基因工程講義

PAGEPAGEIII基因工程講義目錄第一章緒

論………………3一、基因工程的誕生………………3二、基因工程的成就………………5三、基因工程安全性的問(wèn)題…………6四、基因工程研究的內(nèi)容………… 8第二章基因克隆所需的工具酶…………… 12一、限制性?xún)?nèi)切酶(restrictionenzyme)……………… 12二、DNA連接酶……………………20三、DNA聚合酶……………………24四、逆轉(zhuǎn)錄酶……… 27第三章基因的克隆載體

…… 28一、質(zhì)粒載體……… 28二、大腸桿菌質(zhì)粒載體…………… 30三、λ噬菌體載體……………………33四、粘粒載體（柯斯質(zhì)粒載體）…… 35第四章目的基因的分離克隆

……………… 38第一節(jié)化學(xué)法合成目的基因………… 38第二節(jié)

PCR技術(shù)在基因克隆中的應(yīng)用……………… 38一、PCR基本技術(shù)………………… 38二、PCR技術(shù)在基因克隆方面的應(yīng)用……………… 42第三節(jié)基因文庫(kù)技術(shù)分離目的基因…………………45一、

基因文庫(kù)的類(lèi)別…………………46二、核基因組文庫(kù)構(gòu)建……………… 48三、利用PCR技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫(kù)…………………49四、應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法構(gòu)建cDNA文庫(kù)…… 49五、人工染色體文庫(kù)………………… 50第五章重組體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及鑒定………… 54一、質(zhì)粒DNA的分離純化………… 54二、目的基因與載體的連接………… 54三、重組體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入……… 54四、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌菌落的鑒定……56第六章克隆基因的表達(dá)……… 59第一節(jié)

外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)……………… 60一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)……… 60二、基因表達(dá)的調(diào)控序列…………… 61三、幾種類(lèi)型的原核表達(dá)載體……… 62四、提高克隆基因表達(dá)效率的途徑………………… 63第二節(jié)

外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)……………… 68一、真核細(xì)胞基因克隆載體………… 68外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法…………………72第七章重組體的篩選與鑒定…………………76一、遺傳檢測(cè)法…………………… 76二、物理檢測(cè)法…………………… 78三、核酸雜交篩選法…………………79四、免疫化學(xué)檢測(cè)法………………… 80五、DNA—蛋白質(zhì)篩選法…………… 81《基因工程》課程教學(xué)大綱適用專(zhuān)業(yè)生物科學(xué)，生物技術(shù)預(yù)修課程普通生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)一、編寫(xiě)說(shuō)明（一）本課程的性質(zhì)、地位和作用自本世紀(jì)70年代基因工程誕生以來(lái)，在不到30年的時(shí)間內(nèi)，已取得許多激動(dòng)人心的成就，并繼續(xù)向前迅猛發(fā)展，成為當(dāng)今生物科學(xué)研究領(lǐng)域中最具生命力、最引人注目的前沿學(xué)科之一?；蚬こ虒W(xué)的出現(xiàn)，給社會(huì)發(fā)展帶來(lái)了深刻的影響。許多國(guó)家都已把基因工程列為優(yōu)先發(fā)展的高科技項(xiàng)目。本課程主要介紹基因操作的主要技術(shù)原理，基因操作的工具酶，克隆載體，目的基因的分離方法，重組體的構(gòu)建及導(dǎo)入，克隆基因的表達(dá)與檢測(cè)，基因工程研究進(jìn)展，存在問(wèn)題及新策略等內(nèi)容，使學(xué)生具備基因工程方面的基本知識(shí)和掌握基因工程基本的操作技術(shù)。（二）本大綱制訂的依據(jù)基因工程是生物學(xué)科中的高級(jí)課程，主要針對(duì)高年級(jí)本科生和研究生開(kāi)設(shè)。學(xué)生在此之前需要掌握普通生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等方面的專(zhuān)業(yè)知識(shí)，以及分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、無(wú)機(jī)化學(xué)、大學(xué)物理等方面的基本知識(shí)。（三）大綱內(nèi)容選編原則和要求（四）實(shí)踐環(huán)節(jié)（六）考核方法與要求⒈平時(shí)成績(jī)：0%⒉實(shí)驗(yàn)成績(jī)：0%⒊試卷成績(jī)：100%，⒋綜合考核成績(jī)（七）教材與主要參考書(shū)教材：自編講義主要參考書(shū)：1.基因工程，邱澤生，首都師范大學(xué)出版社，19922.基因工程原理（上下冊(cè)），吳乃虎，科學(xué)出版社，20013.植物基因工程，王關(guān)林，方宏筠，科學(xué)出版社，19994.基因工程學(xué)原理，馬建崗，西安交通大學(xué)出版社，2001

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論

在研究生物演化的過(guò)程中，遺傳和變異是兩個(gè)重要的概念。遺傳性賦予生物種的穩(wěn)定，保證生物種的延續(xù)不斷。變異性賦于生物種的進(jìn)化，保證生物種對(duì)各種環(huán)境的適應(yīng)。在生物演變的長(zhǎng)河中，自然發(fā)生的變異是非常緩慢的，隨著生物科學(xué)的發(fā)展，人類(lèi)開(kāi)始學(xué)會(huì)干預(yù)生物的變異，經(jīng)典遺傳學(xué)的出現(xiàn)，使人們?cè)趲啄曛翈资陜?nèi)便可實(shí)現(xiàn)在自然界中需要千百萬(wàn)年才能出現(xiàn)的變異．從而改變了某些物種，有利于人類(lèi)。從本世紀(jì)70年代初，基因工程學(xué)誕生，在短短不過(guò)30年的時(shí)間內(nèi)已經(jīng)取得了許多激動(dòng)人心的成果。它的最大特點(diǎn)，就是以重組DNA的技術(shù)，開(kāi)辟了在短時(shí)間內(nèi)改造生物遺傳性的新天地。它填補(bǔ)了生物種屬間不可逾越的鴻溝，克服了常規(guī)育種的盲目性，使人類(lèi)有可能按照需要定向培育生物新品種、新類(lèi)型乃至創(chuàng)造自然界從未有過(guò)的新生物。目前，基因工程正以新的勢(shì)頭迅猛發(fā)展，成為當(dāng)今生物科學(xué)研究領(lǐng)域中最有生命力、最引人注目的前沿科學(xué)之一。

