PCR法獲取目的基因

第五章PCR法獲取目的基因

ChapterVObtainingTargetGenesbyPCRTechnology

授課教師：王斌

職稱：副教授2024/10/21PCR法獲取目的基因1授課內(nèi)容PCR技術(shù)的創(chuàng)建PCR技術(shù)的原理PCR的反應(yīng)體系和程序PCR的類型和應(yīng)用PCR法克隆目的基因PCR引物設(shè)計(jì)：PrimerpremierPCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果處理：Quantityone2024/10/21PCR法獲取目的基因2授課目標(biāo)了解PCR技術(shù)史理解PCR技術(shù)原理重點(diǎn)：在實(shí)際研究工作中利用PCR技術(shù)熟練設(shè)計(jì)引物、PCR體系和程序，準(zhǔn)確擴(kuò)增目的基因片段，為目的基因的克隆、表達(dá)服務(wù)。DNA——生命的藍(lán)圖2024/10/21PCR法獲取目的基因3Thetwostrandsoftheparentaldoublehelixunwind,andeachspecifiesanewdaughterstrandbybase-pairingrules.Semi-conservativereplication2024/10/21PCR法獲取目的基因4PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PolymeraseChainReaction一、PCR技術(shù)的創(chuàng)建——KaryB.MullisKhorana等1971年提出在體外經(jīng)DNA變性、與適當(dāng)引物雜交、再用DNA聚合酶延伸等循環(huán)過程，克隆DNA的設(shè)想。2024/10/21PCR法獲取目的基因5DNA聚合酶引物引物Sanger：1977年，DNA測(cè)序M13噬菌體引物DNA聚合酶2024/10/21PCR法獲取目的基因61983年，Mullis發(fā)明了PCR技術(shù)，使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。1983年Mullis的構(gòu)思2024/10/21PCR法獲取目的基因71983年春夏之交的一個(gè)晚上，Mullis開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個(gè)引物去擴(kuò)增模板DNA的想法。他開車時(shí),感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對(duì)面開來(lái)的車象是DNA聚合酶，面對(duì)面地合成DNA。問題：DNA聚合酶不能耐受高溫，每個(gè)循環(huán)需額外添加DNA聚合酶。2024/10/21PCR法獲取目的基因8KaryB.Mullis（1944－）兩篇重要論文SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)被引用次數(shù)：5869

TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)1993年因發(fā)明聚合酶鏈鎖反應(yīng)，與邁克爾·史密斯分享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。Taq

DNA聚合酶（來(lái)自于Thermusaquaticus，水生棲熱菌)Saiki：1988年，發(fā)現(xiàn)耐熱的DNA聚合酶（Taq）2024/10/21PCR法獲取目的基因9Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91)?被引用次數(shù)：171611988年，第一臺(tái)PCR儀問世。1989年美國(guó)《Science》雜志比喻1989年為PCR爆炸年，Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1991年，Hoffman-LaRoche以3億美元的代價(jià)從Cetus公司獲得全權(quán)開發(fā)權(quán)。二、PCR技術(shù)的原理1.PCR技術(shù)的原理2024/10/21PCR法獲取目的基因10在微量離心管中,加入適量的緩沖液、微量的模板DNA、四種脫氧核苷酸、耐熱性DNA聚合酶、一對(duì)合成DNA的引物;通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段的循環(huán)合成DNA;每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍。一般樣品經(jīng)過30次循環(huán),可使基因的拷貝數(shù)達(dá)到數(shù)百萬(wàn)。類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于寡核苷酸引物。PCR過程：由變性--退火--延伸三個(gè)基本步驟構(gòu)成變性：94℃左右，使雙鏈DNA模板解離成為單鏈；復(fù)性：55℃左右，引物與模板DNA互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合；延伸：72℃左右，“模板-引物結(jié)合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，以靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成新的DNA鏈。重復(fù)“變性--退火--延伸”的循環(huán)，可獲得大量的新DNA分子。而且，新的DNA分子又可作為下次循環(huán)的模板，從而指數(shù)級(jí)地獲得大量DNA產(chǎn)物，數(shù)小時(shí)內(nèi)可使目的基因的數(shù)量擴(kuò)增百萬(wàn)倍。2024/10/21PCR法獲取目的基因11加熱變性復(fù)性復(fù)溫2.PCR技術(shù)依賴于DNA的變性和復(fù)性DNA的變性：加熱、強(qiáng)酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離，形成單鏈DNA。DNA的復(fù)性（退火）：解除變性的條件后，變性的單鏈DNA可以重新結(jié)合起來(lái)，形成雙鏈，其原有的特性和活性可以恢復(fù)。2024/10/21PCR法獲取目的基因123.PCR技術(shù)的特點(diǎn)1）速度快，靈敏度高：經(jīng)過30輪循環(huán)，理論上目的產(chǎn)物的擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝（109拷貝）。2）特異性：引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵；引物設(shè)計(jì)的原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性，盡可能減少非特異性擴(kuò)增。3）操作簡(jiǎn)便易行：只需要數(shù)小時(shí)就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個(gè)拷貝的基因序列。4）用途廣泛：生命學(xué)科、醫(yī)學(xué)工程、遺傳工程、疾病診斷、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)。2024/10/21PCR法獲取目的基因13三、PCR技術(shù)的反應(yīng)體系和條件H2O

