免疫組化與雜交組化課件

免疫組化與雜交組化免疫組化與雜交組化

免疫組化與雜交組化第一章理論基礎theoreticbasis

免疫組織化學和雜交組織化學是一門原位示蹤染色技術(shù)。學科交叉的產(chǎn)物。免疫組化與雜交組化理論基礎是基于利用放射性核素和其他標記物（熒光素，酶，重金屬離子等）作為示蹤劑，通過免疫親和（抗原-抗體特異性結(jié)合）和核酸雜交（堿基配對特異性連接）途徑，在組織切片或細胞涂片上，原位顯示生物大分子的動態(tài)變化而建立的一門染色技術(shù)。免疫組化與雜交組化

基本特點是“特異,靈敏，準確，形態(tài)、機能、代謝三位一體”，系分子病理學研究的常用手段。免疫組化與雜交組化學習的重點有四：

1.名詞概念；

2.技術(shù)原理；

3.操作要領；

4.結(jié)果判斷原則

（尤其是對照染色和假陽性假陰性的判別）。免疫組化與雜交組化第一節(jié)抗原1.抗原的概念凡能在機體內(nèi)引起體液免疫和/或細胞免疫反應的物質(zhì),稱為抗原。

免疫組化與雜交組化抗原主要具有兩方面的特性，抗原能引起機體產(chǎn)生抗體和/或致敏淋巴細胞，稱之為免疫原性；抗原還與相應的抗體及致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結(jié)合或反應，稱為免疫反應性。免疫組化與雜交組化有免疫原反應性而缺乏免疫原性的抗原稱為半抗原，半抗原與載體（通常是大分子物質(zhì)）結(jié)合，可變?yōu)槿乖?，載體不僅增加半抗原的大小，可在體內(nèi)激發(fā)免疫反應，而且還直接與免疫記憶有關(guān)。免疫組化與雜交組化2.抗原的化學結(jié)構(gòu)

一個天然抗原具有二種結(jié)構(gòu)，一是高分子的載體（抗原性）；二是抗原決定簇（特異性）。免疫組化與雜交組化

抗原決定簇（antigenicdeterminant）又稱抗原表位（epitope.)是指抗原分子上具有決定和控制抗原特異性的特殊化學基團,可與相應抗體或淋巴細胞抗原識別受體相結(jié)合的部位。大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原可有多個抗原決定簇,但由于空間位阻作用,在同一時間內(nèi)僅有部分抗原決定簇暴露和相應的抗體結(jié)合。免疫組化與雜交組化3.抗原的性質(zhì)及種類異性`大分子`特異為抗原的共同性質(zhì)，凡種系越遠`分子量越大`構(gòu)型越復雜`抗原決定簇暴露越多，則其抗原性越強，特異性越高?？乖奶禺愋允桥R床診斷`預防`治療的基礎。

免疫組化與雜交組化

抗原的類型繁多，分類方法也很多，故抗原的名稱各種各樣（表1-1-1）。

抗原有可溶和不溶性兩類，后者主要包括一些顆粒性抗原，如細胞`細胞器`某些病原體等。根據(jù)性質(zhì)，抗原又可分為：

免疫組化與雜交組化①結(jié)構(gòu)抗原，為組成細胞結(jié)構(gòu)的成分，如細胞骨架蛋白；②分泌抗原，為細胞所產(chǎn)生和分泌的酶`激素`粘液蛋白等；③沉淀抗原，如腎小球腎炎時，沉淀在腎小球基膜的免疫球蛋白`補體和免疫復合物等；④入侵抗原，主要指病原微生物。免疫組化與雜交組化4.抗原分離純化的一般原則

免疫組化方法檢測的抗原中，蛋白質(zhì)占了大多數(shù)，故此處敘述的一般原則以蛋白抗原為主要對象。

免疫組化與雜交組化⑴首先選擇和建立抗原的檢測方法目的是跟蹤監(jiān)測一系列提純過程中抗原是否存在，其含量和活性如何。方法有特異和非特異之分，前者利用抗原的特異反應，后者利用抗原已知的理化特性。免疫組化與雜交組化⑵選擇抗原含量高的組織為材料

組織中欲提抗原含量越高，提純也越容易，且得率越高。免疫組化與雜交組化⑶操作中應保持抗原分子的穩(wěn)定性

如低溫、嚴格pH、防止巰基氧化、在緩沖液中加入濃度1―3×10ˉ4M的EDTA（乙二胺四乙酸）以螯合除去重金屬離子、防止蛋白酶的水解作用，等等。免疫組化與雜交組化5.抗原分離純化的一般步驟