一、基因工程的誕生(一)基因工程的誕生基因工程誕生于1973年，它是數(shù)十年來(lái)無(wú)數(shù)科學(xué)家辛勤勞動(dòng)的成果、智慧的結(jié)晶。從40年代開(kāi)始，科學(xué)家們從理論和技術(shù)兩方面為基因工程的產(chǎn)生奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。概括起來(lái)，從40年代到70年代初的基因工程誕生，在現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域理論上的三大發(fā)現(xiàn)及技術(shù)上的三大發(fā)明對(duì)基因工程的誕生起到了決定性的作用：1．理論上的三大發(fā)現(xiàn)（1）40年代發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì)是DNA。l934年，Avery在美國(guó)的一次學(xué)術(shù)會(huì)上首次報(bào)道了著名的肺炎球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。超越時(shí)代的科學(xué)成就，往往不容易很快被人接受，Avery的論文沒(méi)有得到公認(rèn)。事隔十年，這一成果才得以公開(kāi)發(fā)表。事實(shí)上，Avery不僅證明DNA是生物的遺傳物質(zhì)，而且也證明了DNA可以把一個(gè)細(xì)菌的性狀轉(zhuǎn)給另一個(gè)細(xì)菌，理論意義十分重大。正如諾貝爾獎(jiǎng)金獲得者Lede-rbevg指出的，Avery的工作是現(xiàn)代生物科學(xué)的革命開(kāi)端，也可以說(shuō)是基因工程的先導(dǎo)。（2）50年代搞清楚了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理。1953年，Walson和Crick提出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。對(duì)生命科學(xué)的發(fā)展，足以和達(dá)爾文學(xué)說(shuō)、盂德?tīng)柖上嗵岵⒄摗?/p>

（3）60年代確定了遺傳信息的傳遞方式。確定遺傳信息是以密碼方式傳遞的，每三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子，代表一個(gè)氨基酸。到了1966年，破譯了64個(gè)密碼子，編排了一本密碼字典，敘述了中心法則。從此，千百年來(lái)神秘的遺傳現(xiàn)象，在分子水平上得到了揭示。2．技術(shù)上的三大發(fā)明

（1）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

從40年代到60年代，雖然從理論上已經(jīng)確立了基因工程的可能性，科學(xué)家們也為基因工程設(shè)計(jì)了一幅美好的藍(lán)圖。但是，科學(xué)家們面對(duì)著龐大的雙鏈DNA(dsDNA)，尤其是真核生物，其DNA分子是相當(dāng)巨大的，仍然是束手無(wú)策，不能把它切成單個(gè)的基因片段。盡管那時(shí)酶學(xué)知識(shí)已得到相當(dāng)?shù)陌l(fā)展，但沒(méi)有任何一種酶能對(duì)DNA進(jìn)行有效的切割。直到1970年，Smith和wilcox在流感嗜血桿菌中分離并純化了限制性核酸內(nèi)切酶HindIII，使DNA分子的切割成為可能。1972年Boyer實(shí)驗(yàn)室又發(fā)現(xiàn)了名叫EcoRI的核酸內(nèi)切酶，這種酶每遇到GAATTC序列，就會(huì)將雙鏈DNA分子切開(kāi)形成DNA片段。以后，又相繼發(fā)現(xiàn)了大量類(lèi)似于EeoRI這樣的限制性核酸內(nèi)切酶，這就使研究者可以獲得所需的DNA特殊片段，為基因工程提供了技術(shù)基礎(chǔ)。（2）

對(duì)基因工程技術(shù)的突破的另一發(fā)現(xiàn)是DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)1967年，世界上有五個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶。這種酶能夠參與DNA缺口的修復(fù)。1970年，美國(guó)的Khorana實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了一種叫T4DNA連接酶，具有更高的連接活性。

（3）基因工程載體的發(fā)現(xiàn)科學(xué)家有了對(duì)DNA切割與連接的工具(酶)，還不能完成DNA體外重組的工作。因?yàn)榇蠖鄶?shù)DNA片段不具備自我復(fù)制的能力。所以，為了能夠在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖，必須將DNA片段連接到一種特定的、具有自我復(fù)制的DNA分子上。這種DNA分子就是基因工程載體(Vector)?；蚬こ痰妮d體研究先于限制性核酸內(nèi)切酶。從1946年起，Lederberg開(kāi)始研究細(xì)菌的性因子～F因子，經(jīng)過(guò)50和60年代，相繼發(fā)現(xiàn)其它質(zhì)粒，如抗藥性因子(R因子)，大腸桿菌素因子(CoE)。到1973年，Cohen將質(zhì)粒作為基因工程的載體使用。

具備了以上的理論與技術(shù)基礎(chǔ)，基因工程誕生的條件已經(jīng)成熟。兩位科學(xué)的“助產(chǎn)士’——Berg和Cohen把基因工程接到了人間。．1972年，美國(guó)斯坦福大學(xué)的P．Berg領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，在世界上第一次成功地實(shí)現(xiàn)了DNA體外重組。他們使用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI，在體外對(duì)猿猴病毒SV40的DNA和λ噬菌體的DNA分別進(jìn)行酶切，然后再用T4DNA連接酶把兩種酶切的DNA片段連接起來(lái)，結(jié)果獲得了包含有SV40和λDNA重組的雜種DNA分子。（基因工程的雛形）1973年，斯坦福大學(xué)的S．Cohen等人，也成功地進(jìn)行了另一個(gè)體外重組實(shí)驗(yàn)并實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌間性狀的轉(zhuǎn)移。他們將大腸桿菌(E．Coli)的抗四環(huán)素(TCr)質(zhì)粒PSCl01和抗新霉索(Ner)及抗磺胺(Sr)的質(zhì)粒R6一3，在體外用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI切割，連接成新的重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。結(jié)果在含四環(huán)素和新霉素的平板中，選出了抗四環(huán)素和抗新霉素的重組菌落這是基因工程發(fā)展史上第一次實(shí)現(xiàn)重組體轉(zhuǎn)化成功的例子?；蚬こ虖拇苏Q生，這一年被定為基因工程誕生的元年。

