比。因此應(yīng)采用

低粒度固定相和低粘度流動(dòng)相。高柱溫可以增大Dm,但用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相時(shí)，易產(chǎn)生

氣泡，因此一般采用室溫。

③固定相傳質(zhì)阻抗Hs=Csd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs為常數(shù)，df為固定液的液

膜厚度，Ds為分子在固定液中的擴(kuò)散系數(shù)。在分配色譜中Hs與df的平方成正比，在吸

附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹脂

或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子層的化學(xué)鍵合固定相時(shí)Hs

可以忽略。

從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施：①進(jìn)樣

時(shí)間要短。②填料粒度要小。③改善傳質(zhì)過程。過高的吸附作用力可導(dǎo)致嚴(yán)重的峰展寬

和拖尾，甚至不可逆吸附。④適當(dāng)?shù)牧魉?。以H對(duì)u作圖，則有一最佳線速度uopt,在

此線速度時(shí)，H最小。一般在液相色譜中，uopt很?。ù蠹s0.03~0.lmm/s）,在這樣的

線速度下分析樣品需要很長(zhǎng)時(shí)間，一般來說都選在Imrn/s的條件下操作。⑤較小的檢測(cè)

器死體積。

3.柱外效應(yīng)

速率理論研究的是柱內(nèi)峰展寬因素，實(shí)際在柱外還存在引起峰展寬的因素，即柱外

效應(yīng)（色譜峰在柱外死空間里的擴(kuò)展效應(yīng)）。色譜峰展寬的總方差等于各方差之和，即：

。2=。2柱內(nèi)+。2柱外+。2其它柱外效應(yīng)主要由低劣的進(jìn)樣技術(shù)、從進(jìn)樣點(diǎn)到檢測(cè)

池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應(yīng)，首先應(yīng)盡可能減少柱

外死體積，如使用“零死體積接頭”連接各部件，管道對(duì)接宜呈流線形，檢測(cè)器的內(nèi)腔

體積應(yīng)盡可能小。研究表明柱外死體積之和應(yīng)<VR/。其次，希望將樣品直接進(jìn)在柱頭

的中心部位，但是由于進(jìn)樣閥與柱間有接頭，柱外效應(yīng)總是存在的。此外，要求進(jìn)樣體

積WVR/2。

柱外效應(yīng)的直觀標(biāo)志是容量因子k小的組分（如k<2）峰形拖尾和峰寬增加得更為

明顯；k大的組分影響不顯著。由于HPLC的特殊條件，當(dāng)柱子本身效率越高（N越大），

柱尺寸越小時(shí)，柱外效應(yīng)越顯得突出。而在經(jīng)典LC中則影響相對(duì)較小。

III.HPLC系統(tǒng)

HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。

其中輸液泵、色譜柱、檢測(cè)器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī)、

自動(dòng)進(jìn)樣器、預(yù)柱或保護(hù)柱、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自

動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動(dòng)儲(chǔ)分收集裝置。

最早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長(zhǎng)的檢測(cè)器、繪圖儀，繪出

的峰是通過手工測(cè)量計(jì)算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進(jìn)行梯度洗脫，柱填

料從單一品種發(fā)展至幾百種類型，檢測(cè)器從單波長(zhǎng)至可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、可得三維色譜圖

的二極管陣列檢測(cè)器、可確證物質(zhì)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜檢測(cè)器。數(shù)據(jù)處理不再用繪圖儀，逐漸取

而代之的是最簡(jiǎn)單的積分儀、計(jì)算機(jī)、工作站及網(wǎng)絡(luò)處理系統(tǒng)。

目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國(guó)外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島

津公司等，國(guó)內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。

一、輸液泵

1.泵的構(gòu)造和性能

輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)

量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)＜0.5%,這對(duì)

定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.l~10ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可

調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100ml/min；③輸出壓力高,一般應(yīng)能達(dá)到150~300kg/cm2；④液