35

μL10×PCR反應(yīng)緩沖液

5

μL25mmol/LMgCl2

4

μL4種dNTP

4

μL上游引物（引物１）

0.5

μL下游引物（引物２）

0.5

μL模板DNA

(約1ng)

0.5

μLTaq酶0.5

μL

1.反應(yīng)體系（總體積：50L）2024/10/21PCR法獲取目的基因14PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNAdNTP引物BufferH2OMg2+預(yù)變性TaqDNA聚合酶94℃,5min2.基本程序2024/10/21PCR法獲取目的基因15模板DNAdNTP引物BufferH2OMg2+PCR技術(shù)的基本過程(2)PCR儀94℃55℃72℃72℃5～7min循環(huán)25～35次2024/10/21PCR法獲取目的基因16Taq酶模板DNAdNTP引物BufferH2OMg2+PCR產(chǎn)物Taq酶模板DNAdNTP引物BufferH2OMg2+2024/10/21PCR法獲取目的基因17PCR技術(shù)的基本過程(3)瓊脂糖凝膠電泳2024/10/21PCR法獲取目的基因18（1）PCR反應(yīng)體系成分模板（Template）DNA模板濃度：一般為1

g/mL左右；單、雙鏈DNA；線狀DNA分子、環(huán)狀DNA分子均可；DNA模板不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑等；模板的濃度和純度是影響PCR的重要因素：模板過多可能增加非特異性產(chǎn)物；純度不高會(huì)影響PCR的效率，甚至得不到產(chǎn)物。3.PCR反應(yīng)條件2024/10/21PCR法獲取目的基因19引物（Primer）濃度：0.1-0.5mol/L，濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)可遵循下列原則：長(zhǎng)度：約16-30bp，太短影響引物與模板的配對(duì)；四種堿基隨機(jī)分布，在3’端不存在連續(xù)3個(gè)G或C，這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)（falsepriming）；G+C含量：通常為40-60%，可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度——Tm＝4(G+C)+2(A+T)；引物3’端：關(guān)鍵堿基，必須與模板完全配對(duì)，最好對(duì)應(yīng)密碼子的第一或第二位核苷酸，以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)。2024/10/21PCR法獲取目的基因20引物內(nèi)部：尤其在3’端，不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）、二聚體（Dimer）；引物之間：尤其在3’端，不能互補(bǔ)以防出現(xiàn)引物二聚體（crossdimer），減少產(chǎn)量；兩引物間最好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性；引物5’端：對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等。通常應(yīng)在5’端限制酶位點(diǎn)外再加3-4個(gè)保護(hù)堿基；引物不產(chǎn)生falsepriming：不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)，避免錯(cuò)誤引發(fā)PCR擴(kuò)增。2024/10/21PCR法獲取目的基因213’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列、啟動(dòng)子序列、定點(diǎn)突變、探針標(biāo)記TaqDNA聚合酶（Thermusaquaticus)濃度：0.5-2.5U/50L體系，所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p，酶量增加使反應(yīng)特異性下降，酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量；TaqDNA聚合酶活性的半衰期：92.5℃130min；95℃40min；97℃5min；TaqDNA聚合酶的酶活性單位定義：74℃下，30min，摻入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量；TaqDNA聚合酶的出錯(cuò)率：一般，PCR產(chǎn)物中堿基出錯(cuò)率為1×10-5/bp，在利用PCR克隆和進(jìn)行序列分析時(shí)應(yīng)注意。類型：TaqDNA聚合酶——普通型，PCR產(chǎn)物末端為A；

