細(xì)菌和病毒的遺傳轉(zhuǎn)化接合

細(xì)菌和病毒的遺傳轉(zhuǎn)化接合一、轉(zhuǎn)化(transformation)概念:某些細(xì)菌(或其她生物)能通過其細(xì)胞膜攝取周圍供體(donor)得染色體片段,并將此外源DNA片段通過重組整合到自己染色體組得過程。只有當(dāng)整合得DNA片段產(chǎn)生新得表現(xiàn)型時(shí),才能測知轉(zhuǎn)化得發(fā)生。轉(zhuǎn)化中接受供體遺傳物質(zhì)得稱為受體(receptor)。P213(一)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(二)、轉(zhuǎn)化過程(三)、轉(zhuǎn)化在遺傳分析中得應(yīng)用(一)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1、基礎(chǔ)知識(shí)莢膜菌落毒性類型光滑型S發(fā)達(dá)光滑有I,II,III粗糙型R無粗糙無I,II野生型肺炎雙球菌得菌落

一種突變型為粗糙型

兩者根本差異在于莢膜形成;莢膜得主要成分就是多糖,具特殊得抗原性;不同抗原型就是遺傳得、穩(wěn)定得,一般情況下不發(fā)生互變。2、Griffith轉(zhuǎn)化研究P213Griffith對(duì)其試驗(yàn)結(jié)論及發(fā)展根據(jù)上述研究結(jié)果Griffith認(rèn)為:(有毒)死細(xì)菌中得某種物質(zhì)轉(zhuǎn)移到(無毒)活細(xì)菌中,并使之具有毒性,導(dǎo)致小家鼠死亡。她將這種細(xì)菌遺傳類型得轉(zhuǎn)變稱為轉(zhuǎn)化,并將引起轉(zhuǎn)化得物質(zhì)稱為轉(zhuǎn)化因子(tranformingprinciple)。以后一些研究者重復(fù)上述試驗(yàn),并且加入了體外培養(yǎng)試驗(yàn),即:將加熱殺死得SIII細(xì)菌與無毒RII細(xì)菌混合培養(yǎng),然后注入小家鼠體內(nèi),同樣導(dǎo)致家鼠死亡。表明:細(xì)菌在培養(yǎng)條件下也能夠?qū)崿F(xiàn)遺傳類型間得定向轉(zhuǎn)化。3、阿維利(Avery)等得轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(1944)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:來源于加熱殺死得SIII細(xì)菌,并使RII細(xì)菌轉(zhuǎn)化成為SIII型細(xì)菌得轉(zhuǎn)化因子就是DNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)論轉(zhuǎn)化定義:某一基因型得細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收來自另一基因型得DNA而使她得基因型和表現(xiàn)型發(fā)生變化得現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)化。Avery等人得實(shí)驗(yàn)也表明:決定細(xì)菌遺傳類型得物質(zhì)就是DNA,即證明了DNA就就是遺傳物質(zhì)。(p36)由于她們采用得實(shí)驗(yàn)方法當(dāng)時(shí)不被人們廣泛接受,而且得出得結(jié)論與當(dāng)時(shí)人們得傳統(tǒng)觀念(認(rèn)為蛋白質(zhì)就是遺傳物質(zhì))不符合,而長期沒有得到人們得承認(rèn)。