缸容積??；⑤密封性能好，耐腐蝕。

泵的種類很多，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注

射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩(wěn)定；螺旋泵缸體太大,

這兩種泵已被淘汰。目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。

柱塞往復(fù)泵的液缸容積小，可至0.1ml,因此易于清洗和更換流動(dòng)相，特別適合于

再循環(huán)和梯度洗脫；改變電機(jī)轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達(dá)400

kg/cm20其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服。雙泵按連接方式

可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（RSD為0.M左右，串聯(lián)泵

為0.2~0.3%）,但出故障的機(jī)會(huì)較多（因多一單向閥），價(jià)格也較貴。

各品牌輸液泵的基本參數(shù):

項(xiàng)目Waters515型HPH00型LC-lOATvp型EliteP200II型檢定要求

流速范圍0.oorio0.oorio0.00「9.9990.01~4.99

調(diào)節(jié)精度0.0010.0010.0010.01

流量精密度RSDO.1%0.15%?0.3%)0.3%0.5%1.5%

流量準(zhǔn)確度±2.0%±5.0%±2.0%

最高壓力4000Psi40MPa39.2MPa40.OMPa

密封圈壽命

流動(dòng)相的脈沖

2.泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)

為了延長(zhǎng)泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，必須按照下列注意事項(xiàng)進(jìn)行操作：

①防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會(huì)磨損柱塞、密封

環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動(dòng)相中的任何固體微粒。流動(dòng)相最好在玻璃容器

內(nèi)蒸儲(chǔ)，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2µm或0.45µm）

等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。

②流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是

在停泵過夜或更長(zhǎng)時(shí)間的情況下。如果將含緩沖液的流動(dòng)相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏,

甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣

損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存

和有利于泵維護(hù)的溶劑（對(duì)于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。

③泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會(huì)磨損柱塞、缸

體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。

④輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生

漏液。

⑤流動(dòng)相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，

泵就無法正常工作。

如果輸液泵產(chǎn)生故障，須查明原因，采取相應(yīng)措施排除故障：

①?zèng)]有流動(dòng)相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體，這時(shí)可打開泄壓

閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運(yùn)轉(zhuǎn)，將氣泡排盡，也可用一個(gè)50ml針筒在泵出

口處幫助抽出氣體。另一個(gè)可能原因是密封環(huán)磨損，需更換。

②壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內(nèi)有異物，可卸下

單向閥，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有時(shí)可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡，或被鹽的微細(xì)晶?；蜃躺?/p>

的微生物部分堵塞，這時(shí)，可卸下砂濾棒浸入流動(dòng)相內(nèi)超聲除氣泡，或?qū)⑸盀V棒浸入稀

酸（如4moi/L硝酸）內(nèi)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立即清洗。

③壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路

有泄漏。檢查堵塞或泄漏時(shí)應(yīng)逐段進(jìn)行。

3.梯度洗脫

HPLC有等強(qiáng)度（isocratic）和梯度（gradient）洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分

析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫

是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，用

于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間，提高

分離度，改善峰形，提高檢測(cè)靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。

梯度洗脫有兩種實(shí)現(xiàn)方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內(nèi)梯度）。

兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形

梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗脫。

在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問

題，必須充分重視：

①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在

一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時(shí)更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混

合時(shí)，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。

②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須

進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會(huì)被強(qiáng)

溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。

③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲

醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時(shí)粘度增大很多，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或

水為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受

的最大壓力。

④每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓10~30

倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡。

二、進(jìn)樣器

早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器，裝在色譜柱入口處?，F(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)

進(jìn)樣器。進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色

譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自

動(dòng)進(jìn)樣。

1.隔膜進(jìn)樣。用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計(jì)的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi)，可

把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價(jià)格

便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如lOMPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生

記憶效應(yīng)，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到廣2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析

使用受到限制。

2.停流進(jìn)樣?？杀苊庠诟邏合逻M(jìn)樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟

動(dòng)時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)“鬼峰”；另一缺點(diǎn)是保留時(shí)間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號(hào)控制館分收集

的制備色譜中，效果較好。

3.閥進(jìn)樣。一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥（以美國(guó)Rheodyne公司的7725和7725i