二、基因工程的成就

基因工程是一門(mén)創(chuàng)造性的科學(xué)，有著驚人的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景?；蚬こ陶Q生30年來(lái)，已經(jīng)帶來(lái)了一批突破性的成果，有些已在人們的生產(chǎn)和生活中作出了重大貢獻(xiàn)?；蚬こ虖?977年起出現(xiàn)了飛躍的發(fā)展。在這一年中，遺傳工程取得了一項(xiàng)震撼人心的重要成果。例如：（1）Itakara等使化學(xué)合成的激素抑制素基因與大腸桿菌β一半乳糖(苷)酶基因和PBR322質(zhì)粒重組到一起，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，結(jié)果產(chǎn)生出含激素抑制素的嵌合型蛋白質(zhì)，經(jīng)溴化氰處理后，有活性的激素抑制素便釋放出來(lái)。這是真核生物的人造基因首次在原核生物中表達(dá)，這一成果的取得大大增強(qiáng)了人們對(duì)遺傳工程的興趣和信心。他們用價(jià)值幾美元的9升培養(yǎng)液生產(chǎn)出50毫克的生物活性物質(zhì)，相當(dāng)于50萬(wàn)頭羊腦的提取量，意義非常重大。

（2）1978年，Goedd．1等使化學(xué)合成的人胰島素基因在大腸桿菌中表達(dá)，他們將人胰島索兩條肽鏈的基因引入到大腸軒菌，培養(yǎng)后大腸桿菌產(chǎn)生了人胰島素的A鏈和B鏈，經(jīng)二硫鍵連接后形成人胰島索分子。有人估計(jì)，全世界約有六千萬(wàn)名糖尿病患者，用豬和牛的胰臟提取的胰島素已經(jīng)不能滿(mǎn)足他們的需要。因此，人胰島素基因在大腸桿菌中表達(dá)成功，使胰島素的人工大量合成成為可能，為廣大的糖尿病患者帶來(lái)了福音。（3）1979年，Gooddel等使人生長(zhǎng)激素基因在大腸桿菌中表達(dá)成功。人生長(zhǎng)激素由191個(gè)氨基酸組成，能促進(jìn)幾童生長(zhǎng)，治療侏儒癥。醫(yī)用人生長(zhǎng)激素是從人尸體的腦下垂體分離獲得的，來(lái)源極為有限。遺傳工程菌能產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素，為這種激素開(kāi)辟了廣闊的來(lái)源。（4）1980年，Nagata等使干擾素基因在大腸桿菌中表達(dá)成功。干擾素具有抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能的作用。用遺傳工程菌大量生產(chǎn)干擾素，獲得成功，使大規(guī)模臨床試驗(yàn)成為可能。此外，日本的科技人員使大豆的遺傳基因插入大腸桿菌的質(zhì)粒中，人工合成大豆蛋白獲得成功。美國(guó)Abbott公司用基因工程方法使大腸桿菌產(chǎn)生出人體尿激酶。（5）1981年，從遺傳工程菌獲得的新產(chǎn)物有動(dòng)物口蹄疫疫苗，乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原以及牛生長(zhǎng)激素等。上述產(chǎn)物的獲得，對(duì)人乙型肝炎的診斷和防治，飼養(yǎng)動(dòng)物的口蹄疫防治以及提高牛肉牛奶的產(chǎn)量具有重要意義。我國(guó)乙型肝炎病毒(HBV)基因工程研究工作自1983年開(kāi)始。上海生化所，中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院以及上海生物制品所等許多單位相繼開(kāi)展了HBV的分子克隆和DNA全序列測(cè)定、基因定位等理論工作。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院還用E．coli生產(chǎn)HBcAg作為肝炎的診斷試劑出售。但一般來(lái)說(shuō)，表達(dá)的水平都不太高?？梢灶A(yù)料，用基因工程疫苗治療乙肝的日子已為期不遠(yuǎn)。三、基因工程安全性的問(wèn)題從基因工程誕生之日起，受到人類(lèi)的極大關(guān)注。其理論和實(shí)踐的意義都非常重大，但和任何新生事物一樣，其成長(zhǎng)過(guò)程中也遇到了強(qiáng)大的阻力?；蚬こ虅傉Q生的頭幾年，人們對(duì)它有不少爭(zhēng)論。舉幾個(gè)簡(jiǎn)單的例子：1．人們擔(dān)心“基因逃逸”問(wèn)題，由于微生物之間通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、接合進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移?！坝泻Α被蚴欠駮?huì)逃逸到人體或環(huán)境中?？茖W(xué)家們經(jīng)常使用大腸桿菌作為宿主菌。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，人們擔(dān)心大腸桿菌會(huì)通過(guò)研究者的消化道帶出實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)過(guò)連續(xù)兩年對(duì)研究人員的糞便檢查，均未發(fā)現(xiàn)大腸桿菌和質(zhì)粒。2．前段時(shí)間英國(guó)“多莉”的死亡。希特勒。美國(guó)科幻電影。3．對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的安全性的問(wèn)題。隨著全球人口增多，糧食緊張的問(wèn)題日益嚴(yán)重。許多生物學(xué)家致力于高產(chǎn)、高質(zhì)的農(nóng)作物。提高農(nóng)作物產(chǎn)量的方法主要有2方面：一方面發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)農(nóng)作物（不大可能）；另一方面減少農(nóng)作物生長(zhǎng)中的損失（旱、澇、病毒、蟲(chóng)，腐爛等）。目前，植物基因工程方面使用技術(shù)就是從其他物種上分離有效的基因，然后轉(zhuǎn)移到農(nóng)作物上（例如：現(xiàn)在已有的，抗蟲(chóng)棉，水稻，土豆，西紅柿，大豆，玉米等）?，F(xiàn)在產(chǎn)生的問(wèn)題是，安全性問(wèn)題。特別是人們將大量的食用轉(zhuǎn)基因食品，其安全性問(wèn)題應(yīng)該引起高度重視和科學(xué)地評(píng)價(jià)，確保人民健康，才能使基因工程順利發(fā)展。轉(zhuǎn)基因植物食品的安全性主要包括2方面：（1）