P213細(xì)菌轉(zhuǎn)化過程(一)轉(zhuǎn)化得過程非感受態(tài)細(xì)胞外源DNA被洗掉了轉(zhuǎn)化因子感受態(tài)細(xì)胞外源DNA仍與細(xì)胞結(jié)合整合吸收吸附洗滌兩種核酸酶：切為約14kb的片段使外源DNA片段變?yōu)閱捂?二)、轉(zhuǎn)化過程P214(二)、轉(zhuǎn)化過程1、感受態(tài)與感受態(tài)因子:感受態(tài)指細(xì)菌能夠從周圍環(huán)境中吸收DNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化得生理狀態(tài)。感受態(tài)主要受一類蛋白質(zhì)(感受態(tài)因子)影響,感受態(tài)因子可以在細(xì)菌間進(jìn)行轉(zhuǎn)移,從感受態(tài)細(xì)菌中傳遞到非感受態(tài)細(xì)菌中,可以使后者變?yōu)楦惺軕B(tài)。一般認(rèn)為感受態(tài)出現(xiàn)在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長后期,并且某些處理過程可以誘導(dǎo)或加強(qiáng)感受態(tài),以大腸桿菌為例,用Ca2+(CaCl2)處理對(duì)數(shù)生長后期得大腸桿菌可以增強(qiáng)其感受能力。P214轉(zhuǎn)化過程2、供體DNA與受體細(xì)胞結(jié)合(binding):結(jié)合發(fā)生在受體細(xì)胞特定部位;供體DNA片段為雙鏈;結(jié)合過程就是一個(gè)可逆過程。3、DNA得穿入和攝取:當(dāng)細(xì)菌結(jié)合點(diǎn)飽和之后,細(xì)菌開始攝取外源DNA;往往只有一條DNA單鏈進(jìn)入細(xì)胞,另一條鏈在膜上降解。4、聯(lián)會(huì)(synapsis)與外源DNA片段整合(integration):整合指單鏈得轉(zhuǎn)化DNA與受體DNA對(duì)應(yīng)位點(diǎn)得置換,穩(wěn)定摻入到受體DNA中得過程,實(shí)際就就是遺傳重組得過程。研究整合得分子機(jī)制也就就是研究遺傳重組得分子機(jī)制。P21412大家應(yīng)該也有點(diǎn)累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流轉(zhuǎn)化過程P213(三)、轉(zhuǎn)化在遺傳分析中得應(yīng)用共轉(zhuǎn)化供體一條DNA片段上得兩個(gè)基因同時(shí)轉(zhuǎn)化得現(xiàn)象稱為～。共轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜繪制利用共同轉(zhuǎn)化繪制細(xì)菌連鎖遺傳圖譜得基本原理:相鄰基因發(fā)生共同轉(zhuǎn)化得概率與兩者得距離成正向關(guān)系→基因間距離越近,發(fā)生共同轉(zhuǎn)化得頻率越高,反之越低。因此可能通過測定兩基因共同轉(zhuǎn)化得頻率來指示基因間得相對(duì)距離。轉(zhuǎn)化與遺傳圖譜應(yīng)用:①兩個(gè)基因同時(shí)轉(zhuǎn)化得效率(連鎖或不連鎖)②基因定位(遺傳作圖)(枯草桿菌)P215雜交實(shí)驗(yàn):trp2+his2+tyr1+×trp2-his2-tyr1-(黎德伯格等)結(jié)果(轉(zhuǎn)化子類型):基因座位trp2+---+++