⑴增溶溶解

常用的方法有①滲透溶胞;②研磨;③絞切;④超聲波;⑤擠壓,等。⑵分離純化

原則是“先粗后細，先簡后繁，先鹽析后層析”。⑶抗原純度的鑒定方法有：瓊脂雙擴散、免疫電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、等電點聚焦電泳等。免疫組化與雜交組化6.常用的分離純化方法計有：⑴差別溶解法其中最常用的是鹽析法，又以中性鹽硫酸銨最為常用。免疫組化與雜交組化⑵層析法其中有①離子交換層析（DEAE、CM、QAE等）；②選擇性吸附層析，如羥基磷灰石可選擇性地吸附中性和酸性蛋白而排除鹼性蛋白；③分子篩層析（葡聚糖凝膠）；④親和層析。⑶制備電泳法如PAGE制備電泳的分離條帶切割等。免疫組化與雜交組化第二節(jié)抗體1.抗體的概念抗體（antibody）是機體通過體液免疫，由B淋巴細胞活化、增殖、分化的漿細胞合成并分泌與刺激抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。免疫組化與雜交組化抗體是免疫球蛋白，而免疫球蛋白不都具有抗體活性。兩者在概念上并不完全等同，抗體是生物學和功能上的命名，而Ig是結(jié)構(gòu)和化學本質(zhì)上的概念。免疫組化與雜交組化2.抗體的基本結(jié)構(gòu)①由于無抗體話性的Ig一般很少見，故抗體與Ig可認作為同義詞。人類Ig有五類，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，是由其分子結(jié)構(gòu)中相應的重鏈（H鏈）—α.δ.ξ.γ和μ決定的。重鏈不同，Ig的類型就不同。輕鏈（L鏈）則在同一抗體分子（Ig）中是相同的，或為κ，或為λ。免疫組化與雜交組化若輕鏈不同表明該Ig和抗體是雜系、多克隆的；反之，輕鏈單一、同型則表示該Ig或抗體是單克隆的。②Ig單體的基本結(jié)構(gòu)是由二條相同的輕鏈和二條相同的重鏈組成，各自鏈間（輕–重或重–重鏈）由二硫鍵（–S–S–）相連接，呈Y字構(gòu)型（圖解）免疫組化與雜交組化③Ig分子的氨基酸構(gòu)型可分為可變區(qū)（N-端）和恒定區(qū)（C-端）兩部份。⒊抗體的特性①Ig都是大分子蛋白質(zhì)，既具有免疫原性，又具有能與相應抗原結(jié)合的抗體活性。

免疫組化與雜交組化②免疫原性的類屬特異性是由Ig分子的重鏈和輕鏈恒定區(qū)特定的氨基酸序列所決定，而免疫原性的型屬特異性（獨特性或遺傳性idiotype）則是由重鏈和輕鏈可變區(qū)特定的氨基酸序列所決定?？贵w活性位點存在于Ig的可變區(qū)。免疫組化與雜交組化酶切所形成的片段――Fab或F（ab’）2只保持抗體活性，而無抗原活性；

Fc段主要由Ig兩條不完整的重鏈的恒定區(qū)序列構(gòu)成（-S-S-連接），只具抗原或免疫原活性，而無抗體活性。Ig結(jié)合補體或巨噬細胞的位點也存在于H-鏈的恒定區(qū)。免疫組化與雜交組化③Ig由B淋巴細胞衍生的漿細胞生成，主要以可溶性蛋白的形式存在于體液中。④Ig的主要生物學功能有：特異性結(jié)合抗原；活化補體；結(jié)合Fc受體等。⑤一個抗體（Ig）分子具有兩個結(jié)合位點（兩價）。免疫組化與雜交組化⒋抗體的種類⑴依來源分━①免疫抗體；②天然抗體；③自身抗體。⑵依反應分━①完全抗體；②不完全抗體。⑶依制劑或制備方法分——①多克隆抗體；②單克隆抗體；③基因工程抗體。免疫組化與雜交組化⒌抗體的制備

