當前關(guān)于病原體宏基因組高通量測序產(chǎn)品的幾點考慮

當前關(guān)于病原體宏基因組高通量測序產(chǎn)品的幾點考慮（原創(chuàng)2022-09-29CMDE中國器審）感染性疾病是由病原微生物（細菌、病毒、真菌、寄生蟲等）引起的疾病的統(tǒng)稱。據(jù)統(tǒng)計感染性疾病死因占全部死因的25%以上，是當今世界嚴重威脅人類健康的重大疾病。長期以來感染性疾病的診斷和療效監(jiān)測一直依靠形態(tài)學、免疫學、分子生物學以及病原體分離培養(yǎng)等方法，這些方法各有優(yōu)缺點，在感染性疾病的輔助診斷中發(fā)揮著重要作用。近年來新興的病原體宏基因組高通量測序（metagenomicnext-generationsequencing，mNGS）技術(shù)，是指采用高通量測序技術(shù)對特定臨床樣本中所有核酸進行測序，并通過生物信息學分析判斷樣本中是否存在病原體的檢測方法。與傳統(tǒng)基于分離培養(yǎng)的病原體檢測技術(shù)相比，該技術(shù)從理論上講能夠無偏倚的檢測各類微生物（如：病毒、細菌、真菌、寄生蟲等），包括難以培養(yǎng)的病原體以及新發(fā)病原體。mNGS技術(shù)是一個開放的分析和診斷系統(tǒng)，對于mNGS技術(shù)所檢測的病原體數(shù)量未有明確規(guī)定，根據(jù)不完全統(tǒng)計，開展相關(guān)檢測服務的機構(gòu)已納入的病原體有近萬種，包括細菌、病毒、真菌和寄生蟲等，為疑難危重癥及罕見病原體感染的診斷提供了有效的技術(shù)手段。在特定的臨床應用場景下，具有臨床意義。針對mNGS的臨床應用，目前已有多個臨床專家共識。結(jié)合該技術(shù)的特點，我中心對相關(guān)產(chǎn)品的臨床應用、設計開發(fā)、驗證確認等方面進行了專題研究，現(xiàn)將當前的幾點考慮總結(jié)如下。一、關(guān)于產(chǎn)品預期臨床使用場景基于mNGS技術(shù)的產(chǎn)品與常規(guī)的病原體檢測產(chǎn)品相比，具有檢測過程較為復雜、易受到人源基因的干擾、檢測時間較長、結(jié)果解讀專業(yè)要求高、檢測成本高等特點，一般用于傳統(tǒng)檢驗方法未能給出明確病原學結(jié)果從而影響患者準確診療的感染性疾病、新發(fā)突發(fā)傳染病、危急重癥或排除其他發(fā)熱疾病。推薦臨床通過擬診先行傳統(tǒng)微生物檢驗及常規(guī)分子生物學產(chǎn)品檢測常見病原體，不盲目使用mNGS技術(shù)。在必要或緊急情況下，如危急重癥、群體性感染事件等，可考慮與常規(guī)方法同步進行檢測。對常規(guī)微生物學檢查容易明確的病原體不建議進行mNGS檢測。從臨床角度，mNGS結(jié)果不能單獨作為病原學確診或排除的證據(jù)。適用場景舉例如下：（一）患者表現(xiàn)為發(fā)熱或發(fā)熱癥候群，病因未明確（符合不明原因發(fā)熱定義），考慮感染或不除外感染，但規(guī)范性經(jīng)驗抗感染治療無效，在應用常規(guī)技術(shù)檢測的基礎(chǔ)上，開展mNGS產(chǎn)品檢測。（二）各種原因?qū)е禄颊呒蔽Ｖ匕Y表現(xiàn)，不除外感染所致，或考慮繼發(fā)或并發(fā)危及生命的嚴重感染，在常規(guī)檢測的基礎(chǔ)上，開展mNGS產(chǎn)品檢測。（三）免疫受損患者疑似繼發(fā)感染，常規(guī)病原學檢查未能明確致病原或/和規(guī)范性經(jīng)驗抗感染治療無效，建議進一步完善常規(guī)病原學檢測的同時，或在其基礎(chǔ)上，開展mNGS產(chǎn)品檢測。（四）疑似局部感染，病原學診斷未明確、不及時處理則后果嚴重時，在常規(guī)檢測的基礎(chǔ)上，開展mNGS產(chǎn)品檢測。（五）高度疑似感染性疾病，但病原學診斷未明確且常規(guī)抗感染治療無效，建議進一步完善常規(guī)病原學檢測、處理原發(fā)感染灶，調(diào)整經(jīng)驗抗微生物治療方案的同時開展mNGS檢測。