脂質(zhì)體脂膜結(jié)構(gòu)的測定 x射線小角散射檢測法編制說明

《脂質(zhì)體脂膜結(jié)構(gòu)的測定X射線小角散射檢測法》（征求意見稿）編制說明標(biāo)準(zhǔn)起草工作簡況任務(wù)來源根據(jù)《上海市標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會關(guān)于下達(dá)2023年度第二批團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制修訂項目計劃的通知》（滬標(biāo)協(xié)〔2023〕9號），上海市標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會下達(dá)了編制“脂質(zhì)體脂膜結(jié)構(gòu)的測定X射線小角散射檢測法”的項目計劃，由中國科學(xué)院上海高等研究院承擔(dān)該標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。目的與意義脂質(zhì)體是由磷脂或類磷脂分子自組裝形成的、具有雙分子層結(jié)構(gòu)的納米囊泡。因其具有體內(nèi)可降解、低免疫原性以及增加難溶性藥物溶解度等優(yōu)越性能，脂質(zhì)體在藥物遞送、基因治療、功效性護(hù)膚品等方面有著廣泛的應(yīng)用。我國對脂質(zhì)體遞送體系的研究起步相對較晚，但發(fā)展迅速，已有越來越多的企業(yè)及研發(fā)單位致力于脂質(zhì)體納米制劑的研究及工業(yè)化生產(chǎn)。對于脂質(zhì)體藥物，理解其處方和工藝制備方法所形成的特定結(jié)構(gòu)，以及結(jié)構(gòu)與藥物療效之間的構(gòu)效關(guān)系是脂質(zhì)體藥物研發(fā)及產(chǎn)品質(zhì)量控制的關(guān)鍵問題。例如，脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的差異會影響藥物的裝載率、體內(nèi)滯留時間以及藥物釋放速率。因此，在脂質(zhì)體藥物的特性分析和質(zhì)量研究中，除了常規(guī)的檢驗分析方法外，還需要結(jié)合先進(jìn)的分析技術(shù)，對脂質(zhì)體藥物的微觀結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性進(jìn)行深入探究。X射線小角散射（SAXS）技術(shù)是一種表征物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的有效手段，可從納米到微米尺度范圍內(nèi)獲取樣品全局結(jié)構(gòu)參數(shù)和形狀信息。利用SAXS技術(shù)可以定量表征脂質(zhì)體的脂膜結(jié)構(gòu)，得到脂質(zhì)雙分子層及其修飾磷脂層的厚度與分布。雖然SAXS技術(shù)暫未收載入各國藥典中，但近年來隨著新型納米藥物特性分析研究的不斷深入，在國家藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心發(fā)布的多個納米藥物產(chǎn)品研究技術(shù)指南中，均推薦及鼓勵生產(chǎn)企業(yè)采用SAXS方法進(jìn)行產(chǎn)品相關(guān)理化性質(zhì)表征及質(zhì)量控制研究。應(yīng)用SAXS技術(shù)可以獲得樣品體系內(nèi)結(jié)構(gòu)特征的統(tǒng)計平均值，測量結(jié)果具有相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性、可靠性及穩(wěn)定性。在研究和工業(yè)應(yīng)用方面，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織已發(fā)布了多個SAXS相關(guān)國際標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)容涉及粒度分布與濃度檢測等，但仍缺乏基于SAXS技術(shù)的脂質(zhì)納米藥物結(jié)構(gòu)檢測方面的標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)外針對脂質(zhì)體脂膜結(jié)構(gòu)測定的標(biāo)準(zhǔn)化的X射線小角散射檢測方法仍未建立，因此，亟需將該測試方法形成標(biāo)準(zhǔn)化的規(guī)范性文件，以確保檢測結(jié)果的可重復(fù)性和再現(xiàn)性。這對于脂質(zhì)體產(chǎn)品，特別是脂質(zhì)體藥物的研發(fā)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立，具有十分重要的意義。