醫(yī)學教案γ-氨基丁酸及其A型受體在胃癌SGC-7901細胞的表達及對細

*該課題受到安徽省衛(wèi)生廳醫(yī)學科研課題資助（09C236）**通訊聯(lián)系人Tel(023)89011172,E-mail:zhangyu0323@21ThisworkwassupportedbygrantsfromAnhuiProvinceHealthOfficeMedicalR**Correspondingauthor.Tel(023)89011172,E-mail:zhangyu0323@21γ-氨基丁酸及其A型受體在胃癌SGC-7901細胞的表達及對細胞增殖的影響史良會1,2張才全1*(400016重慶，重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科1，241001安徽蕪湖，皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院普外科2)【摘要】：目的觀察GABA，GAD65，GABRP在胃癌SGC-7901細胞中的表達及對細胞增殖、周期分布的影響。方法RT-PCR、IF及WesternBlot檢測胃癌細胞SGC-7901中GABA、GAD65及GABRPmRNA及蛋白表達；1μM，10μM，100μMGABA，0.5μM,5μM,50μMMuscimol，0.5μM,5μM,50μMBicucullin分別作用于胃癌細胞SGC-790148h后，新型四唑氮鹽（MTS）比色法檢測細胞增殖情況，流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。結果GAD65，GABRPmRNA及蛋白表達均于SGC-7901細胞中；GABA，GABRP及GAD65蛋白定位于SGC-7901細胞胞膜胞漿；與空白組比較，1μMGABA，5μM及50μMMuscimol作用SGC-7901細胞48h后，細胞生長的增殖率上升，5μM，50μMBicucullin作用SGC-7901細胞48h后，細胞生長抑制率上升；1μMGABA可導致細胞G0/G1數(shù)量的減少，G2/M期數(shù)量的增加；3個濃度的Muscimol可導致G0/G1期數(shù)量的減少，5μM、50μMMuscimol可導致細胞G2/M期數(shù)量增加；5μM，50μMBicucullin可導致G2/M期數(shù)量的減少，（P＜0.05）。結論GABA及其A受體在SGC-7901細胞中的表達可能促進細胞增殖，擾亂細胞周期進程，促使細胞分裂?！娟P鍵詞】：胃癌；γ-氨基丁酸；增殖；細胞周期InfluenceoftheexpressionofGABAandGABRPingastriccancerSGC-7901cellsoncellmigrationabilityShiLianghui1,2ZhangCaiquan1(1DepartmentofGastrointestinalSurgery,theFirstAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2YijishanHospitalofWannanMedicalCollege,Wuhu241000,china)[Abstract]:ObjectiveToinvestigatetheexpressionofGABA,GAD65andGABRPinSGC-7901cellsandtheeffectsofcellproliferation,cellcycle.MethodsRT-PCR,WesternBlotandIFwereusedtodetecttheexpressionGABA,GAD65andGABRPingastriccancercellsSGC-7901.SGC-7901cellswereculturedfor48hwith1μM，10μM，100μMGABA，0.5μM,5μM,50μMMuscimol，0.5μM,5μM,50μMBicucullinconcentrationsofGABA,MuscimolandBicucullin.MTSassaywasusedtoexaminecellproliferation.Flowcytometrywasusedtoanalysescellcycledistribution.ResultsThemRNAandproteinofGABA,GAD65andGABRPwereallexpressedinSGC-7901cells.GABA,GAD65andGABRPproteinlevelwerepredominantlylocalizedonthecellcytoplasmofSGC-7901.Comparedwithblankgroup,thecellsproliferationwereobviouslystimulatedin1μMGABA,5μMand50μMMuscimolgroups,butsignificantlyinhibitedin5μM，50μMBicucullingroups.FlowcytometryanalysisshowedthatthepercentageofcellsinG0/G1phasedecreasedwhilethenumberofcellsinG2/Mphaseincreasedin1μMGABAgroup.DifferentconcentrationsofMuscimolreducedG0/G1phasecellpercentage,butbothof5μMand50μMconcentrationsofMuscimolelevatedG2/Mphasecellpercentage.In5μM，50μMBicucullingroups,thepercentageofG2/Mphasecellwerereduced,(P＜0.05).ConclusionHigherexpressionofGABAandGABRPinSGC-7901cellsmaypromotecellproliferation,disturbcellcycleproceeding,andacceleratecelldivision.[Keywords]：gastriccancer；γ-aminobutyricacid；Proliferation；Cellcycle中圖分類號：R753.2文獻標識碼：A前言γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid,GABA）是哺乳動物中樞神經系統(tǒng)最重要的抑制性神經遞質，它主要由谷氨酸經L-谷氨酸脫羧酶（L-glutamatedecarboxylase,GAD）的脫羧作用生成。GAD65和GAD67是合成GABA的主要限速酶?，F(xiàn)已明確，GABA存在于哺乳動物多種外周組織，并扮演了除了神經傳導及神經調節(jié)外的多種功能[1]。近年來的研究表明，GABA與GABA受體（GABAreceptor,GABAR）還高表達于多種腫瘤組織，通過MAPKs等信號轉導途徑調控腫瘤增殖及侵襲轉移，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。文獻報道[3]，在胃癌組織中，GABA的表達及其合成酶GAD的活性均明顯高于正常組織。因此本文探討在胃癌細胞中，GABA及其A受體（GABAAR）的表達是否參與了胃癌細胞的增殖及細胞周期的調控。1材料與方法1.1主要材料和試劑1.1.1菌株人胃腺癌細胞株SGC-7901購自中科院上海細胞庫。1.1.2正常腦組織正常腦組織取自腦外傷后早期清創(chuàng)，并獲得患者知情同意書，整個實驗過程遵循醫(yī)學倫理學的原則。1.1.3主要試劑RT-PCR試劑盒，MTS購于Promega公司，兔多抗GABA，GAD65抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，兔多抗π-GABAAR抗體購自SantaCruze，F(xiàn)ITC兔抗羊二抗購自北京中山生物技術有限公司，GABA、GABAA R激動劑Muscimol、GABAAR拮抗劑Bicucullin均購自Sigma，WesternB1.1.4引物設計與合成根據GenBank發(fā)布的GABRP[Gamma-aminobutyricacid（GABA）Areceptor,pi]，GAD65[glutamatedecarboxylase2(brain,65kDa)，（GAD65）]，GAPDH編碼區(qū)序列，采用PrimerPremier5.0設計引物，送于上海生工合成。GABRP，NM_014211.2，上游引物：5'GAGGGAACGACTCTGTGCG3'，下游引物：5'CTGCCATCTGCTGTAAGGA3'，擴增產物為429bp；GAD65，M81882.1，上游引物：5'CCTCCTACCTCTTTCAGCA3'，下游引物：5'TTCCCATCAAACACCATCT3'，擴增產物為226bp；GAPDH，NM_002046.3，上游引物：5'TGAAGGTCGGAGTCAACGG1.2實驗方法1.2.1細胞培養(yǎng)胃腺癌細胞株SGC-7901細胞培養(yǎng)于含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基，于37℃1.2.2免疫熒光檢測將細胞種植于無菌蓋玻片，待生長至80﹪左右，取出玻片，按免疫熒光常規(guī)步驟操作。一抗以1:200稀釋，陰性對照以采用正常兔血清IgG代替一抗。