轉(zhuǎn)基因植物食品有無(wú)毒性物質(zhì)及有無(wú)過(guò)敏性蛋白。①

目的基因編碼已知的過(guò)敏蛋白；（2）食品安全性中的另一個(gè)重要問(wèn)題是標(biāo)記基因的安全性評(píng)價(jià)。nptⅡ(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)、hpt(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)、gent(乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)及抗除莠劑的基因在轉(zhuǎn)基因植物中得到高表達(dá)，人們食用大量轉(zhuǎn)基因食品是否可能對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性。4．基因工程與生態(tài)環(huán)境平衡轉(zhuǎn)基因作物栽到大田后，會(huì)不會(huì)和野生親緣植物自然雜交，導(dǎo)致野生親緣植物獲得抗性，從而影響環(huán)境。而導(dǎo)致產(chǎn)生新的雜草類(lèi)型。如除草劑對(duì)已俘獲了抗除草劑基因的雜草不再具備除草性能；抗蟲(chóng)基因的俘獲也許會(huì)導(dǎo)致害蟲(chóng)種類(lèi)交替進(jìn)化；這些都迫使人們使用更危險(xiǎn)的化學(xué)藥物。可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因植物的大規(guī)模種植可能會(huì)群落帶來(lái)極大的不利。群落的影響不但難以預(yù)料，甚至可能產(chǎn)生更嚴(yán)重的后果；俘獲了毒蛋白基因會(huì)由于食草動(dòng)物難以傷害它而加劇繁衍蔓延，稀有植物品種也許會(huì)由于競(jìng)爭(zhēng)，同種植物的遺傳多樣性便會(huì)減少，昆蟲(chóng)群落也會(huì)受到影響。從以上例子可以看出，基因工程是個(gè)雙刃劍，于是許多社會(huì)人士、政府官員、甚至科學(xué)家發(fā)出呼吁，要求制定法規(guī)，限制基因工程的研究。近年來(lái)關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物的安全性問(wèn)題引起世界性的爭(zhēng)論，眾說(shuō)風(fēng)云，更激起各國(guó)的重視投入大量人力、物力進(jìn)行科學(xué)地研究，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)成立了一個(gè)專(zhuān)門(mén)委員會(huì)處理這些訴頌事宜，并于1975年制定了“通用重組DNA分子研究準(zhǔn)則”，盡管已經(jīng)對(duì)基因工程的安全防護(hù)作了許多規(guī)定，仍有不少科學(xué)家聯(lián)名要求取消危險(xiǎn)的實(shí)驗(yàn)。對(duì)基因工程爭(zhēng)論的焦點(diǎn)是害怕基因工程創(chuàng)造的雜種生物會(huì)從實(shí)驗(yàn)室逸出，在自然界造成難以控制的危害。有害的雜種細(xì)菌或病毒與化學(xué)物質(zhì)不同，它們會(huì)在自然界不斷增殖，造成的危害更大。

研究結(jié)果表明，從本質(zhì)上講轉(zhuǎn)基因植物與常規(guī)育種是一樣的。兩者都是在原有的基礎(chǔ)上對(duì)現(xiàn)有品種的某些性狀進(jìn)行修飾，或增加新性狀，或者消除不良性狀，最后培育出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和抗病、抗逆的新品種，它們的區(qū)別只是技術(shù)和方法問(wèn)題。基因工程只是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)進(jìn)行單基因或多個(gè)基因的轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)了育種的目的性和可操作性I縮短了育種周期，應(yīng)該說(shuō)是更科學(xué)和更安全。例如在常規(guī)育種時(shí)，父母本的不良基因、甚至是有害基因都傳遞給下一代?；蚬こ逃N只是把好的基因、有用的基因傳遞給下一代，使下一代不斷優(yōu)化。關(guān)于目的基因的結(jié)構(gòu)與功能應(yīng)該進(jìn)行嚴(yán)格科學(xué)地研究和選擇，堵截有害基因的使用就可以避免上述安全性的疑慮。四、基因工程研究的內(nèi)容1．定義基因工程產(chǎn)生以來(lái)，還沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的公認(rèn)定義。一般認(rèn)為基因工程是指：把體外核酸分子(無(wú)論采取什么方法從細(xì)胞中取得)組合到任何病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體系統(tǒng)(分子)，形成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之進(jìn)入到原來(lái)沒(méi)有這類(lèi)分子的宿主體內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖?；蛘哒f(shuō)，它是對(duì)DNA大分子上的遺傳單元(基因)進(jìn)行體外操作，把不同來(lái)源的基因按照設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，重新構(gòu)成新的基因組(即重組體)，再把它引入細(xì)胞中，構(gòu)成具有新的遺傳特性的生物。

從上面定義可以看出基因工程的一個(gè)重要特征，就是強(qiáng)調(diào)了外源DNA分子的新組合被引入到一種新的寄主生物中進(jìn)行繁殖。這種DNA分子的新組合是按照工程學(xué)的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)和操作的。這就賦于基因工程跨越天然物種屏障的能力，克服了固有的生物種間的限制，擴(kuò)大和帶來(lái)了定向創(chuàng)造新生物的可能性，這是基因工程的最大特點(diǎn)?；蚬こ虇?wèn)世以來(lái)，各種相關(guān)的名稱(chēng)相繼問(wèn)世。在文獻(xiàn)中常見(jiàn)的有遺傳工程(Geneticemgineering)、基因工程(Geneengineering)，基因操作(Genemanipulation)、重組DNA技術(shù)(RecombianantDNAtechnique)、分子克隆(Molecularcloning)、基因克隆(Genecloning)等，這些術(shù)語(yǔ)所代表的具體內(nèi)容彼此具有相關(guān)性，在許多場(chǎng)合下被混同使用，難以嚴(yán)格區(qū)分。不過(guò)它們之間還是存在一定的區(qū)別的。例如，遺傳工程比基因工程有更廣泛的內(nèi)容，凡是人工改造生物遺傳性的技術(shù)如物理化學(xué)誘變、細(xì)胞融合、花粉培育、常規(guī)育種、有性雜交等，還包括基因工程在內(nèi)。因此，遺傳工程包括基因工程，遺傳工程不等于基因工程。又如重組DNA技術(shù)，它是基因工程的核心內(nèi)容，但嚴(yán)格地說(shuō)，基因工程除上述的定義所闡明的內(nèi)容以外，還應(yīng)包括體外DNA突變，體內(nèi)基因操作以及基因的化學(xué)合成等?？傊?，凡是在基因水平上操作而改變生物遺傳性的技術(shù)都屬于基因工程。而重組DNA技術(shù)不等于就代表基因工程。