起草單位、起草人起草單位和參與單位本標(biāo)準(zhǔn)起草單位為中國科學(xué)院上海高等研究院。本標(biāo)準(zhǔn)協(xié)作單位包括：上海交通大學(xué)、中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所、上海師范大學(xué)、西南科技大學(xué)、中石化（北京）化工研究院有限公司、國家藥品監(jiān)督管理局疫苗及生物制品質(zhì)量監(jiān)測與評價重點實驗室、上海藥品評審核查中心、賽諾普（蘇州）科學(xué)儀器有限公司、安徽國科儀器科技有限公司、花安堂生物科技集團(tuán)有限公司。主要起草人及其所作工作如下：主要起草人有李怡雯、李娜、劉廣峰、宋攀奇、張建橋、李秀宏、滑文強(qiáng)、魏曉慧、門永鋒、鄒愛華、田強(qiáng)、唐毓婧、陸家海、葉宇翔、周一萌、宋良益、程薇、盧永杰。起草人員負(fù)責(zé)方法制定工作的組織、協(xié)調(diào)，相關(guān)資料的查詢、收集，試驗方法的確定、驗證，標(biāo)準(zhǔn)文本及編制說明的撰寫、修改。表1主要工作成員所負(fù)責(zé)的工作情況起草人工作職責(zé)李怡雯負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的編寫、檢測方法技術(shù)方案確定李娜負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的工作指導(dǎo)、組織協(xié)調(diào)劉廣峰、宋攀奇、張建橋負(fù)責(zé)技術(shù)方案優(yōu)化、驗證數(shù)據(jù)的收集魏曉慧、盧永杰負(fù)責(zé)樣品前處理條件的優(yōu)化李秀宏、門永鋒、鄒愛華、田強(qiáng)、唐毓婧、陸家海、葉宇翔、周一萌負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的工作指導(dǎo)、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化把關(guān)滑文強(qiáng)、宋良益、程薇負(fù)責(zé)方法驗證主要工作過程（1）標(biāo)準(zhǔn)編制項目于2023年8月獲得立項，成立標(biāo)準(zhǔn)編制工作組。（2）2023年9月至2023年10月，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的立項建議，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組查閱相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)等資料，在深入討論基礎(chǔ)上，形成了該標(biāo)準(zhǔn)檢測方法技術(shù)方案。（3）2023年11月至2024年3月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組按照項目擬定的技術(shù)方案，對樣品的前處理條件、檢測系統(tǒng)條件等進(jìn)行了優(yōu)化試驗工作。在國家蛋白科學(xué)研究（上海）設(shè)施BL19U2生物X射線小角散射線站上，使用符合本標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)方法，實現(xiàn)了脂質(zhì)體脂膜結(jié)構(gòu)的檢測。（4）2024年4月至2024年6月，開展了檢測方法的實驗室間協(xié)同驗證試驗，由國家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（上海）設(shè)施BL19U2生物X射線小角散射光束線站、上海光源BL16B1X射線小角散射光束線站、賽諾普（蘇州）科學(xué)儀器有限公司、安徽國科儀器科技有限公司4家單位/實驗裝置對該方法進(jìn)行了驗證。根據(jù)驗證結(jié)果和建議，對本標(biāo)準(zhǔn)檢測方法進(jìn)行完善。（5）2024年7月至2024年8月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組完成標(biāo)準(zhǔn)的征求意見稿和編制說明，并提交給上海市標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會。