激光共聚焦顯微鏡掃描呈像。1.2.3RT-PCR檢測待細胞生長密度為90%時，倒掉培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞2次，隨后于冰上加入預冷Trizo1，提取總RNA，按試劑盒說明進行兩步法RT-PCR。PCR反應條件為：94℃2min預變性，然后94℃30sec，53℃～55.5℃30sec，72℃1min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。所得產物經20g1.2.4WesternBlot檢測待細胞生長至90%以上密度時，刮取細胞，以細胞裂解液充分裂解細胞；收集正常胃組織，勻漿后，加入裂解液充分裂解。隨后均于4℃12000r/min離心5min，吸取上清液，測定蛋白濃度后，行SDS。將凝膠半干轉于PVDF膜，5%的TBST脫脂奶粉室溫封閉1h，一抗41.2.5MTS檢測取對數(shù)生長期細胞，96孔細胞培養(yǎng)板每孔接種5×103個細胞中，每孔體積100μl，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，然后分別加入含不同干預濃度的GABA（0μM，1μM，10μM，100μM），GABAAR激動劑（0.5μM，5μM，50μM）、GABAAR拮抗劑（1μM，10μM，100μM），每個濃度重復8孔，設置空白組，在48h后，每孔加入MTS液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)48h，用全自動酶標儀于492nm波長檢測各孔吸光度（A）值，空白對照調零并計算增殖率或抑制率，實驗重復3次。以抑制率或增殖率為縱軸，以濃度為橫軸繪制折線圖。按下列公式計算細胞增長率：增殖率=（藥物組A值／對照組A值）×100%；抑制率=（1-1.2.6流式細胞儀檢測收集經上述處理后的各組細胞，消化后，1000r/min離心5min，PBS清洗2次，每次10分鐘，隨后用70%冰乙醇固定過夜，離心后每樣品管中加1ml碘化丙啶（PI）染液，4℃避光染色30min，流式細胞儀檢測細胞周期1.3統(tǒng)計學分析試驗數(shù)據利用SPSS16.0統(tǒng)計軟件中One-WayANOVA模塊分析，多組間數(shù)據先經LSD轉換后進行單因素方差分析，統(tǒng)計數(shù)據以x±s表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1RT-PCR檢測GAD65、GABRPmRNA在SGC-7901細胞中的表達（見圖1）電泳結果顯示，分別在429bp，226bp及223bp處可見清楚條帶，說明GABRP，GAD65mRNA表達于胃癌細胞SGC-7901細胞中,其中腦組織結果為陽性對照。圖1RT-PCR檢測腦組織及SGC-7901細胞中GABRP，GAD65mRNA的表達2.2免疫熒光定性檢測GABRP、GABA、GAD65蛋白在SGC-7901細胞中表達（見圖2）激光共聚焦結果顯示，GABRP，GABA，GAD65表達于SGC-7901細胞胞膜胞漿，激發(fā)出綠色熒光，紅色為PI染核。陰性對照未見陽性表達。圖2免疫熒光檢測GABA，GAD65，GABRP在SGC-7901細胞中的表達（×200）2.3Westernblot定量檢測GAD65、GABRP蛋白在SGC-7901細胞中表達（見圖3）Westernblot結果顯示，GABRP及GAD65蛋白表達于在SGC-7901細胞中，腦組織結果為陽性對照。圖3Westernblot檢測SGC-7901細胞及腦組織中GAD65，GABRP蛋白的表達2.4MTS檢測不同濃度的GABA及GABAAR激動劑、拮抗劑對SGC-7901細胞增殖的影響（見圖4）1μM，10μM，100μMGABA作用SGC-7901細胞48h后，細胞的增殖率分別為11.4%，7.9%，6.4%，與空白對照相比，1μMGABA對細胞的增殖率顯著升高（P<0.05）。0.5μM，5μM，50μMMuscimol作用SGC-7901細胞48h后，細胞的增殖率分別為9%，31.1%，26%，可見5μM，50μMMuscimol可顯著提高細胞的增殖率（P<0.01）。0.5μM，5μM，50μMBicucullin作用SGC-7901細胞48h后，細胞的抑制率分別為6.58%，10.9%，16%?？梢?μM，50μMBicucullin可顯著抑制細胞增殖（P<0.05）。2.5流式細胞儀檢測不同濃度的GABA及GABAAR激動劑和拮抗劑對SGC-7901細胞周期的影響（見圖5）與空白組比較，1μM、10μMGABA可顯著降低細胞G0/G1期細胞數(shù)量，并且1μMGABA可顯著增加細胞G2/M期數(shù)量（P<0.05），見表1。