（六）慢性感染，或慢性疾病不除外感染，尤其是二者臨床表現(xiàn)相似、難以鑒別時，病情嚴重或抗感染治療療效不佳需要明確病因，建議在完善常規(guī)檢測、調(diào)整經(jīng)驗治療的同時開展mNGS產(chǎn)品檢測。（七）其他患者疑似特殊病原體感染或從相關(guān)流行病學角度考慮需要進行mNGS產(chǎn)品檢測。二、關(guān)于產(chǎn)品的檢測樣本及適應證mNGS產(chǎn)品在目前的臨床應用研究中涉及多種適應證，如：中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、血流感染、局灶性感染、呼吸道感染、感染性腹瀉等,對于具有相關(guān)臨床癥狀的病例，應在按照現(xiàn)有診療流程進行標準化診療的基礎(chǔ)上開展檢測。針對患者感染部位不同，采集的樣本類型也不同，產(chǎn)品適用的樣本類型主要包括：靜脈血、腦脊液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔積液、腹水、組織、局灶穿刺物、糞便等多種類型。對于樣本的采集，應注意以下兩個方面，一是，對于無菌體液，如靜脈血、腦脊液、胸腔積液、腹水等，需按照嚴格的無菌操作采集樣本，采集的樣本須置于無菌容器內(nèi)；二是，對于有菌部位的樣本，如痰液、肺泡灌洗液、咽拭子等，應標明樣本的采集部位，在樣本采集過程中應盡量避免引入該部位的正常菌群，以免干擾后續(xù)檢測結(jié)果。采集的樣本應盡量選取感染部位的體液或組織，可提高檢測結(jié)果的可信度。若感染部位的樣本采集難度較大，可選擇外周血液樣本，但有可能會降低檢測結(jié)果的準確性。產(chǎn)品適用的樣本類型推薦優(yōu)先選擇無菌采集的樣本。關(guān)于不同適應證適用的樣本類型舉例見表1。表1.產(chǎn)品適應證與適用的樣本類型舉例三、關(guān)于產(chǎn)品檢測病原體種類范圍mNGS產(chǎn)品檢測原理為對臨床樣本中存在的病原體核酸進行無偏倚的檢測，從產(chǎn)品檢測的技術(shù)角度考慮，除新發(fā)病原體外，產(chǎn)品的檢測范圍不應局限為某一種或某幾種常見病原微生物，應為產(chǎn)品適應證、適用樣本中所有可報告的病原微生物。產(chǎn)品所檢測的病原微生物受幾個方面的影響，一是產(chǎn)品配套使用的參考數(shù)據(jù)庫及生信分析過程涵蓋的病原體種類，如數(shù)據(jù)庫中未涵蓋某種病原體基因組參考序列，則該類病原體不在該產(chǎn)品的檢測范圍之內(nèi)；二是檢測樣本類型、核酸提取等會直接影響產(chǎn)品病原體的檢測種類，不同的樣本類型可能檢出的病原體會存在差別，如腦脊液樣本檢出的病原體主要以中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原體為主，而糞便樣本檢出病原體主要為消化系統(tǒng)感染的病原體。不同的核酸提取方式對病原體的檢出種類也會產(chǎn)生影響，如核酸提取過程未考慮破壁，則產(chǎn)品可能不適用于具有厚細胞壁的病原體檢測；三是產(chǎn)品檢測的目標物是否包括不同類型的核酸靶標，如產(chǎn)品檢測的靶標僅為DNA，則RNA病毒不在該產(chǎn)品的檢測范圍之內(nèi)。相關(guān)產(chǎn)品的申請人應依據(jù)產(chǎn)品設計、適用的樣本類型、適應證等多個方面綜合考慮產(chǎn)品預期用途，確定合理的病原體檢測范圍。四、關(guān)于產(chǎn)品配套使用的數(shù)據(jù)庫mNGS產(chǎn)品檢測結(jié)果，除了產(chǎn)生可用于比對的微生物短片段序列外，還存在大量人源、環(huán)境微生物、試劑含有的微生物等背景核酸序列，必須依靠生物信息學手段對其進行篩選、過濾、比對，最終給出微生物物種注釋。結(jié)果分析過程中，數(shù)據(jù)庫的使用是必需的，而且是影響mNGS產(chǎn)品檢測結(jié)果準確性的重要因素。目前相關(guān)產(chǎn)品在選擇配套使用的數(shù)據(jù)庫時，一般會存在兩種情況，一種為直接選擇公共數(shù)據(jù)庫，如：NCBInr/ntdatabase、NCBIRefSeqdatabase等；另一種為自建數(shù)據(jù)庫，對公開數(shù)據(jù)庫中基因組序列進行挑選、整理、分類，然后通過程序軟件將收集到的基因組序列整理成適用于本產(chǎn)品的微生物及人源序列比對數(shù)據(jù)庫。針對成熟的產(chǎn)品，建議根據(jù)產(chǎn)品特點及臨床需要，使用臨床應用級的自建數(shù)據(jù)庫。在數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建、使用和管理方面應注意以下問題：（一）需要考慮數(shù)據(jù)庫的全面性以及納入物種在分類學上的代表性，對于同一種微生物，往往存在具有遺傳差異的不同亞型或株，所以在選擇基因組時，應考慮到微生物的遺傳多樣性，盡可能選取具有高度代表性的不同亞型或株的高質(zhì)量基因組。（二）無論所選擇的參考基因組的來源如何，申請人需要考慮其注釋的準確性及序列的完整性，防止注釋錯誤、命名錯誤或者代表性不足臨床相關(guān)微生物列入庫。（三）申請人應在有必要的基礎(chǔ)上，對納入庫中的微生物的潛在的臨床意義進行注釋，讓結(jié)果解讀人員對檢測的微生物有基本的認識和判斷。（四）由于病原體在自然狀態(tài)下是不斷發(fā)生進化變異的，致病性也是動態(tài)變化的，所以需要及時（或定期）對參考數(shù)據(jù)庫中的基因組信息及臨床致病證據(jù)進行更新。（五）當數(shù)據(jù)庫發(fā)生可能影響病原體判讀結(jié)果的更新后，應對更新后的數(shù)據(jù)庫進行驗證與確認。（六）應構(gòu)建全面的人源基因序列數(shù)據(jù)庫，并評估最新版國際人類參考基因組和用于構(gòu)建人源基因序列數(shù)據(jù)庫所選擇的參考基因組差異，進而評價人源基因序列數(shù)據(jù)庫的代表性，人源基因序列數(shù)據(jù)庫用于在生信分析過程中過濾人源基因數(shù)據(jù)。（七）mNGS檢測產(chǎn)品檢測過程中一些樣本中會存在背景菌序列、環(huán)境微生物及實驗室殘留微生物，這些基因序列可造成測序污染，導致假陽性結(jié)果產(chǎn)生；另外，一些樣本（例如呼吸道樣本）會存在定植微生物，因此，針對產(chǎn)品需要構(gòu)建檢測背景庫用于過濾污染序列、區(qū)分背景病原體和致病性病原體。五、關(guān)于測序數(shù)據(jù)要求人體不同的樣本類型單位體積含有的細胞數(shù)量有巨大的差異，最終的測序數(shù)據(jù)由微生物序列和人源基因組序列組成，不同的人源細胞含量、病原微生物感染的類型和病原體含量的高低都會影響測序數(shù)據(jù)中目標微生物序列占比，如組織樣本的人源細胞含量比較高，測序所得的序列數(shù)據(jù)中相應微生物的占比可能較少，因此，mNGS產(chǎn)品在不同的樣本類型中，產(chǎn)品分析靈敏度會存在差異。該類產(chǎn)品可通過增加測序數(shù)據(jù)量來提高待檢出的微生物數(shù)據(jù)量，或通過富集微生物含量以提升微生物序列的占比，從而提高微生物的檢出率。一般而言，在一定范圍內(nèi)隨著測序數(shù)據(jù)量的增加，產(chǎn)品的靈敏度會有所提升。因此，為了保證產(chǎn)品具有滿足臨床要求的靈敏度，針對某一樣本類型，應保證一定的測序數(shù)據(jù)量。產(chǎn)品在設計上，一般分為去除宿主人源基因與未去除宿主人源基因兩種設計，去除宿主人源基因后，產(chǎn)品產(chǎn)生的相應數(shù)據(jù)量會大大減少。在缺乏有效的人源宿主去除步驟的情況下，單個樣本檢測所需的數(shù)據(jù)量應充分評估并設立合理的指標要求。