標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的編制原則本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草，主要遵循以下原則：（1）建立的標(biāo)準(zhǔn)分析方法具有科學(xué)性、先進(jìn)性和可操作性，易于推廣使用；（2）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容符合國家法律、法規(guī)的有關(guān)要求，未與已有標(biāo)準(zhǔn)沖突。確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了利用X射線小角散射技術(shù)測定脂質(zhì)體的脂膜結(jié)構(gòu)，包括脂質(zhì)雙分子層及其修飾層的厚度與分布。在按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》要求的基礎(chǔ)上，同時參考GB/T20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標(biāo)準(zhǔn)》的有關(guān)要求，確定了本標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容應(yīng)包括以下11個部分：范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、符號、方法原理、試樣的制備和要求、檢測系統(tǒng)和裝置、檢測步驟、檢測數(shù)據(jù)分析、檢測數(shù)據(jù)分析結(jié)果、檢測報告。方法的驗證情況基本情況為確保本標(biāo)準(zhǔn)的適用性、一致性、規(guī)范性和可操作性，標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組組織了4個實驗室/單位，包括國家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（上海）設(shè)施、上海光源、賽諾普（蘇州）科學(xué)儀器有限公司、安徽國科儀器科技有限公司，利用多臺同步輻射X射線小角散射裝置和實驗室X射線小角散射儀對脂質(zhì)體樣品進(jìn)行了方法驗證。驗證情況-1：國家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（上海）設(shè)施BL19U2生物X射線小角散射線站基本情況國家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（上海）設(shè)施BL19U2生物X射線小角散射線站完成本標(biāo)準(zhǔn)中檢測系統(tǒng)條件的優(yōu)化、分析方法的實現(xiàn)和檢測方法的驗證,所使用的樣品及檢測系統(tǒng)信息如下：測試樣品包括：鹽酸多柔比星脂質(zhì)體上市藥物Caelyx（產(chǎn)品批號：KHZUQ01）;相匹配的緩沖溶劑（含10%蔗糖與組氨酸）;與Caelyx成膜配方及制備方法相一致的空白脂質(zhì)體；山崳酸銀粉末（校準(zhǔn)樣品）。光源類型：同步輻射X射線光源實驗選取X射線波長：0.103nmX射線通量：1.0×1012photon?s-1樣品到探測器距離：2667mm探測器型號：Pilatus2M(Dectris)樣品池：石英玻璃毛細(xì)管，外徑1.0mm，壁厚0.01mm曝光時間：1s曝光次數(shù)：20驗證過程及結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述的試樣制備的濃度要求，對Caelyx測試樣品進(jìn)行濃度梯度檢測后，排除了該樣品原始濃度下粒子間的相互作用影響。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述的輔助性測試要求，采用動態(tài)光散射方法表征了Caelyx測試樣品的粒徑大小為90.3±1.5nm,多分散性指數(shù)為0.05±0.02。結(jié)合冷凍透射電鏡技術(shù)表征了Caelyx測試樣品的形貌，具體為單層脂質(zhì)體，其內(nèi)水相包封了藥物晶體。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述檢測系統(tǒng)與裝置要求，完成了X射線散射的光路優(yōu)化以及散射矢量的校準(zhǔn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述檢測步驟，完成測試樣品的散射數(shù)據(jù)采集。圖1檢測步驟流程圖（左）和測試樣品散射圖像（右）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述檢測數(shù)據(jù)分析步驟，完成測試樣品散射圖像中無效像素單元的剔除、一維散射強(qiáng)度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化、散射本底扣減等，得到脂質(zhì)體粒子的散射強(qiáng)度曲線。