his2++-+--+tyr1+++--+-

數(shù)目119403660685418260010711803660p215trp234his213tyr1表10-5二、接合(conjugation)(一)、接合現(xiàn)象得發(fā)現(xiàn)和證實(shí)(二)、F因子及其在雜交中得行為(三)、中斷雜交試驗(yàn)作圖概念:在原核生物中,接合就是指遺傳物質(zhì)從供體—“雄性”轉(zhuǎn)移到受體—“雌性”得過程。

P215重點(diǎn):接合得概念與基本原理、掌握F-、F+、Hfr菌株得概念、區(qū)別和用途;中斷雜交試驗(yàn)及重組作圖。18(一)、接合現(xiàn)象得發(fā)現(xiàn)和證實(shí)材料:大腸桿菌(Escherichiacoli)K12菌株得兩個(gè)營養(yǎng)缺陷型品系:A—甲硫氨酸缺陷型met-和生物素缺陷型bio-;B—蘇氨酸缺陷型thr-和亮氨酸缺陷型leu-。方法:將A、B兩菌株混和,在基本培養(yǎng)基(固體)上涂布培養(yǎng)。結(jié)果:平板上長出原養(yǎng)型菌落(++++)。P2151946年,黎德伯格和塔特姆得大腸桿菌雜交試驗(yàn):1946年黎德伯格和塔特姆接合試驗(yàn)原養(yǎng)型菌落頻率10-7幾種可能解釋及其分析對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果原養(yǎng)型菌落可能產(chǎn)生于:親本細(xì)菌A或B發(fā)生了回復(fù)突變;兩品系細(xì)胞通過培養(yǎng)基交換養(yǎng)料——互養(yǎng)作用;兩品系間交換DNA;發(fā)生細(xì)胞融合,形成了異核體或雜合二倍體。P216結(jié)論:這些解釋均不成立?；貜?fù)突變？Lederbery和Tatum利用得雙營養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)行試驗(yàn),已基本排除A或B品系發(fā)生回復(fù)突變產(chǎn)生原養(yǎng)型細(xì)菌得可能。單基因回復(fù)突變得頻率約為10-6;雙基因回復(fù)突變得頻率則為10-12,頻率很低。但試驗(yàn)中產(chǎn)生原養(yǎng)型菌落產(chǎn)生得頻率非常高,因此基本可以排除回復(fù)突變得可能?；ヰB(yǎng)作用？試驗(yàn)材料:A品系:A-B+T1S(met-bio-thr+leu+T1S);B品系:A+B-T1R(met+bio+thr-leu-T1R)。試驗(yàn)方法:將A、B品系混合接種在基本培養(yǎng)基表面;短時(shí)間后噴T1殺死A品系,使其不能持續(xù)產(chǎn)生thr與leu供B品系持續(xù)生長。結(jié)果與結(jié)論:仍然出現(xiàn)原養(yǎng)型菌落。從而表明互養(yǎng)并非原養(yǎng)型菌落出現(xiàn)得原因,而可能發(fā)生了遺傳重組。交換DNA？Lederberg和Tatum曾把品系A(chǔ)得培養(yǎng)液經(jīng)加熱滅菌,加入到B品系得培養(yǎng)物中,未得到原養(yǎng)型菌落;表明原養(yǎng)型菌落可能不就是由轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)生。戴維斯(Dawis1950)U型管試驗(yàn);實(shí)驗(yàn)結(jié)論:細(xì)胞直接接觸就是原養(yǎng)型細(xì)菌產(chǎn)生得必要條件。結(jié)果沒有得到原養(yǎng)型細(xì)菌;異核體和雜合二倍體？

若細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生融合,產(chǎn)生異核體或雙雜合二倍體。這兩種情況類似于二倍體生物得雜合體,將產(chǎn)生原養(yǎng)型菌落。異核體:指由于細(xì)胞融合而在細(xì)胞內(nèi)含有遺傳組成不同得兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞核。雙雜合二倍體:就是指異核體進(jìn)一步發(fā)生核融合,形成二倍體細(xì)胞核,核內(nèi)含有兩種遺傳物質(zhì)。