至于生物工程，它是更大范圍內(nèi)改造生物并生產(chǎn)生物產(chǎn)品的工程技術(shù)，是現(xiàn)代生物學(xué)中一切工程技術(shù)的總稱(chēng)，除遺傳工程、基因工程外，還有酶學(xué)工程，細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、農(nóng)業(yè)工程等。

克隆(Clone)一詞有必要加以解釋。當(dāng)它作為名詞使用時(shí)，是指從一個(gè)祖先通過(guò)無(wú)性繁殖方式產(chǎn)生的后代，或具有相同遺傳性狀的DNA分子、細(xì)胞或個(gè)體所組成的特殊的生命群體。當(dāng)克隆作動(dòng)詞使用時(shí)，是指從同一祖先生產(chǎn)這類(lèi)同一的DNA分子群或細(xì)胞群的過(guò)程。因此，基因工程也可稱(chēng)為基因克隆或DNA分子克隆。2．基因工程研究的內(nèi)容包括以下幾個(gè)主要內(nèi)容或步驟(1)從生物有機(jī)體復(fù)雜的基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。(2)在體外，將帶有目的基因的DNA片段連接到能夠自我復(fù)制并具有選擇標(biāo)記的載體分子上，形成重組DNA分子。

(3)將重組DNA分子引入到受體細(xì)胞(亦稱(chēng)宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞)。(4)帶有重組體的細(xì)胞擴(kuò)增，獲得大量的細(xì)胞繁殖群體(菌落)。(5)從大量的細(xì)胞繁殖菌落中，篩選出具有重組DNA分子的細(xì)胞克隆。(6)將選出的細(xì)胞克隆的目的基因進(jìn)行進(jìn)一步研究分析；(7)將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類(lèi)所需要的物質(zhì)。

表1

重組DNA技術(shù)發(fā)展史的某些重要事件

年份

重

要

事

件1869

F．Miescher首次從萊茵河鮭魚(yú)精子中分離到DNA1944

0．T．Avery等人在肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)遺傳信息的攜帶者是DNA而不是蛋白質(zhì)1953

J．D．Watson和F．H．C．Crick在R．Franklin和M．Wilkins的x一射線工作的基礎(chǔ)上提出了關(guān)于DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型1957

A．Kornberg在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶I。這是可在試管中合成DNA的頭一種核酸酶。現(xiàn)在這種酶已被用來(lái)制備標(biāo)記的DNA探針1958

M．Meselson和F．w．Stahl證實(shí)DNA的復(fù)制涉及到雙螺旋分子兩條互補(bǔ)鏈的分離過(guò)程，提出了DNA半保留復(fù)制模型1961

M．w．Nirenberg等人應(yīng)用合成的信使RNA分子[poly(u)]破譯出了第一批遺傳密碼F．Jacob和J．Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型1965

S.W.Holley完成了第一個(gè)酵母丙氨酸t(yī)RNA的核苷酸全序列測(cè)定1966

M．w．Nirenberg，S.Ochoa和H．G．Khorana共同破譯了全部的遺傳密碼1967

發(fā)現(xiàn)了可將DNA鏈連接起來(lái)的DNA連接酶1970

H．O．Smith，K．w．Wilcox，T．J．Kelley分離到第一種核酸內(nèi)切限制酶，1973

以H．Boyer，P．Berg等人為代表的一批美國(guó)科學(xué)家發(fā)展了關(guān)于重組DNA技術(shù)。并于1972年得到了第一個(gè)重組的DNA分子，1973完成頭一個(gè)細(xì)菌基因的克隆1975

F．Sanger以及A．Maxam和w．Gilbert發(fā)明了快速的DNA序列測(cè)定技術(shù)。1977年第一個(gè)全長(zhǎng)5387bp的噬菌體ФX174基因組測(cè)定完成1978

首次實(shí)現(xiàn)了通過(guò)大腸桿菌生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素1980

美國(guó)聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以獲得專(zhuān)利1981

R．D．Palmiter和R．L．Brinster成功獲得第一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠；A．c．Spradling和G·M·Rubin培育出轉(zhuǎn)基因果蠅1982

第一個(gè)由基因工程菌生產(chǎn)的藥物一胰島素，在美國(guó)和英國(guó)獲準(zhǔn)使用1983

頭一個(gè)表達(dá)其它種植物基因(一個(gè)基因)的轉(zhuǎn)基因植物培育成功1985

頭一批轉(zhuǎn)基因的家畜(兔、豬和羊)誕生1986

基因工程生物首次在控制的情況下實(shí)驗(yàn)性地釋放到環(huán)境中1988

J·D·watson出任“人類(lèi)基因組計(jì)劃”首席科學(xué)家，協(xié)調(diào)舉世矚目的人類(lèi)基因組測(cè)序工作的進(jìn)行1994

基因工程西紅柿在美國(guó)上市1995

自然雜志匯集發(fā)表了人基因組全物理圖，以及3號(hào)、16號(hào)和22號(hào)人染色體的高密度物理圖1996

完成了酵母基因組DNA(125×10。bp)的全序列測(cè)定工作1997

中國(guó)科學(xué)院國(guó)家基因研究中心以洪國(guó)藩教授為首的科學(xué)家小組，在世界上首次成功構(gòu)建了高分辨的水稻基因組物理圖