參考標(biāo)準(zhǔn)文件附錄A，選擇一種脂膜多層結(jié)構(gòu)模型，其電子密度分布函數(shù)為高斯函數(shù)表示。根據(jù)樣品結(jié)構(gòu)特點，構(gòu)建的多層結(jié)構(gòu)依次為偶聯(lián)于脂質(zhì)體脂質(zhì)雙分子層內(nèi)表面的PEG修飾層、脂質(zhì)體脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)層親水頭部、脂質(zhì)體脂質(zhì)雙分子層的疏水尾部、脂質(zhì)體脂質(zhì)雙分子層的外層親水頭部、偶聯(lián)于脂質(zhì)體脂質(zhì)雙分子層外表面的PEG修飾層。冷凍透射電鏡的表征結(jié)果顯示，該脂質(zhì)體內(nèi)水相所包封的藥物以束狀結(jié)構(gòu)的納米晶體沉淀形式存在。因此，可在脂膜多層結(jié)構(gòu)模型基礎(chǔ)上，另外構(gòu)建圓柱體形貌的藥物模型，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述的檢測數(shù)據(jù)分析步驟五，進(jìn)行擬合優(yōu)化求解，使得脂質(zhì)體粒子的實測散射強(qiáng)度與利用模型計算的理論散射強(qiáng)度之差總和最小。通過此優(yōu)化求解后的脂膜電子密度分布情況，參考現(xiàn)有技術(shù)，定義不同膜層的邊界位置為該層電子密度衰減至最大值的10%位置處，得到測試樣品的脂質(zhì)雙分子及其PEG修飾層的厚度與分布特征。圖2測試樣品的實驗散射強(qiáng)度及模型擬合散射強(qiáng)度曲線圖表2測試樣品結(jié)構(gòu)參數(shù)3.3驗證情況-2：上海光源BL16B1X射線小角散射光束線站3.3.1基本情況上海光源BL16B1X射線小角散射線站完成本標(biāo)準(zhǔn)中檢測方法的驗證,所使用的樣品及檢測系統(tǒng)信息如下：測試樣品包括：鹽酸多柔比星脂質(zhì)體上市藥物Caelyx（產(chǎn)品批號：KHZUQ01）;相匹配的緩沖溶劑（含10%蔗糖與組氨酸）;與Caelyx成膜配方及制備方法相一致的空白脂質(zhì)體；山崳酸銀粉末（校準(zhǔn)樣品）。光源類型：同步輻射X射線光源實驗選取X射線波長：0.124nmX射線通量：2.0×1011photon?s-1樣品到探測器距離：1900mm探測器型號：Pilatus2M(Dectris)樣品池：石英玻璃毛細(xì)管，外徑1.5mm，壁厚0.01mm曝光時間：60s曝光次數(shù)：33.3.2驗證過程及結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述檢測系統(tǒng)與裝置要求，完成了X射線散射的光路優(yōu)化以及散射矢量的校準(zhǔn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述檢測步驟，完成測試樣品的散射數(shù)據(jù)采集。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述檢測數(shù)據(jù)分析步驟，完成測試樣品散射圖像中無效像素單元的剔除、一維散射強(qiáng)度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化、散射本底扣減等，得到脂質(zhì)體粒子的散射強(qiáng)度曲線。參考標(biāo)準(zhǔn)文件附錄A，選擇一種脂膜多層結(jié)構(gòu)模型，并構(gòu)建圓柱體形貌的內(nèi)部包載藥物模型，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述的檢測數(shù)據(jù)分析步驟五，進(jìn)行擬合優(yōu)化求解，使得脂質(zhì)體粒子的實測散射強(qiáng)度與利用模型計算的理論散射強(qiáng)度之差總和最小。通過此優(yōu)化求解后的脂膜電子密度分布情況，參考現(xiàn)有技術(shù)，定義不同膜層的邊界位置為該層電子密度衰減至最大值的10%位置處，得到測試樣品的脂質(zhì)雙分子及其PEG修飾層的厚度與分布特征。圖3測試樣品的實驗散射強(qiáng)度及模型擬合散射強(qiáng)度曲線圖表3測試樣品結(jié)構(gòu)參數(shù)3.4驗證情況-3：賽諾普（蘇州）科學(xué)儀器有限公司3.4.1基本情況賽諾普（蘇州）科學(xué)儀器有限公司完成本標(biāo)準(zhǔn)中檢測方法的驗證,所使用的樣品及檢測系統(tǒng)信息如下：測試樣品包括：鹽酸多柔比星脂質(zhì)體上市藥物Caelyx（產(chǎn)品批號：KHZUQ01）;相匹配的緩沖溶劑（含10%蔗糖與組氨酸）;與Caelyx成膜配方及制備方法相一致的空白脂質(zhì)體；山崳酸銀粉末（校準(zhǔn)樣品）。