型最常見），其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭

和連接管死體積的存在,柱效率低于隔膜進(jìn)樣（約下降5~10%左右），但耐高壓（35~40Mpa）,

進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好（0.5%）,操作方便。

六通閥的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣

量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%（最多75%）,并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。此法進(jìn)

樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進(jìn)樣引起的峰展寬。

②用完全裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5~10倍（最少3倍），這樣才能

完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動(dòng)相，消除管壁效應(yīng)，確保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。

六通閥使用和維護(hù)注意事項(xiàng)：①樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45也micro;m濾膜過濾，

以減少微粒對(duì)進(jìn)樣閥的磨損。②轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流

動(dòng)相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位時(shí)，過高的壓力將

使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥。

通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。

4.自動(dòng)進(jìn)樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。

三、色譜柱

色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的

心臟。對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種

微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球（包括離子

交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10Pm等，柱效理論值可達(dá)5~16萬/米。

對(duì)于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對(duì)于同系物分析，只要500即可；對(duì)于較難

分離物質(zhì)對(duì)則可采用高達(dá)2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長(zhǎng)就能滿足復(fù)雜混合

物分析的需要。

柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有

合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，

在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)

生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大

約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對(duì)柱效的

影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。

1.柱的構(gòu)造

色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多

用不銹鋼制成，壓力不高于70kg/cm2時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有

很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹

鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃

襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑

0.2~20µm（5~10µm）,取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。

色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：①常規(guī)分析柱（常量

柱），內(nèi)徑2~5nlm（常用4.6mm,國(guó)內(nèi)有4mm和5nlm）,柱長(zhǎng)10~30cm；②窄徑柱（narrow

bore,又稱細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn）,內(nèi)徑1~2mm,柱長(zhǎng)10~20cm；③毛細(xì)

管柱（又稱微柱microcolumn）,內(nèi)徑0.2~0.5mm；④半制備柱，內(nèi)徑＞5mm；⑤實(shí)驗(yàn)室

制備柱，內(nèi)徑20~40mm,柱長(zhǎng)10~30cm；⑥生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般

是根據(jù)柱長(zhǎng)、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。

2.柱的發(fā)展方向

因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長(zhǎng)3~10cm,填料粒徑2~3µm。為提高分析

靈敏度，與質(zhì)譜（MS）聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱

（microbore）o細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：①節(jié)省流動(dòng)相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能

使用長(zhǎng)柱達(dá)到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。

但由于柱體積越來越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測(cè)器（甚

至采用柱上檢測(cè)），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：

輸液泵能精密輸出l~100µ1/min的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積

的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測(cè)器，電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜儀在這方面具有

突出優(yōu)點(diǎn)。

3.柱的填充和性能評(píng)價(jià)

色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料

粒度＞20µm時(shí)，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20µm時(shí)，濕法填充較

為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；

②徑向加壓法，Waters專利；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法。柱填充

的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。

必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料

本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。

無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對(duì)其性能進(jìn)行考察，使用期間或

放置一段時(shí)間后也要重新檢查。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品、流動(dòng)相、流

速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對(duì)稱因子、容量因子和選擇性因子的重

復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以內(nèi)。進(jìn)行

柱效比較時(shí)，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。

一份合格的色譜柱評(píng)價(jià)報(bào)告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長(zhǎng)、內(nèi)徑、填料的種類、粒

度、色譜柱的柱效、不對(duì)稱度和柱壓降等。

4.柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)

色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損

壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。

①避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從

高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在

調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩（如前所述）。

②應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿?/p>

是水，反之亦然。

③一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去

留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。

④選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH）,以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣

器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前

預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。

⑤避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理

或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)

柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。

⑥經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系

統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍

左右，即常規(guī)分析需要50~75ml。

下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正己烷（或庚烷）、

二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲

醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙晴、一

氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動(dòng)相不含

緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲

醇（乙月青）沖洗時(shí)重復(fù)注射100~200µl四氫吠喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。

四氫吠喃與乙晴或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時(shí)也注射二甲亞颯數(shù)次。止匕外，用乙