⑴抗血清（多克隆抗體——針對同一抗原多個抗原決定簇的抗體）的制備流程①免疫原（抗原或抗原+佐劑）準備。包括抗原的抽提、純化和劑量核算（1mg/ml）；佐劑乳化；半抗原的處理等。免疫組化與雜交組化*佐劑是一種非特異免疫增強劑，可增強免疫反應，提高抗體效價，常用福氏佐劑由85%石蠟油和15%羊毛脂組成（半佐劑），如加卡介苗(100ml佐劑中含卡介苗200mg）則為完全佐劑（FCA）。一般首次注射時用其1/2體積與等量抗原進行乳化。免疫組化與雜交組化第二次或第三次注射時用不完全佐劑或不用佐劑。判斷乳化是否充分，可將一滴乳化好的液體滴在水面上，如能長時間保持園珠形而不散開，表示乳化達到要求。免疫組化與雜交組化*半抗原的處理半抗原只有免疫反應性而無免疫原性，半抗原必須與大分子載體結(jié)合才能激發(fā)機體產(chǎn)生抗體，常用的載體有血蘭蛋白、卵白蛋白、牛血清白蛋白等。兩者交聯(lián)的方法和原理是：免疫組化與雜交組化利用-NH2，-COOH等功能基團，用戊二醛或碳化二亞胺（R′-N=C=N=R″）作為交聯(lián)劑可將半抗原結(jié)合到載體上，其結(jié)合比例為5KD結(jié)合5—25個分子的小肽，交聯(lián)完成后，還必須純化與載體結(jié)合的半抗原。免疫組化與雜交組化

②動物的選擇選擇什么動物來免疫取決于所需抗血清的量，小白鼠只能提供1.0-1.5ml的血液，而山羊卻能提供好幾升；其次看你有多少抗原用于免疫動物，小白鼠不到50微克就足夠，而山羊卻要幾毫克；免疫組化與雜交組化另外，還要考慮動物的品系，免疫動物與提供抗原的動物之間的種系差異越大越好，比如哺乳動物的比較保守的蛋白抗原可選擇非哺乳動物（雞）來制備抗體。常用的動物有兔、羊、馬、豬等，以兔（新西蘭兔，要求：年青，健壯，體重在2.5公斤左右，雄性）為最常用。免疫組化與雜交組化③免疫方法*途徑：可以肌肉、靜脈、皮內(nèi)、皮下或腹腔注射，一般以皮內(nèi)注射效果最好，多部位比單部位好，大動物一般不用腹腔注射，顆?？乖褪褂米魟r不能I.V.。另外還可用淋巴結(jié)內(nèi)注射來免疫，此法可大大減少抗原用量。免疫組化與雜交組化

*次數(shù)及間隔時間：次數(shù)一般為2-3次，首次注射后，10-15天再加強注射，劑量同首次或為首次的一半，用不全佐劑或不用佐劑；至于間隔時間，一般而言，動物越大，間隔越長，豚鼠、大鼠為7-8天；兔子為10-15天；羊為14-28天；有時第三次注射的間隔時間更長些，效果更好。免疫組化與雜交組化由于各動物之間的個體差異頗大，故應多免疫幾個動物從中選擇效價高的。*效價測定：常用的方法有“瓊脂免疫雙擴散、免疫電泳、ELISA、免疫組化”等方法。免疫組化與雜交組化*放血或定期抽血：兔子和羊是從頸動脈插管來放血，豚鼠和大鼠則可從心臟穿刺抽血，小鼠可采取眼球摘除來采血，雞往往從腋動脈取血。血液凝固后，及時離心收集血清。加疊氮鈉，分裝，低溫保存，也可加一定的保護劑如牛血清白蛋白、甘油等。免疫組化與雜交組化