光源類型：銅靶實驗選取X射線波長：0.154nmX射線通量：2.0×107photon?s-1樣品到探測器距離：600mm探測器型號：Eiger2R1M(Dectris)樣品池：石英玻璃毛細(xì)管，外徑1.5mm，壁厚0.01mm曝光時間：60min曝光次數(shù)：33.4.2驗證過程及結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述檢測系統(tǒng)與裝置要求，完成了X射線散射的光路優(yōu)化以及散射矢量的校準(zhǔn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述檢測步驟，完成測試樣品的散射數(shù)據(jù)采集。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述檢測數(shù)據(jù)分析步驟，完成測試樣品散射圖像中無效像素單元的剔除、一維散射強(qiáng)度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化、散射本底扣減等，得到脂質(zhì)體粒子的散射強(qiáng)度曲線。參考標(biāo)準(zhǔn)文件附錄A，選擇一種脂膜多層結(jié)構(gòu)模型，并構(gòu)建圓柱體形貌的內(nèi)部包載藥物模型，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述的檢測數(shù)據(jù)分析步驟五，進(jìn)行擬合優(yōu)化求解，使得脂質(zhì)體粒子的實測散射強(qiáng)度與利用模型計算的理論散射強(qiáng)度之差總和最小。通過此優(yōu)化求解后的脂膜電子密度分布情況，參考現(xiàn)有技術(shù)，定義不同膜層的邊界位置為該層電子密度衰減至最大值的10%位置處，得到測試樣品的脂質(zhì)雙分子及其PEG修飾層的厚度與分布特征。圖4測試樣品的實驗散射強(qiáng)度及模型擬合散射強(qiáng)度曲線圖

表4測試樣品結(jié)構(gòu)參數(shù)3.5驗證情況-4：安徽國科儀器科技有限公司3.5.1基本情況安徽國科儀器科技有限公司完成本標(biāo)準(zhǔn)中檢測方法的驗證,所使用的樣品及檢測系統(tǒng)信息如下：測試樣品包括：鹽酸多柔比星脂質(zhì)體上市藥物Caelyx（產(chǎn)品批號：KHZUQ01）;相匹配的緩沖溶劑（含10%蔗糖與組氨酸）;與Caelyx成膜配方及制備方法相一致的空白脂質(zhì)體；山崳酸銀粉末（校準(zhǔn)樣品）。光源類型：銅靶實驗選取X射線波長：0.154nmX射線通量：2.0×107photon?s-1樣品到探測器距離：600mm探測器型號：Eiger2R1M(Dectris)樣品池：石英玻璃毛細(xì)管，外徑1.5mm，壁厚0.01mm曝光時間：60min曝光次數(shù)：33.5.2驗證過程及結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述檢測系統(tǒng)與裝置要求，完成了X射線散射的光路優(yōu)化以及散射矢量的校準(zhǔn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述檢測步驟，完成測試樣品的散射數(shù)據(jù)采集。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述檢測數(shù)據(jù)分析步驟，完成測試樣品散射圖像中無效像素單元的剔除、一維散射強(qiáng)度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化、散射本底扣減等，得到脂質(zhì)體粒子的散射強(qiáng)度曲線。參考標(biāo)準(zhǔn)文件附錄A，選擇一種脂膜多層結(jié)構(gòu)模型，并構(gòu)建圓柱體形貌的內(nèi)部包載藥物模型，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文件描述的檢測數(shù)據(jù)分析步驟五，進(jìn)行擬合優(yōu)化求解，使得脂質(zhì)體粒子的實測散射強(qiáng)度與利用模型計算的理論散射強(qiáng)度之差總和最小。通過此優(yōu)化求解后的脂膜電子密度分布情況，參考現(xiàn)有技術(shù)，定義不同膜層的邊界位置為該層電子密度衰減至最大值的10%位置處，得到測試樣品的脂質(zhì)雙分子及其PEG修飾層的厚度與分布特征。圖5測試樣品的