提示對于SGC-7901細胞，1μMGABA可能通過減少G0/G1期細胞數(shù)量、增加G2/M期細胞數(shù)量，促使更多的細胞進入分裂期。100μMGABA卻顯著增加細胞G0/G1期數(shù)量的增加，提示高濃度的GABA可能將細胞阻滯于G0/G1期，不利于細胞增殖。外源性給予不同濃度的GABAAR激動劑Muscimol均可導致G0/G1期細胞數(shù)量的減少，并隨著濃度的增加，G2/M期細胞數(shù)量逐漸上升，與空白組比較，5μM、50μMMuscimol呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），見表2。提示了5μMMuscimol可有效促進SGC-7901細胞增殖。（P＜0.05）。不同濃度的GABAAR拮抗劑對細胞各期的阻滯效果不一。0.5μMBicucullin可顯著減少G0/G1數(shù)量、但顯著增加S期細胞數(shù)量；5μMBicucullin可顯著減少G2/M期的細胞數(shù)量；50μMBicucullin可顯著增加G0/G1的細胞數(shù)量，并顯著減少G2/M期的細胞數(shù)量，（P＜0.05），見表3。提示了低濃度的Bicucullin可能通過升高S期細胞數(shù)量，而高濃度的Bicucullin則可能通過顯著降低G2/M期細胞數(shù)量，亦（或）提高G0/G1細胞數(shù)量，以達到抑制細胞增殖效果。表1.不同濃度GABA對細胞周期變化的影響（x±s）組別nG0/G1SG2/M空白組364.35±1.0627.67±1.817.99±0.77GABA1μM組353.48±2.20*31.51±1.2414.93±1.73*GABA10μM組354.52±3.73*33.73±2.8711.75±1.07GABA100μM組372.67±2.38*18.38±0.17*9.05±2.16*：與空白組織比較：P<0.05表2.不同濃度Muscimol對細胞周期變化的影響（x±s）組別nG0/G1SG2/M空白組364.35±1.0627.67±1.817.99±0.77Muscimol0.5μM組353.20±0.70*38.21±1.24*8.65±1.14Muscimol5μM組353.39±1.13*31.80±1.5214.81±0.65*Muscimol50μM組355.77±0.72*30.00±2.1314.24±1.41**：與空白組織比較：P<0.05表3.不同濃度Bicucullin對細胞周期變化的影響（x±s）組別nG0/G1SG2/M空白組364.35±1.0627.67±1.817.99±0.77Bicucullin0.5μM組353.11±2.65*40.74±4.52*6.16±1.80Bicucullin5μM組369.58±1.1325.64±3.184.71±2.40*Bicucullin50μM組370.99±1.62*26.02±3.123.23±1.78**：與空白組織比較：P<0.053討論早期被鑒定為抑制性神經遞質的GABA，隨后發(fā)現(xiàn)其具有可以調節(jié)腦及外周細胞增殖，分化的功能。在結腸癌、前列腺癌、胃癌、腮腺瘤，甲狀腺癌組織中，研究發(fā)現(xiàn)GABA顯著高表達，GAD的活性也明顯增加，而且在肝癌、乳腺癌等癌組織，GABAAR表達也顯著增強。因此，外周組織中GABA及GABAAR的異常表達可能與腫瘤的發(fā)生相關[4-7]。朱人敏等[8-9]人提出，在正常胃粘膜中，沒有GAD65表達，僅有GAD67mRNA的表達，且在胃癌中表達下調，并推測有其他酶參與胃癌中GABA合成。KentaroMaemura等[10]人指出，在印戒癌細胞株KATIII細胞中，可檢測到GAD65mRNA及蛋白的表達，而GAD67的表達幾乎檢測不到。本實驗結果顯示，在SGC-7901細胞中同樣檢測不到GAD67的表達，僅可見GAD65mRNA及蛋白較低水平的表達。免疫熒光結果提示，GABA定位于細胞的胞膜胞漿，進而發(fā)現(xiàn)，外源性給予1μMGABA可顯著促進細胞增殖，影響細胞周期進程。因此我們推測，在胃癌中，GABA亦或存在旁分泌來源形式參與了細胞的增殖等作用。GABA受體根據其不同的藥理特征分成A、B、C三種類型。GABAA型受體（GABAAR）是由5個亞單位組成離子門控的氯化物通道。迄今已發(fā)現(xiàn)至少21個不同的亞基：6種α亞基、4種β亞基、4種γ亞基、3種δ亞基、1種ε亞基和π亞基等，不同亞基組成的受體產生不同的生理效應[11]。在直腸結腸癌中，GABAA型受體相關蛋白高表達，為一個判斷預后的獨立指標并可與患者存活時間減少相關[12]。體外研究證實，GABAA型受體的激動劑異丙酚誘導結腸癌細胞LOVO的侵襲能力下降[13]。