PfuDNA聚合酶(Pyrococcusfuriosus)——高保真，出

錯(cuò)率為1×10-6/bp，PCR產(chǎn)物為平末端。2024/10/21PCR法獲取目的基因22反應(yīng)緩沖液（PCRbuffer）組分：一般含10-50mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)、50mmol/LKCl和適當(dāng)濃度的Mg2+；Tris·Cl：在20℃時(shí)pH為8.3-8.8，但在實(shí)際PCR反應(yīng)中,pH為6.8-7.8；50mmol/L的KCl：有利于引物的退火；Buffer中加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)，可穩(wěn)定酶活性；加入T4噬菌體的基因32蛋白對(duì)擴(kuò)增較長(zhǎng)的DNA片段有利；各種TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。2024/10/21PCR法獲取目的基因23Mg2+Mg2+的作用：DNA聚合酶的激活劑，可影響酶的活性和真實(shí)性,還影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。在PCR反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)（如磷酸基團(tuán)、EDTA等可能影響Mg2+離子濃度的物質(zhì)），以保證最適Mg2+濃度；濃度：0.5mmol/L-2mmol/L，Mg2+濃度過低會(huì)降低Taq酶活性；Mg2+濃度過高影響反應(yīng)特異性。對(duì)于一種新的PCR反應(yīng)，可以用0.1-5mmol/L的梯度進(jìn)行Mg2+預(yù)備實(shí)驗(yàn),選出最適的濃度；dNTP可與Mg2+結(jié)合：使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。2024/10/21PCR法獲取目的基因24dNTP（4種三磷酸脫氧核苷酸）濃度：20-200μmol/L，dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量；理論上4種dNTP各20μmol/L,就足以在100μL反應(yīng)中合成2.6μg的DNA。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時(shí)可抑制TaqDNA聚合酶的活性；四種dNTP濃度應(yīng)相等，以減少合成中由于某種dNTP不足而導(dǎo)致的摻入錯(cuò)誤；dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。dNTP制備：應(yīng)用NaOH將dNTP溶液的pH調(diào)至7.0，并用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確濃度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分裝，-20℃貯存。2024/10/21PCR法獲取目的基因252024/10/21PCR法獲取目的基因26（2）PCR循環(huán)參數(shù)預(yù)變性：94℃，5min變性：94℃，20s-45s（使雙鏈DNA解鏈為單鏈）退火：溫度由引物的解鏈溫度Tm決定，時(shí)間為45s左右。提高溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。延伸：一般為72℃，時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定。循環(huán)次數(shù)：主要取決于模板DNA的濃度，一般為25-35次。次數(shù)過多，導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低，錯(cuò)誤摻入率增加。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)。延伸補(bǔ)齊：72℃，5min—10min2024/10/21PCR法獲取目的基因274.注意事項(xiàng)PCR實(shí)驗(yàn)應(yīng)該在一個(gè)沒有核酸和核酸酶污染的環(huán)境中進(jìn)行。操作過程中均應(yīng)戴手套。最好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)空間。PCR試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。PCR的樣品應(yīng)在冰上融解，并且要充分混勻。2024/10/21PCR法獲取目的基因28EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗。沾染了EB的實(shí)驗(yàn)垃圾需專門回收處理。觀察DNA離不開紫外透射儀，可是紫外光對(duì)DNA分子有切割作用。從膠上回收DNA時(shí)，應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間并采用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈(300-360nm），以減少紫外光切割DNA。制備PCR反應(yīng)體系時(shí)，每加完一個(gè)組分，要更換tip頭，以防止互相污染。電泳加樣時(shí)，也要每個(gè)樣品更換tip頭，并要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡勰z刺穿。