⑵單克隆抗體（針對單一抗原決定簇的抗體）的制備流程——一般分六個步驟：①免疫動物

絕大多數(shù)McAb是用小鼠的免疫活性細胞與小鼠的骨髓瘤細胞融合而建立的雜交瘤細胞所產(chǎn)生的。一般用腹腔注射的途徑來免疫雄性BALB/c小鼠。免疫組化與雜交組化可溶性蛋白抗原的劑量，最低每次1μg，常用10-20μg/次，抗原充足時，可用到每次50μg，但不要超過每次200μg，總量不超過500μg；如抗原為細胞，每次用量為106個細胞，一般注射2-3次，取尾靜脈血測效價，用效價高的小鼠作細胞融合。免疫組化與雜交組化②細胞融合常用聚乙二醇（PEG）作融合劑，PEG分子量為1000-3000，常用1500，其濃度為50%（W/V），如用離心法融合，則用30%的PEG。融合時，骨髓榴細胞與小鼠脾細胞的比例在1：4-1：12之間，免疫后的小鼠脾贓約含5×107-2×108個淋巴細胞，每次融合需骨髓瘤細胞2×107，融合前培養(yǎng)細胞的密度2×105為宜。免疫組化與雜交組化③選擇培養(yǎng)常用HAT（次黃嘌呤-氨甲蝶呤-胸腺嘧啶核苷）培養(yǎng)液來進行選擇培養(yǎng)，其原理是HAT培養(yǎng)液抑制細胞正常途徑的DNA合成，由于骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK），不能進行補救途徑的DNA合成，在HAT培養(yǎng)液中正常途徑DNA合成被抑制后就無法生存；免疫組化與雜交組化脾細胞雖含有這兩種酶，在HAT培養(yǎng)液中能夠生存，但沒有致裂原和其它生長因子，脾細胞也不能分裂；只有脾細胞和骨髓瘤細胞融合后生成的雜交瘤細胞，既有這兩種酶又能無限制生長，在HAT培養(yǎng)液中可順利增殖。但經(jīng)選擇后生長的雜交榴可能是多克隆的，故必須進行克隆化。免疫組化與雜交組化④克隆化常用方法有軟瓊脂培養(yǎng)、有限稀釋法、顯微操作法。軟瓊脂培養(yǎng)就是將高度稀釋的雜交瘤細胞培養(yǎng)在低濃度的瓊脂中，單個細胞增生后可形成界限清楚的克隆，將單個克隆挑出進行再培養(yǎng)；免疫組化與雜交組化有限稀釋法，即將含一定數(shù)量細胞的懸液，經(jīng)多次倍比稀釋，直至于96孔培養(yǎng)板的每個孔可能只含一個細胞，再進行培養(yǎng)，但一次操作常不能達到目的，一般要重復三次以上；顯微鏡法是在顯微鏡下用微吸管吸出單個細胞進行培養(yǎng)。免疫組化與雜交組化

檢驗克隆化是否成功，判斷的方法是，當把一個產(chǎn)生所需抗體的陽性培養(yǎng)孔中的細胞經(jīng)有限稀釋移至于96孔板上生長時，若所有的孔都產(chǎn)生同樣的抗體，說明克隆化已經(jīng)完成；如部分孔分泌抗體，部分孔不分泌抗體，說明至少有兩個不同的克隆同時存在，還需進一步克隆化。免疫組化與雜交組化⑤抗體的檢測抗體檢測的目的是篩選分泌所需抗體的單克隆雜交瘤株，檢測的方法應事先建立。常用方法有ELASA法、放射免疫法和免疫組織化學法等。免疫組化與雜交組化⑥擴大培養(yǎng)有兩種途徑，一是體外培養(yǎng)，其優(yōu)點是可大量生產(chǎn)，缺點是培養(yǎng)上清液中單抗含量低，僅5-40μg/ml，而且培養(yǎng)液中常含血清，純化帶來麻煩，而且長期培養(yǎng)污染不易控制；免疫組化與雜交組化二是體內(nèi)方法，即在小鼠腹腔接種雜交瘤細胞，方法是先用石蠟油腹腔注射以刺激腹水產(chǎn)生，七天后，在腹腔中接種地107的細胞（細胞密度最好在2×107/ml）。體內(nèi)方法的優(yōu)點是單抗的濃度高，可達10mg/ml腹水，還可定期、持續(xù)抽取腹水，并不易污染，缺點是一旦小鼠死亡或患病，將一無所得。免疫組化與雜交組化

⑶基因工程抗體的特點和制備

基因工程抗體又稱重組抗體，它是在充分認識Ig基因結(jié)構(gòu)與功能基礎上，應用DNA重組技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，按照客觀需求在基因水平上對Ig分子進行切割、拼接或修飾，重新組裝成的新型抗體分子。特點是既保留了天然免疫抗體的特異性和主要生物學活性，并去除或減少了無關(guān)結(jié)構(gòu)。免疫組化與雜交組化6.抗體的純化抗體所在的抗血清、腹水或培養(yǎng)液中，其它成分甚多，如要標記抗體時，必須提純抗體，以免受雜蛋白的干擾。用不同的方法，可得到不同純度的抗體：中性鹽鹽析法只能得到粗的IgG；離子交換層析法（DEAE-52）可得到較純的IgG組分；免疫組化與雜交組化一般來說，抗體試劑的純度可按以下制劑順序逐步遞增：全血清或腹水-γ球蛋白-IgG（粗提-細提）-特異性抗體（免疫純IgG）-特異性抗體片段（Fab或F（ab′）2）。免疫組化與雜交組化葡萄球菌蛋白A（SPA）親和層析法可得到更純的IgG組分；而用抗原親和層析柱進行親和層析或用免疫沉淀法則可得到只針對該抗原的特異性IgG；如再將這特異性的IgG用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶進行酶解，則可得到特異性抗體的Fab段，葡萄球菌蛋白A（SPA）親和層析法可得到更純的IgG組分；而用抗原親和層析柱進行親和層析或用免疫沉淀法則可得到只針對該抗原的特異性IgG；如再將這特異性的IgG用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶進行酶解，則可得到特異性抗體的Fab片段。其中：免疫組化與雜交組化前者酶解產(chǎn)生二分子的Fab和一個完整的Fc段，后者酶解則產(chǎn)生一個F（ab′）2和Fc段的碎片。Fab的優(yōu)點是分子量小，易滲透，而且也可進行標記，同時因無Fc段，可消除抗體與具有Fc受體的無關(guān)細胞的結(jié)合，從而大大減少假陽性。免疫組化與雜交組化