英國(guó)愛(ài)丁堡羅斯林研究院首次克隆成功多莉羊，引起世界轟動(dòng)。第二章基因克隆所需的工具酶

基因操作包括以DNA分子的切割和連接為核心的一系列步驟，需要多種具有不同功能的工具酶參與完成。以限制性?xún)?nèi)切酶(restrictionendonuclease)和DNA連接酶(1igase)為主的多種工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，為基因操作提供了十分重要的技術(shù)基礎(chǔ)?；虻闹亟M與分離，涉及到一系列相互關(guān)連的酶催化反應(yīng)。已經(jīng)知道有許多種重要的核酸酶，例如核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶，以及用信使RNA模板合成互補(bǔ)鏈DNA的反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)等，在基因克隆的實(shí)驗(yàn)中都有著廣泛的用途。一、限制性?xún)?nèi)切酶(restrictionenzyme)1．限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，是一類(lèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。它們主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的。根據(jù)1994年美國(guó)出版的《分子生物學(xué)百科全書(shū)》的統(tǒng)計(jì)數(shù)字，僅Ⅱ型核酸內(nèi)切限制酶一項(xiàng)迄今就已從各種不同的微生物當(dāng)中，分離出了2300種以上，可識(shí)別230種不同的DNA序列。早在本世紀(jì)中期，以Arber等人對(duì)入噬菌體在大腸桿菌不同菌株上的平板培養(yǎng)效應(yīng)的研究為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)了原核生物體內(nèi)存在著寄生控制的限制(restriction)和修飾(modification)系統(tǒng)。

圖中的數(shù)字是生長(zhǎng)在不同寄主中的^噬菌體的成斑率(EOP)，表示限制程度。在K株或B株上生長(zhǎng)繁殖的噬菌體^(K)或L(B)，再次感染原寄主菌株的成斑率均為1，而感染新的寄主菌株的成斑率則分別為10-4和4×10-4，所以說(shuō)受到了限制。

在限制修飾系統(tǒng)中限制作用是指一定類(lèi)型的細(xì)菌可以通過(guò)限制性酶的作用，破壞入侵的外源DNA(如噬菌體DNA等)，使得外源DNA對(duì)生物細(xì)胞的入侵受到限制；而生物細(xì)胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通過(guò)修飾酶的作用：在堿基中特定的位置上發(fā)生了甲基化而得到了修飾，可免遭自身限制性酶的破壞，這就是限制修飾系統(tǒng)中2．核酸內(nèi)切限制酶的類(lèi)型

目前已經(jīng)鑒定出有三種不同類(lèi)型的核酸內(nèi)切限制酶，即I型酶、II型酶和III型酶。這三種不同類(lèi)型的限制酶具有不同的特性(表3—3)。

表3-3

核酸內(nèi)切限制酶的類(lèi)型及其主要特性特性I型II型III型限制和修飾活性單一多功能的酶分開(kāi)的核酸內(nèi)切酶和甲基化酶

具有一種共同亞基的雙功能的酶核酸內(nèi)切限制酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一的成份

2種不同的亞基

切割位點(diǎn)在距寄主特異性位點(diǎn)至少1000bp的地方可能隨機(jī)地切割位于寄主特異性位點(diǎn)或其附近

距寄主特異性位點(diǎn)3，端24~26bp處甲基化作用的位點(diǎn)寄主特異性的位點(diǎn)寄主特異性的位點(diǎn)寄主特異性的位點(diǎn)識(shí)別未甲基化的序列進(jìn)行核酸內(nèi)切酶切割

能

能能序列特異的切割不是是是DNA克隆中的用處無(wú)用十分有用用處不大

1968年，Meselson和Yuan最早從大腸桿菌B和K菌株的限制和修飾系統(tǒng)中分離到限制性?xún)?nèi)切酶，這種酶后來(lái)被命名為I型限制性核酸內(nèi)切酶。I型限制性?xún)?nèi)切酶雖可識(shí)別DNA分子中特定的核苷酸序列，但它們的切割作用卻是隨機(jī)進(jìn)行的，其切割方式是，先與雙鏈DNA上未加修飾的識(shí)別序列相互結(jié)合，然后沿著DNA移動(dòng)相當(dāng)于1000~5000個(gè)核苷酸的一段距離后，在似乎是隨機(jī)的位置上切割一股單鏈，形成大約75個(gè)核苷酸的缺口。因此，I型限制性?xún)?nèi)切酶在基因操作中沒(méi)有什么實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。在1970年，發(fā)現(xiàn)II型酶，由于其核酸內(nèi)切酶活性和甲基化作用活性是分開(kāi)的，而且核酸內(nèi)切作用又具有序列特異性，故在基因克隆中有特別廣泛的用途。所以在基因工程中我們著重介紹II型酶。3．核酸內(nèi)切限制酶的命名法

由于發(fā)現(xiàn)了大量的限制酶，所以需要有一個(gè)統(tǒng)一的命名法。H．O．Smith和D．Nathans(1973)提議的命名系統(tǒng)，已被廣大學(xué)者所接受。他們建議的命名原則包括如下幾點(diǎn)：

①

用屬名的頭一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母，組成3個(gè)字母的略語(yǔ)表示寄主菌的物種名稱(chēng)。例如，大腸桿菌(Escherichia

coli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilus

influen—zae)用Hin表示。

②

用一個(gè)寫(xiě)在右下方的標(biāo)注字母代表菌株或型，例如Ecok。如果限制與修飾體系在遺傳上是由病毒或質(zhì)粒引起的，則在縮寫(xiě)的寄主菌的種名右下方附加一個(gè)標(biāo)注字母，表示此染色體外成分。例如Ecop1，EcoR1。

⑧如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個(gè)不同的限制與修飾體系，則以羅馬數(shù)字表示。因此，流感嗜血菌Rd菌株的幾個(gè)限制與修飾體系分別表示為HindI、HindII、HindIII等等。

④所有的限制酶，除了總的名稱(chēng)核酸內(nèi)切限制酶R外，還帶有系統(tǒng)的名稱(chēng)，例如核酸內(nèi)切酶R．HindIII。同樣地，修飾酶則在它的系統(tǒng)名稱(chēng)之前加上甲基化酶M的名稱(chēng)。相應(yīng)于核酸內(nèi)切酶R．HindIII的流感嗜血菌Rd菌株的修飾酶，命名為甲基化酶M.HindIII。

在實(shí)際應(yīng)用上，這個(gè)命名體系已經(jīng)作了進(jìn)一步的簡(jiǎn)化：

①由于附有標(biāo)注字母在印刷上很不方便，所以現(xiàn)在通行的是把全部略語(yǔ)字母寫(xiě)成一行。

②在上下文已經(jīng)交待得十分清楚只涉及限制酶的地方，核酸內(nèi)切酶的名稱(chēng)R便被省去。4.Ⅱ型核酸限制性?xún)?nèi)切酶的基本特性與I型及III型核酸內(nèi)切限制酶不同，II型核酸內(nèi)切酶只有一種多肽，并通常以同源二聚體形式存在。(1)

基本特性它具有三個(gè)基本特性：a.