測序模式一般為單端測序和雙端測序，雙端測序所花費的經(jīng)濟成本及時間均高于單端測序，如產(chǎn)品設計選擇單端測序，為確保序列比對的準確性，避免因同源錯配導致的序列比對錯誤，可參考相關(guān)專家共識的要求，如測序序列單端讀長當前建議不少于50bp。為了保證數(shù)據(jù)分析的可靠性，產(chǎn)品檢測的下機數(shù)據(jù)應有一定的質(zhì)量要求。下機數(shù)據(jù)經(jīng)拆分后即得到每個樣本的測序數(shù)據(jù)，需要進行數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾，包括過濾測序接頭、低質(zhì)量序列、低復雜度序列、重復序列等，將獲得的高質(zhì)量讀長序列作為微生物鑒定的輸入數(shù)據(jù)。一般而言，數(shù)據(jù)應達到以下指標：Q30堿基數(shù)量占比>80%、接頭污染比例不超過1%、有效序列長度不小于50bp、數(shù)據(jù)的有效比對率應大于70%等。六、關(guān)于產(chǎn)品陽性判斷值的研究產(chǎn)品陽性判斷值的研究，主要是為了區(qū)分真陽性、真陰性，以及判斷實驗過程中污染的微生物等?；趍NGS技術(shù)的產(chǎn)品，陽性判斷值應包含度量標準，例如檢測結(jié)果中能夠比對到數(shù)據(jù)庫中的微生物的序列數(shù)、對某種微生物的基因組覆蓋度等，可通過ROC曲線分析的方法對產(chǎn)品的陽性判斷值進行研究。在陽性判斷值研究過程中應注意，胞內(nèi)菌和厚壁微生物檢出率低，因此即使在檢測報告中某種/某些胞內(nèi)菌/厚壁菌檢出序列數(shù)不高，也要考慮其為致病病原體的可能。七、關(guān)于產(chǎn)品檢測結(jié)果的報告用于臨床輔助診斷的mNGS報告應包括測序總序列數(shù)、檢測病原微生物列表、檢出病原特異序列數(shù)量、檢測病原范圍、覆蓋度、測序深度、檢測方法及檢測技術(shù)說明。需要注意的是，檢測結(jié)果僅代表臨床樣本中檢出或未檢出某微生物的核酸片段，不能明確該物種與感染的關(guān)系，即使陰性結(jié)果也需結(jié)合臨床表現(xiàn)及其他檢查結(jié)果進行綜合判斷。對于胞內(nèi)菌和厚壁微生物的檢測，因技術(shù)原因存在一定的偏倚，如對于胞內(nèi)感染菌因釋放到體液中含量較少而導致檢測敏感性偏低，對具有較厚細胞壁的病原微生物如真菌感染，可能由于核酸提取效率較低，相對檢出率低，導致臨床檢出率和敏感性較低。因此即使在檢測結(jié)果中某種胞內(nèi)菌/厚壁菌檢出序列數(shù)不高，也要考慮其為致病病原體的可能。mNGS信息量大，臨床應用過程中，檢驗機構(gòu)依據(jù)檢測結(jié)果出具檢驗報告時，有些情況下不可能在結(jié)果中列舉出所有檢測到的病原體，對于罕見病原體、胞內(nèi)菌等，可能因檢出序列數(shù)少、微生物豐度低，在報告中未能列舉，如果臨床有疑似特殊病原體的感染，應該可以追溯原始數(shù)據(jù)庫進行查詢。八、關(guān)于產(chǎn)品驗證與確認的考慮基于mNGS技術(shù)的產(chǎn)品，因其預期用途涵蓋的病原體的種類非常廣，產(chǎn)品驗證與臨床試驗應對檢測范圍內(nèi)的病原體進行有充分覆蓋度、有充分代表性的性能評價。產(chǎn)品臨床試驗在入組人群上，應與產(chǎn)品臨床適用人群一致。在對比方法選擇上，應選擇臨床參考方法作為對比方法，臨床參考方法應綜合病原體分離培養(yǎng)、患者的影像學檢查結(jié)果、基于宿主反應的檢測結(jié)果等。同時，由mNGS獲得致病病原體后，臨床上會針對病原體進行精準治療，治療后患者的臨床表現(xiàn)和治療效果的隨訪結(jié)果也可以作為臨床試驗對比方法的證據(jù)。臨床試驗過程中，應關(guān)注試驗體外診斷試劑對一些對于胞內(nèi)感染菌、具有較厚細胞壁的病原微生物等的臨床性能研究。

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