本文采GABAAR拮抗劑及激動劑干預SGC-7901細胞后，并沒有檢測到細胞侵襲能力的變化，而且KentaroMaemura等人在表達A受體的胃癌細胞KATIII中，同樣沒有發(fā)現(xiàn)A型受體參與細胞侵襲功能的現(xiàn)象。與此同時，在肝癌細胞中，研究發(fā)現(xiàn)GABA能促進肝癌細胞株HepG-2細胞增殖，并引起細胞惡化改變[14]。A受體的π亞基在中樞神經系統(tǒng)中僅定位于海馬及顳皮質兩個大腦區(qū)域，但分布于多種外周組織，不表達于胃組織，并推測π亞基對于GABAAR在外周組織中的作用扮演著非常關鍵的角色。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織中存在過度表達π亞基現(xiàn)象，且采用GABAAR拮抗劑處理胰腺癌細胞，可顯著抑制細胞的生長發(fā)育[15]。且因此本文選擇GABAA受體π亞基為研究對象，檢測在胃癌細胞中是否存在其異常表達。本文結果表明，SGC-7901細胞中均能檢測到GABAARπ亞基mRNA及蛋白表達。隨后，我們采用不同濃度的GABAAR激動劑Muscimol，GABAAR拮抗劑Bicucullin處理細胞，MTS檢測結果表明了，5μMMuscimol均可顯著提高SGC-7901細胞增殖率，50μMBicucullin可顯著抑制細胞增殖。提示了GABRP在SGC-7901細胞中的表達促進了SGC-7901增殖。在低分化的胃癌細胞KATIII細胞中發(fā)現(xiàn)，GABA及GABAAR激動劑促進細胞增殖，上調細胞周期蛋白CyclinD1，促使細胞從G1期進入S期。而本文中流式細胞儀結果提示了，GABA，及GABAAR激動劑、拮抗劑主要干預了細胞G0/G1期及G2/M期，從而影響細胞周期進程。因此，可能在SGC-7901細胞中存在不同于KATIII細胞的細胞周期蛋白的調控。4結論本研究結果表明，GABA、GAD65及GABRP表達于人胃癌細胞株SGC-7901細胞，提示GABA可能以旁分泌或自分泌方式促進SGC-7901細胞增殖，擾亂細胞周期分布，加快細胞周期進程。參考文獻[1]WatanabeM.,MaemuraK,KanbaraK,etal.GABAandGABAreceptorsinthecentralnervoussystemandotherorgans[J].Int.Rev.Cytol,2002,213:1-47[2]WatanabeM,MaemuraK,KanbaraK,etal.GABAandGABAreceptorsinthecentralnervoussystemandotherorgans[J].IntRevCytol.,2002,213:1–47[3]MatuszekM,JesipowiczM,KleinrokZ.GABAcontentandGADactivityingastriccancer[J].Int.Med.J.Exp.Clin.Res,2001,7(3):377-381[4]LiY,LiuY,WangJ,etal.Effectofgamma-aminobutyricacidonmalignantphenotypesofhepatocellularcarcinomacelllineHepG-2[J].ZhongNanDaXueXueBaoYiXueBan.2009,34(8):752-6.[5]SchullerHM,Al-WadeiHA,MajidiM,etal.GABA(B)receptorisanoveldrugtargetforpancreaticcancer[J].Cancer,2008,112(4):767-778[6]JezewskaE,ScinskaA,KukwaW,etal.Gamma-aminobutyricacidconcentrationsinbenignparotidtumoursandunstimulatedparotidsaliva[J].JLaryngolOtol.2011,125(5):492-6.[7]RobertsSS,Mendonca-TorresMC,JensenK,et,al.GABAreceptorexpressioninbenignandmalignantthyroidtumors[J].PatholOncolRes.2009,15(4):645-50.[8]朱人敏，秦蘇堤，汪芳裕，等．人胃癌組織中γ-氨基丁酸含量及其受體和谷氨酸脫羧酶的表達[J]．中華消化雜志，2005，25(11):684-685[9]朱人敏，秦蘇堤，汪芳裕，等．高效液相色譜法測定人胃粘膜中γ-氨基丁酸和谷氨酸含量的[J]．世界華人消化雜志，2005，12(5):1210-1212[10]KentaroMaemura,Nanak