在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割DNA分子產(chǎn)生鏈的斷裂；b.

2個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)的；c.

因此，斷裂的結(jié)果形成的DNA片段，也往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。a.

識(shí)別位點(diǎn)：

絕大多數(shù)的II型核酸內(nèi)切限制酶，都能夠識(shí)別由4~8個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列。我們稱(chēng)這樣的序列為核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別序列。而限制酶就是從其識(shí)別序列內(nèi)切割DNA分子的，因此識(shí)別序列又稱(chēng)為核酸內(nèi)切限制酶的切割位點(diǎn)或靶序列。有些識(shí)別序列是連續(xù)的(如GATC)，有些識(shí)別序列則是間斷的(如GANTC)，N是代表任意一種核苷酸堿基，切割位點(diǎn)的一個(gè)共同特點(diǎn)是，它們具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)的結(jié)構(gòu)形式，換言之，這些核苷酸對(duì)的順序是呈回文結(jié)構(gòu)，例如：5′-CTGCAG-3′

5′-CTGCA

G-3′3′-GACGTC-5′

3′-G

+

ACGTC-5′（a）PstI切割位點(diǎn)

5′-GAATTC-3′

5′-G

+

AATTC-3′3′-CTTAAG-5′

3′-CTTAA

G-5′

(b)EcoRI切割位點(diǎn)

5′-GAT

ATC-3′

5′-GAT

+

ATC-3′3′-CTA

TAG-5′

3′-CTA

TAG-5′（c）EcoRV切割位點(diǎn)圖

不同的核酸內(nèi)切限制酶切割DNA分子產(chǎn)生的兩種不同的粘性末端(a)

PstI的識(shí)別序列，切割后形成3′﹣OH的單鏈粘性末端，(b)

EcoRI的識(shí)別序列，切割后形成5′﹣P的單鏈粘性末端，(c)

EcoRV的識(shí)別序列，切割后形成平末端。在切割位點(diǎn)處，限制酶的作用下磷酸二酯鍵便會(huì)發(fā)生水解效應(yīng)，從而導(dǎo)致鏈的斷裂。這就是所謂的核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA鏈的切割作用。b.切割類(lèi)型：

檢驗(yàn)了非常大量的實(shí)驗(yàn)事例之后發(fā)現(xiàn)，由核酸內(nèi)切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割類(lèi)型，通常是屬于下述兩種獨(dú)特的排列方式之一：（1）兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是對(duì)稱(chēng)地圍繞著一個(gè)對(duì)稱(chēng)軸排列，這種形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的DNA片段；（2）兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的中心，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片段。c.產(chǎn)生的末端特征：我們所說(shuō)的粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過(guò)互補(bǔ)堿基間的配對(duì)而重新環(huán)化起來(lái)。平末端的DNA片段則不易于重新環(huán)化。已知有兩種不同類(lèi)型的限制酶都可以產(chǎn)生粘性末端，但一種是形成具有3′﹣OH單鏈延伸的粘性末端，例如PstI酶就是屬于這種類(lèi)型；另一種則是形成具有5′﹣P單鏈延伸的粘性末端，例如EcoRI酶便是此種類(lèi)型的一個(gè)代表。(2)

同裂酶(isoschizomers)

有一些來(lái)源不同的限制酶識(shí)別的是同樣的核苷酸靶序列，這類(lèi)酶特稱(chēng)為同裂酶(isoschizomers)。同裂酶產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。例如，限制酶HpaⅡ和MspI是一對(duì)同裂酶，共同的靶子序列是CCGG。(3)同尾酶

(isocaudamer)與同裂酶對(duì)應(yīng)的一類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶,它們雖然來(lái)源不同，識(shí)別的靶序列也各不相同,但都能產(chǎn)生相同的粘性末端,特稱(chēng)為同尾酶。常用的BamHI,BclI,BglII,XhoI就是一組同尾酶。它們切割DNA之后都形成由-GATC-4個(gè)核苷酸組成的粘性末端，很顯然，由同尾酶所產(chǎn)生的DNA片段，是能夠通過(guò)其粘性末端之間的互補(bǔ)作用而彼此連接起來(lái)的，因此在基因克隆實(shí)驗(yàn)中很有用處。由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)，特稱(chēng)之為“雜種位點(diǎn)”(hybridsite)。但必須指出，這類(lèi)雜種位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，一般是不再被原來(lái)的任何一種同尾酶所識(shí)別的。例如：SalI（5′-G

TCGAC-3′）和XhoI(5′-C

TCGAG-3′)的消化片段相連，但所形成的重組片段（5′-GTCGAG-3′）則不能被上述2種酶的任一種酶識(shí)別和切割。但也有例外。5．影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素(1)

DNA的純度核酸內(nèi)切限制酶消化DNA底物的反應(yīng)效率，在很大程度上是取決于所使用的DNA本身的純度。污染在DNA制劑中的某些物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸鈉)、以及高濃度的鹽離子等，都有可能抑制核酸內(nèi)切限制酶的活性。為了提高核酸內(nèi)切酶對(duì)低純度DNA的反應(yīng)效率，一般采用如下三種方法：①增加核酸內(nèi)切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高達(dá)10單位甚至更多些②擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積，以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)地稀釋。③延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間。