細(xì)菌為單倍配子體生物,異核體和二倍體只能暫存。培養(yǎng)繁殖過程中必將發(fā)生分離,產(chǎn)生各種缺陷型菌落,對(duì)試驗(yàn)中得到得原養(yǎng)型菌落后代研究表明,后代沒有出現(xiàn)預(yù)期得性狀分離現(xiàn)象。接合現(xiàn)象得發(fā)現(xiàn)和證實(shí)經(jīng)過上述分析可認(rèn)為:在Lederberg和Tatum得試驗(yàn)中,發(fā)生了一種不同于轉(zhuǎn)化得遺傳重組方式,稱之為接合。Hayes(1952)研究表明:大腸桿菌兩種不同菌株(品系)接合過程中遺傳物質(zhì)得轉(zhuǎn)移就是單向得;P217大腸桿菌存在兩種類型品系:雌性與雄性分別作為接合過程中遺傳物質(zhì)得供體與受體。接合(conjugation):遺傳物質(zhì)從供體轉(zhuǎn)移到受體得重組過程。1、F因子:Hayes等深入研究發(fā)現(xiàn),大腸桿菌在接合中作供體得能力受細(xì)胞內(nèi)一種致育因子(F因子-fertilityfactor;性因子-sexfactor)控制。(二)、F因子及其在雜交中得行為P217F因子得化學(xué)本質(zhì)就是DNA,可以自主狀態(tài)存在于胞質(zhì)中或整合到細(xì)菌得染色體上,又稱F質(zhì)粒。(二)、F因子及其在雜交中得行為P217F因子可以在細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)移并傳遞遺傳物質(zhì)。圖10-14F因子結(jié)構(gòu):①原點(diǎn)(origin)②致育基因(fertilitygene)③配對(duì)區(qū)(pairingregion)Hfr菌株重組頻率比F+高500多倍圖10-15大腸桿菌F因子得三種狀態(tài)供體菌(雄性)受體菌(雌性)高頻重組菌株具有F因子得菌株可作為供體,F因子中有控制F性傘毛(Fpillus)形成得基因。F性傘毛就是由供體細(xì)胞表面伸出得一種長附屬物,與受體細(xì)胞接合,就成為兩個(gè)細(xì)胞之間原生質(zhì)得通道,叫接合管(conjugationtube)。接合現(xiàn)象P217圖10-16F因子及其在雜交中得行為F因子在宿主染色體上有許多特定得插入位點(diǎn)和方向,整合頻率為每代10-5～10-7。性傘毛形成結(jié)合橋/管,產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶,該酶在oriT轉(zhuǎn)移起始點(diǎn)處一條單鏈上切開一個(gè)口,供體DNA從5′末端開始向受體轉(zhuǎn)移。P218-220接合過程:F＋和F－得雜交細(xì)菌間接觸→接合管形成→單鏈斷裂—單鏈DNA從供體向受體轉(zhuǎn)移→環(huán)化(F+→F-)或DNA雙鏈得形成(部分二倍體)(Hfr→F-)→重組交換(奇偶次交換)。接合過程:F＋和F－得雜交

F因子得特點(diǎn)F＋細(xì)菌可以把F因子傳給后代。F＋細(xì)菌經(jīng)吖啶橙處理F因子丟失,丟失后不再出現(xiàn)。F＋可以和F－雜交,而不能和F＋雜交。F＋和F－雜交后代皆為F＋,而且可以以10－7頻率獲得重組體后代。Hfr和F－雜交僅有一部分F因子(近原點(diǎn)處)被轉(zhuǎn)移;受體獲得完整得F因子--這種情況頻率非常低。高頻重組:細(xì)菌重組子頻率為10－4。P219接合過程:Hfr和F－雜交細(xì)菌重組特點(diǎn):只有偶數(shù)次交換才能產(chǎn)生平衡得重組子。相反得重組子不出現(xiàn),所以在選擇性培養(yǎng)基上只出現(xiàn)一種重組子。部分二倍體/部分合子圖10-18細(xì)菌部分二倍體得形成及單交換和雙交換得結(jié)果知識(shí)要點(diǎn):p219奇偶次交換(三)、中斷雜交試驗(yàn)作圖雅各布(Jacob,F)和沃爾曼(Wollman,E、)著名得中斷雜交試驗(yàn)(interruptedmatingexperiment)。試驗(yàn)材料:Hfr:thr+leu+aziStonSlac+gal+strsF–:thr–leu–aziRtonRlac–gal-strRP231thr、leu、lac、gal分別代表蘇氨酸、亮氨酸、乳糖和半乳糖,+代表原養(yǎng)型或發(fā)酵型,–代表營養(yǎng)缺陷型或不發(fā)酵型;azi和tonA分別代表疊氮化納和T1噬菌體;Str表示鏈霉素,r代表抗性,s代表敏感。

理解細(xì)菌和病毒在遺傳研究中得優(yōu)越性和意義;掌握轉(zhuǎn)化、接合、性導(dǎo)與轉(zhuǎn)導(dǎo)得概念與基本原理;掌握F-菌株、F+菌株、Hfr菌株得概念、區(qū)別和用途;區(qū)別F因子、F′因子得異同;了解溫和性噬菌體、烈性噬菌體得生活周期;掌握原噬菌體、溶源性細(xì)菌得概念;了解細(xì)菌和病毒遺傳作圖得原理和基本過程。本章要求W、Hayes關(guān)于E、coliK