月青、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。

陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換

性能強(qiáng)的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機(jī)物）、甲醇、

水依次沖洗。

⑦保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙晴或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。

絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長(zhǎng)時(shí)間。

⑧色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換

濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降

低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。

在后兩種情況發(fā)生時(shí)，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出廣2mm高度（注

意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤(rùn)的固定相（與柱內(nèi)相同）

填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱

的水平。

柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30加）,

可以起到保護(hù)、延長(zhǎng)柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效，這是值得的。

通常色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH2~9

范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時(shí)間后，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂，特別是

一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙?。新的色譜柱在使用一段時(shí)間后柱頂填料

可能塌陷，使柱效下降，這時(shí)也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù)。

每次工作完后，最好用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗，例如0DS柱宜用甲醇沖洗至基線

平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí)，使用完后應(yīng)用無鹽流動(dòng)相沖洗。含鹵族元素（氟、

氯、漠）的化合物可能會(huì)腐蝕不銹鋼管道，不宜長(zhǎng)期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如

不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔4~5天開機(jī)沖洗15分鐘。

四、檢測(cè)器

檢測(cè)器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦?/p>

號(hào)。HPLC的檢測(cè)器要求靈敏度高、噪音低（即對(duì)溫度、流量等外界變化不敏感）、線性

范圍寬、重復(fù)性好和適用范圍廣。

1.分類

1）按原理可分為光學(xué)檢測(cè)器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射）、熱學(xué)檢測(cè)器（如

吸附熱）、電化學(xué)檢測(cè)器（如極譜、庫侖、安培）、電學(xué)檢測(cè)器（電導(dǎo)、介電常數(shù)、壓電

石英頻率）、放射性檢測(cè)器（閃爍計(jì)數(shù)、電子捕獲、氫離子化）以及氫火焰離子化檢測(cè)

器。

2）按測(cè)量性質(zhì)可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）。通用型檢測(cè)器測(cè)量的是一般物質(zhì)

均具有的性質(zhì)，它對(duì)溶劑和溶質(zhì)組分均有反應(yīng)，如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。通用

型的靈敏度一般比專屬型的低。專屬型檢測(cè)器只能檢測(cè)某些組分的某一性質(zhì)，如紫外、

熒光檢測(cè)器，它們只對(duì)有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)。

3）按檢測(cè)方式分為濃度型和質(zhì)量型。濃度型檢測(cè)器的響應(yīng)與流動(dòng)相中組分的濃度有關(guān)，

質(zhì)量型檢測(cè)器的響應(yīng)與單位時(shí)間內(nèi)通過檢測(cè)器的組分的量有關(guān)。

4）檢測(cè)器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。

2.性能指標(biāo)

1）噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時(shí)，基線帶寬為噪音，基線在1小時(shí)

內(nèi)的變化為漂移。它們反映檢測(cè)器電子元件的穩(wěn)定性，及其受溫度和電源變化的影響，

如果有流動(dòng)相從色譜柱流入檢測(cè)器，那么它們還反映流速（泵的脈動(dòng)）和溶劑（純度、

含有氣泡、固定相流失）的影響。噪音和漂移都會(huì)影響測(cè)定的準(zhǔn)確度，應(yīng)盡量減小。

2）靈敏度（sensitivity）：表示一定量的樣品物質(zhì)通過檢測(cè)器時(shí)所給出的信號(hào)大小。對(duì)

濃度型檢測(cè)器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小，單位為對(duì)質(zhì)

量型檢測(cè)器，它表示在單位時(shí)間內(nèi)通過檢測(cè)器的單位質(zhì)量的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小,

單位為mV,s/go

3）檢測(cè)限（detectionlimit）

檢測(cè)器靈敏度的高低，并不等于它檢測(cè)最小樣品量或最低樣品濃度能力的高低，因

為在定義靈敏度時(shí)，沒有考慮噪聲的大小，而檢測(cè)限與噪聲的大小是直接有關(guān)的。

檢測(cè)限指恰好產(chǎn)生可辨別的信號(hào)（通常用2倍或3倍噪音表示）時(shí)進(jìn)入檢測(cè)器的某組分

的量（對(duì)濃度型檢測(cè)器指在流動(dòng)相中的濃度一一注意與分析方法檢測(cè)限的區(qū)別，單位

g/ml或mg/ml；對(duì)質(zhì)量型檢測(cè)器指的是單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測(cè)器的量，單位g/s或mg/s）。