⑶基因工程抗體的特點和制備

基因工程抗體又稱重組抗體，它是應用DNA重組技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)制備的抗體，特點是：①無種系異源性，不會誘發(fā)宿主的免疫反應；②能直接制備人源性的抗體；免疫組化與雜交組化③不僅保持鼠源性單抗的特異性和親和力等優(yōu)點，而且其免疫作用更強；④應用范圍加寬，使用途徑增多，針對性更強，可廣泛應用于免疫學研究和腫瘤的免疫基因治療；⑤可作為建立“抗體庫”的篩選試劑。免疫組化與雜交組化

*“

抗體庫（antibodicbank）”是指通過將某種生物體的所有抗體可變區(qū)基因克隆在質(zhì)?；蚴删w中表達，再利用不同的抗原與其反應，從而篩選出攜帶特異抗體基因的克隆，并由此而獲得相應的高親和力特異性抗體的一項基因工程技術(shù)。免疫組化與雜交組化第三節(jié)補體系統(tǒng)

⒈補體（complement）的概念

補體是一類存在于人和動物血清中具有酶活性、能與任何抗原抗體復合物發(fā)生結(jié)合反應的復合蛋白質(zhì)。免疫組化與雜交組化⒉補體的性質(zhì)補體由9個成分11種血清蛋白質(zhì)組成，即C1┄C9及C1q、C1r和C1s。C1q可通過兩種激活途徑即經(jīng)典激活途徑和旁路激活途徑，并按一定的補體激活順序呈現(xiàn)連鎖的酶促反應，最終成為一種化學介質(zhì)或免疫效應物質(zhì)參與機體的免疫病理過程。在免疫組化工作中，主要作為制備證明有無免疫復合物存在的橋連抗體示蹤試劑。免疫組化與雜交組化第四節(jié)核酸⒈核酸是組成一切生物細胞生命活性物質(zhì)的基本成分，由多個核苷酸分子連接而成，為此，核酸又叫多聚核苷酸。核酸是由堿基、戊糖和磷酸三種成分組成的大分子化合物，可分二大類：去氧核糖核酸（DNA）及核糖核酸（RNA）。

免疫組化與雜交組化⒉DNA

主要以雙股鏈存在于細胞核內(nèi)，其基本成分為堿基（A、G、T、C）、去氧戊（核）糖及磷酸。DNA的分子結(jié)構(gòu)有三級：一級結(jié)構(gòu)為長核苷酸單鏈；二級結(jié)構(gòu)為雙股核苷酸鏈組成的雙螺旋模型；三級結(jié)構(gòu)為超螺旋結(jié)構(gòu)。免疫組化與雜交組化DNA的復制和轉(zhuǎn)錄均是在其雙股鏈解聚成單鏈后，按照堿基互補規(guī)律（A-G，T-C，G-A，C-T或U-C，C-U）進行的。鏈間的氫鍵能量相對較低，體外高溫即可解鏈，這是核酸雜交的理論基礎。免疫組化與雜交組化⒊核糖核酸（RNA）

主要存在于細胞漿內(nèi)，以單鏈的形式存在，由堿基（A、G、U、C）、戊糖和磷酸分子所組成，依其功能可分為四類：轉(zhuǎn)運核糖核酸（tRNA）、信使核糖核酸（mRNA）、核蛋白體核糖核酸（rRNA）和小核核糖核酸（snRNA）。免疫組化與雜交組化①tRNA

在細胞內(nèi)含量居中，分子量較小，半衰期24h以上，細胞含量居中，是遺傳信息翻譯成蛋白質(zhì)合成語言（氨基酸）的執(zhí)行者，主要通過其反密碼子與mRNA的相應密碼子堿基配對，從而對模板mRNA攜帶