HPLC-UV測定加替沙星的血藥濃度

HPLC-UV測定加替沙星的血藥濃度背景1.高效液相色譜：高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對試樣的分析。高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)：①高壓輸液泵：驅(qū)動流動相和樣品通過色譜分離柱和檢測系統(tǒng)；②色譜柱：分離樣品中的各個(gè)物質(zhì)；③進(jìn)樣器：將待分析樣品引入色譜系統(tǒng)；④檢測器：將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉(zhuǎn)化為光學(xué)或電學(xué)信號；⑤餾分收集器：為做其它波譜鑒定或獲取少量試驗(yàn)樣品的小型制備，進(jìn)行餾分收集；⑥數(shù)據(jù)獲取與處理系統(tǒng)：把檢測器檢測到的信號顯示出來。2.加替沙星是又一新型氟哇諾酮的C位用3一甲基呱嗓基取代的衍生物。具有抗菌譜廣,抗菌活性強(qiáng)的特點(diǎn)。加替沙星對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、厭氧菌、需氧菌及非典型致病原均有較強(qiáng)的活性，同時(shí)又具有口服吸收好,體內(nèi)分布廣,光毒性小等特點(diǎn)。二、目的掌握如何利用高效液相的方法測定家兔血清中加替沙星血漿藥物濃度。研究注射液加替沙星在家兔體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征。三、材料儀器：高效液相色譜儀、離心機(jī)、渦旋振蕩儀；試劑：烏拉坦、加替沙星注射液、空白血漿、標(biāo)準(zhǔn)液、10%高氯酸溶液，所用溶液均為分析純。四、方法動物實(shí)驗(yàn)：取健康家兔，稱重，耳緣靜脈注射烏拉坦（5ml/kg）麻醉，固定。耳緣靜脈注射加替沙星注射液（30ml/kg），給藥停止后分別于2,5,10,15,30,45,60,90,120min時(shí)進(jìn)行血液樣本采集，每次取血0.5ml，所用方法為股動脈取血，所取血液樣本裝入無菌微量離心管。色譜條件：色譜柱：ZORBAXExtend-C184.6×150mm；流動相：甲醇：0.05mol/L檸檬酸=25:75（pH=3）；流速：1mL/min；檢測波長：293nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μL。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：無菌微量離心管中加入空白血漿90μL、標(biāo)準(zhǔn)液10μL、10%高氯酸溶液100μL，渦旋振蕩3min，然后12000rpm離心10min，取上清液120μL。取20μL上清液進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測定：取100μL樣品，加入100μL高氯酸溶液，剩余步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線，以取血時(shí)間為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作樣本學(xué)藥濃度曲線。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線血藥濃度曲線時(shí)間（min）25101530456090120面積515464385129268089200687129184105598822586291446352濃度（μg/ml)38.4828.6619.84714.7699.3837.6064.9094.39093.143濃度對數(shù)1.5852350631.4572761861.297694871.169351090.9723417160.8811563210.6909930320.6425535460.497344381藥動學(xué)參數(shù)計(jì)算：由濃度時(shí)間曲線推斷為房二室模型由濃度對數(shù)時(shí)間曲線得：分布速率常數(shù)α=0.0818lgA=1.6481藥物的分布半衰期t1/2α=7.81min消除速率常數(shù)β=0.0074lgB=0.9008藥物的消除半衰期t1/2β=86.35min=1.43h初始血藥濃度C0=38.48(μg/mＬ)血藥濃度－時(shí)間曲線下總面積AUC=41格*20μg/mＬ·min=13.67(μg/mＬ·h)Vd=(30mg/kg)*(2kg)/38.48(μg/mＬ)=1.559LCL=0.692(Ｌ/h)MRT=1/0.0074=135.13min六、討論.采血：每只兔耳耳緣靜脈有兩條，采血前均應(yīng)備齊，以免采血時(shí)不慎將血管破壞后不能及時(shí)采血；采集血樣時(shí)應(yīng)從耳尖向耳根方向依次取血，如任意采血，后幾個(gè)點(diǎn)因血管被破壞無法采到；每次采血時(shí)應(yīng)先使其劇烈運(yùn)動，加速血液循環(huán)，便于采血；采血還應(yīng)注意取血手法，應(yīng)用中指墊住耳背，食指與無名指確定采血曲間，快而穩(wěn)的進(jìn)針，抽血時(shí)要慢，因耳緣靜脈血管較細(xì)，如抽血過快血管易抽癟，無法采血。樣品處理：甲醇與乙腈是反相液相色譜法中常用的蛋白沉淀劑，因?yàn)樗鼈兣c流動相的組成相同。甲醇沉淀蛋白的優(yōu)點(diǎn)是上清液清澈，沉淀為絮狀易于分離；乙腈與之相反，產(chǎn)生細(xì)的蛋白沉淀，但沉淀效率較甲醇高。因本實(shí)驗(yàn)流動相選擇甲醇且取上清液，故選用甲醇沉淀蛋白。通過查找文獻(xiàn)，加替沙星靜脈滴注1h左右達(dá)血藥濃度峰值，在推薦劑量范圍內(nèi)加替沙星血藥濃度峰值和曲線下面積隨劑量成比例增加。本藥口服與靜脈注射生物等效，口服絕對生物利用度約為96%，且靜脈注射后1h的藥動學(xué)與口服等劑量片劑相同，即靜脈注射和口服兩種給藥方式可交替使用。加替沙星與蛋白結(jié)合率約為20%，與濃度無關(guān)。藥物廣泛分布于組織和體液中。本藥無酶誘導(dǎo)作用，不改變自身和其他合用藥物的清除代謝，且在體內(nèi)代謝極低，主要以原形經(jīng)腎臟排出。pH值的影響：pH值對保留時(shí)間和分離效果影響較大。考察在3.0，3.5，4.0，5.0分離效果，隨著pH值的增大，保留時(shí)間延長，且不能完全分離環(huán)丙沙星和洛美沙星，而當(dāng)pH值在3.5，3.0時(shí)分離較好，但pH=3.0時(shí)對色譜柱壽命有影響，所以選用pH=3.5。柱溫的影響：考察了常溫，20℃，30℃，40℃，45℃5種溫度，溫度越高，出峰越快，且柱效高，但高于40℃后變化不大，且對色譜柱壽命有影響，故本實(shí)驗(yàn)柱溫定為40℃。關(guān)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果：①加替沙星是第4代氟喹諾酮類抗生素,廣泛應(yīng)用于革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌、衣原體、支原體等病原體引起的感染。本實(shí)驗(yàn)建立用高效液相色譜（HPLC）法測定加替沙星血藥濃度方法,為臨床合理用藥提供參考；②由血藥濃度時(shí)間曲線判斷為房二室模型；③根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分布半衰期為7.81min，表明靜注加替沙星后7-8min就可分布在家兔體內(nèi)各組織中，且分布量高，具有很高的抗菌濃度；④消除半衰期為1.43h，表明靜注加替沙星后較長一段時(shí)間內(nèi)，各組織仍有較高的抗菌濃度；⑤根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，半衰期數(shù)據(jù)比較符合文獻(xiàn)的資料，說明藥物代謝比較接近正常的情況；⑥根據(jù)表觀分布容積，可看出藥物基本分布在血液。關(guān)于實(shí)驗(yàn)操作：①在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)進(jìn)樣之前，需用甲醇沖洗色譜柱；