又稱為敏感度（detectability）。D=2N/S,式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個(gè)

已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到檢測(cè)器中來測(cè)定其檢測(cè)限的大小。

檢測(cè)限是檢測(cè)器的一個(gè)主要性能指標(biāo)，其數(shù)值越小，檢測(cè)器性能越好。值得注意的

是，分析方法的檢測(cè)限除了與檢測(cè)器的噪聲和靈敏度有關(guān)外，還與色譜條件、色譜柱和

泵的穩(wěn)定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關(guān)。

4）線性范圍（linearrange）：指檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)與組分量成直線關(guān)系的范圍，即在

固定靈敏度下，最大與最小進(jìn)樣量（濃度型檢測(cè)器為組分在流動(dòng)相中的濃度）之比。也

可用響應(yīng)信號(hào)的最大與最小的范圍表示，例如Waters996PDA檢測(cè)器的線性范圍是

-0.l~2.0A。

定量分析的準(zhǔn)確與否，關(guān)鍵在于檢測(cè)器所產(chǎn)生的信號(hào)是否與被測(cè)樣品的量始終呈一

定的函數(shù)關(guān)系。輸出信號(hào)與樣品量最好呈線性關(guān)系，這樣進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)既準(zhǔn)確又方便。

但實(shí)際上沒有一臺(tái)檢測(cè)器能在任何范圍內(nèi)呈線性響應(yīng)。通常A=BCx,B為響應(yīng)因子，當(dāng)

x=l時(shí)，為線性響應(yīng)。對(duì)大多數(shù)檢測(cè)器來說，x只在一定范圍內(nèi)才接近于1,實(shí)際上通常

只要x=0.98~1.02就認(rèn)為它是呈線性的。

線性范圍一般可通過實(shí)驗(yàn)確定。我們希望檢測(cè)器的線性范圍盡可能大些，能同時(shí)測(cè)

定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫

檢測(cè)等。

幾種檢測(cè)器的主要性能:

熒光居；曲蒸發(fā)光散射

信號(hào)吸光度熒光強(qiáng)度電流離子流強(qiáng)度散射光強(qiáng)

10,5103

線性范圍

否否

溫度影響

1013

池體積Q2?10~71——

適且不官話宜、■￡

細(xì)管徑柱難

千無

5）池體積：除制備色譜外，大多數(shù)HPLC檢測(cè)器的池體積都小于10µl。在使

用細(xì)管徑柱時(shí)，池體積應(yīng)減少到廣2µl甚至更低，不然檢測(cè)系統(tǒng)帶來的峰擴(kuò)張問

題就會(huì)很嚴(yán)重。而且這時(shí)池體、檢測(cè)器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設(shè)計(jì)，否則會(huì)

嚴(yán)重影響柱效和靈敏度。

3.紫外檢測(cè)器（ultravioletdetector）

UV檢測(cè)器是HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)范圍包括可見光時(shí)，又稱為

紫外-可見檢測(cè)器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對(duì)流速和溫度均不敏感，可于

制備色譜。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系數(shù)低的物質(zhì)也可用UV檢測(cè)

器進(jìn)行微量分析。但要注意流動(dòng)相中各種溶劑的紫外吸收截止波長(zhǎng)。如果溶劑中含有吸

光雜質(zhì)，則會(huì)提高背景噪音，降低靈敏度（實(shí)際是提高檢測(cè)限）。止匕外，梯度洗脫時(shí)，

還會(huì)產(chǎn)生漂移。

注：將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長(zhǎng)，溶劑的吸光度A=1時(shí)的波

長(zhǎng)稱為溶劑的截止波長(zhǎng)。也稱極限波長(zhǎng)。

中國(guó)藥典對(duì)UV法溶劑的要求是：