2024/10/21PCR法獲取目的基因29陽(yáng)性對(duì)照:選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該目的產(chǎn)物的標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照樣品，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下)。但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本，對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。2024/10/21PCR法獲取目的基因30陰性對(duì)照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必安排陰性對(duì)照，包括標(biāo)本對(duì)照:經(jīng)確認(rèn)的陰性標(biāo)本試劑對(duì)照:在PCR反應(yīng)混合物中不加模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否受到污染（能控制貯存試劑可能出現(xiàn)的污染或加樣器被DNA模板的氣溶膠污染）。5.防止污染的方法合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行。最好能劃分標(biāo)本處理區(qū)、PCR反應(yīng)液制備區(qū)、PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū)、PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)等。實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用。吸樣槍污染：實(shí)驗(yàn)操作時(shí)不慎將樣品或模板吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板時(shí)要十分小心。吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。2024/10/21PCR法獲取目的基因31預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭，小離心管應(yīng)一次性使用。設(shè)立適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。2024/10/21PCR法獲取目的基因32減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來(lái)核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。6.實(shí)驗(yàn)舉例本實(shí)驗(yàn)以含有小鼠基因T10的質(zhì)粒pCMV-Myc-T10為模板，擴(kuò)增長(zhǎng)約800bp的T10基因的PCR產(chǎn)物。2024/10/21PCR法獲取目的基因33InsertEcoRIXhoIpCMV-Myc-T102024/10/21PCR法獲取目的基因34PCR儀、臺(tái)式離心機(jī)、滅菌的微量離心管、凝膠電泳系統(tǒng)等TaKaRaTaq(5U/μl)10×PCR緩沖器(含Mg2+)dNTP混合(各2.5mmol/L)模板(10ng，質(zhì)粒)引物（P1和P2,10mmol/L)實(shí)驗(yàn)儀器及材料10×PCR緩沖液：(100mmol/LTris-HCl,pH8.3,500mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2)2024/10/21PCR法獲取目的基因35P1:5’TTCCAAGCTTCACCATGGCATCAATGCAGAAGC保護(hù)性堿基HindIIITm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝4×12＋2×11＝70℃.P2:5’TCGCGGATCCAGTGGCAGCTTGCTAATCTCATTG保護(hù)性堿基BamHITm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝4×11＋2×13＝70℃.引物設(shè)計(jì)2024/10/21PCR法獲取目的基因36模板:1μl(10ng)P1:1μl(0.5μmol/L)P2:1μl(0.5μmol/L)dNTPs:4μl(0.3mmol/L)Taqpolymerase:0.5μl(2.0U/μl)10×緩沖液（Mg2+）:5μlddH2O:37.5μlPCR反應(yīng)體系（50μl）2024/10/21PCR法獲取目的基因3794℃變性5min后開始以下循環(huán)94℃變性反應(yīng)45sec65℃退火反應(yīng)45sec72℃延伸反應(yīng)1min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)最后，72℃反應(yīng)7min；4℃冷卻，保存。PCR反應(yīng)條件2024/10/21PCR法獲取目的基因38取3-5μlPCR產(chǎn)物，采用1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的量，檢測(cè)引物擴(kuò)增的特異性，并可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)脫氧核糖核酸（marker）的量粗略計(jì)算PCR產(chǎn)物的總量。學(xué)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果(4μl)PCR產(chǎn)物檢測(cè)1.0kbMarker目的產(chǎn)物2024/10/21PCR法獲取目的基因39

四、PCR的類型1.不對(duì)稱PCR目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物，分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01μmol/L：0.5μmol/L，關(guān)鍵是限制性引物的絕對(duì)量。用途：制備核酸序列測(cè)定的模板制備雜交探針2024/10/21PCR法獲取目的基因40

高濃度引物低濃度引物2024/10/21PCR法獲取目的基因412.降落PCR(touch-downPCR)

在多個(gè)PCR循環(huán)中，退火溫度逐步降低。開始的退火溫度選擇為高于Tm值，隨著循環(huán)進(jìn)行，退火溫度逐漸降低到Tm值，并最終低于這個(gè)水平。選擇初始復(fù)性溫度的原則：起始復(fù)性溫度應(yīng)該比引物的Tm值高出5-10度，然后每個(gè)循環(huán)遞減1-2度。原理：隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時(shí)已經(jīng)擴(kuò)增出來(lái)，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴(kuò)增。2024/10/21PCR法獲取目的基因423.熱起動(dòng)PCR(hotstartPCR)熱起動(dòng)PCR是除了設(shè)計(jì)好的引物之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管TaqDNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，但聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始時(shí)，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。進(jìn)行反應(yīng)之前，先不加Taq酶，等溫度上升到72℃后再加入Taq酶。PlatinumDNA聚合酶用于自動(dòng)熱起動(dòng)PCR。常溫時(shí)活性被封閉，94—95℃加熱幾分鐘后才激活其活性。2024/10/21PCR法獲取目的基因432024/10/21PCR法獲取目的基因444.嵌套PCR(nestedprimerPCR)采用兩對(duì)引物進(jìn)行PCR，其中第二對(duì)引物位于第一對(duì)引物內(nèi)P1上P1下P2上P2下用途：驗(yàn)證第一次PCR產(chǎn)物的特異性；合成探針模板。5.反向PCR(reversePCR)目的：是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段，對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。用途：探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克?。唤⒒蚪M步移文庫(kù)。已知序列未知序列未知序列2024/10/21PCR法獲取目的基因45PCR法獲取目的基因6.多重PCR（復(fù)合PCR）目的：用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。電泳引物123412342024/10/21467.LP-PCR（Labelledprimers)目的：利用同位素、熒光素等對(duì)PCR引物進(jìn)行標(biāo)記，用以直觀檢測(cè)目的基因。用途：特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷；可同時(shí)檢測(cè)多種基因成分。病毒1病毒2病毒3病毒42024/10/21PCR法獲取目的基因47標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物2024/10/21PCR法獲取目的基因488.錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）PCR技術(shù)需了解靶基因片段兩個(gè)末端的序列對(duì)于未知序列怎么辦？2024/10/21PCR法獲取目的基因49cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC錨定PCR首先合成第一鏈cDNA，然后再添加一同聚物尾巴（polydG)，利用與同聚物尾巴配對(duì)的3’錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點(diǎn)的polydC)一起作PCR擴(kuò)增。2024/10/21PCR法獲取目的基因509.PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴(kuò)增探針親和固相介質(zhì)檢測(cè)探針信號(hào)可用于基因芯片的制作2024/10/21PCR法獲取目的基因5110.原位PCR（1）原位PCR的概念原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（

insituPCR，ISPCR）：由Haase等于1990年建立。它利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段。在不破壞細(xì)胞的前提下，利用一些特定的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可進(jìn)行基因表達(dá)的細(xì)胞定位，適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列。2024/10/21PCR法獲取目的基因52

（2）原位PCR的作用鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH），但在每個(gè)細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下，該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列，敏感度很高，但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來(lái)，成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種有效的檢測(cè)技術(shù)。利用該方法可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA的表達(dá)產(chǎn)物。2024/10/21PCR法獲取目的基因53（3）操作步驟細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后使得一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）能夠進(jìn)入細(xì)胞PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽(yáng)性對(duì)照B.陰性對(duì)照C.原位檢測(cè)mRNA表達(dá)2024/10/21PCR法獲取目的基因5411.反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶mRNAcDNADNA-RNA雜合雙鏈PCR擴(kuò)增2024/10/21PCR法獲取目的基因552024/10/21PCR法獲取目的基因5612.熒光定量PCR（real-timePCR)

原理：通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控PCR反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。2024/10/21PCR法獲取目的基因57（1）熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料：SYBRGreenI序列特異性探針TaqmanMolecularBeacons（分子信標(biāo)）：DualProbes(FRET)熒光共振能量轉(zhuǎn)移Amplifluor(Intergen)2024/10/21PCR法獲取目的基因58（2）熒光定量實(shí)時(shí)PCR與普通PCR的比較實(shí)時(shí)在線監(jiān)控：對(duì)樣品擴(kuò)增的整個(gè)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，能夠?qū)崟r(shí)地觀察到產(chǎn)物的增加，直觀地看到反應(yīng)的對(duì)數(shù)期。降低反應(yīng)的非特異性：使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合，提高了PCR反應(yīng)的特異性。增加定量的精確性：全程監(jiān)控，利用準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量。結(jié)果分析更加快捷方便，無(wú)需電泳檢測(cè)

。2024/10/21PCR法獲取目的基因59全新4通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

普通梯度PCR儀2024/10/21PCR法獲取目的基因6013.鏈特異性RT-PCRPCR相關(guān)的術(shù)語(yǔ)和產(chǎn)品層出不窮T-vectorHotStartTaqRT-PCRRAPD-PCRDDRT-PCRLM-PCRInversePCRNestedPCRReal-timePCRRACEFlowchipPCRTASMultiplex