在有些DNA制劑中，尤其是按微量堿法制備的，會(huì)含有少量的DNase的污染。由于DNase的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的貯存緩沖液中含有二價(jià)金屬離子螯合劑EDTA，因此在這種制劑中的DNA仍然是穩(wěn)定的。然而在加入了核酸內(nèi)切限制酶緩沖液之后，DNA則會(huì)被DNase迅速地降解掉。要避免發(fā)生這種情況，唯一的辦法就是使用高純度的DNA。

(2)

DNA的甲基化程度

核酸內(nèi)切限制酶是原核生物限制—修飾體系的組成部分，因此識(shí)別序列中特定核苷酸的甲基化作用，便會(huì)強(qiáng)烈地影響酶的活性。為避免產(chǎn)生這樣的問(wèn)題，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒DNA。

(3)

酶切消化反應(yīng)的溫度DNA消化反應(yīng)的溫度，是影響核酸內(nèi)切限制酶活性的另一個(gè)重要因素。不同的核酸內(nèi)切限制酶，具有不同的最適反應(yīng)溫度，而且彼此之間有相當(dāng)大的變動(dòng)范圍。大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是37℃，但也有許多例外的情況，它們要求37℃以外的其它反應(yīng)溫度。其中有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度低于標(biāo)準(zhǔn)的37℃，例如SmaI是25℃、ApaI是30℃；有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度則高于標(biāo)準(zhǔn)的37℃，例如MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃；還有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度可高達(dá)60℃以上，消化反應(yīng)的溫度低于或高于最適溫度，都會(huì)影響核酸內(nèi)切限制酶的活性，甚至最終導(dǎo)致完全失活。

(4)

DNA的分子結(jié)構(gòu)DNA分子的不同構(gòu)型對(duì)核酸內(nèi)切限制酶的活性也有很大的影響。某些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA的高出許多倍，最高的可達(dá)20倍。此外，還有一些核酸內(nèi)切限制酶，切割它們自己的處于不同部位的限制位點(diǎn)，其效率亦有明顯的差別。據(jù)推測(cè)，這很可能是由于側(cè)翼序列的核苷酸成份的差造成的。

(5)

核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的組份包括：氯化鎂、氯化納或氯化鉀、Tris-HCl,?-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常發(fā)揮，是絕對(duì)地需要二價(jià)的陽(yáng)離子，通常是Mg2+。不正確的NaCl或Mg2+濃度，不僅會(huì)降低限制酶的活性，而且還可能導(dǎo)致識(shí)別序列特異性的改變。緩沖液Tris-HCl的作用在于使反應(yīng)混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳數(shù)值的范圍之內(nèi)。對(duì)絕大多數(shù)限制酶來(lái)說(shuō)，在pH=7.4的條件下，其功能最佳。巰基試劑對(duì)于保持某些核酸內(nèi)切限制酶的穩(wěn)定性是有用的，而且還可保護(hù)其免于失活。但它同樣也可能有利于潛在污染雜質(zhì)的穩(wěn)定性。有一部分核酸內(nèi)切限制酶對(duì)于鈉離子或鉀離子濃度變化反應(yīng)十分敏感，而另一部分核酸內(nèi)切限制酶則可適應(yīng)較廣的離子強(qiáng)度的變化幅度。

在“非最適的”反應(yīng)條件下(包括高濃度的核酸內(nèi)切限制酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)，有些核酸內(nèi)切限制酶識(shí)別序列的特異性便會(huì)發(fā)生“松動(dòng)”，從其“正確”識(shí)別序列以外的其它位點(diǎn)切割DNA分子。

有些核酸內(nèi)切限制酶的切割特異性，受所用的緩沖液成份的影響比較明顯。例如，最常用的EcoRI限制酶，在正常的情況下，是在G

AATTC識(shí)別序列處發(fā)生切割作用的，但如果緩沖液中的甘油濃度超過(guò)5％(V／V)，那么其識(shí)別序列的特異性就會(huì)發(fā)生松動(dòng)，可在AATT或PuPuATPyPy序列處發(fā)生切割作用。EcoRI限制酶的這種特殊的識(shí)別能力，通常叫做星號(hào)活性，以EcoRI*表示。6.限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)的終止

消化DNA樣品后，在進(jìn)一步處理DNA樣品前往往需要鈍化內(nèi)切酶的活性，鈍化大多數(shù)限制性?xún)?nèi)切酶的方法是65℃溫浴5分鐘。但有些酶，如BamHI和HaeⅡ?qū)岱€(wěn)定，則需加入終止反應(yīng)液(如加入0.5mol／L的EDTA使之在溶液中的終濃度達(dá)到10mmol/L)螯合Mg2+，以終止反應(yīng)。此外，還可以用等體積的酚抽提酶解產(chǎn)物，提取DNA。如果用限制性?xún)?nèi)切酶消化DNA分子后，為了進(jìn)行凝膠電泳分析，則可直接加入凝膠電泳加樣緩沖液，振蕩混合后，直接上樣進(jìn)行凝膠電泳。7.利用限制酶對(duì)DNA進(jìn)行消化的具體步驟不同的限制酶生產(chǎn)廠家往往推薦使用截然不同的反應(yīng)條件，甚至對(duì)同一種酶也如此。由于大多數(shù)生產(chǎn)廠家都針對(duì)其特定酶制劑優(yōu)化過(guò)反應(yīng)條件，所以建議遵循與酶一起提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。不同限制酶的緩沖液主要差別在于其中所含NaCl的濃度。當(dāng)要用兩種或兩種以上限制酶切割DNA時(shí)，如果這些酶可以在同種緩沖液中作用良好，則兩種酶可同時(shí)切割。如果這些酶所要求的緩沖液有所不同，則可采用以下兩種替代方法：①

先用在低離子強(qiáng)度的緩沖液中活性最高的酶切割DNA，然后加入適量NaCl及第二種酶，繼續(xù)溫育；②

使用實(shí)際上所有限制酶均可作用的單種緩沖液[谷氨酸鉀緩沖液(KGB)](Hanish和McClelland,1988；McClelland等，1988)?？墒垢鞣N限制酶的活性達(dá)到最高。限制酶消化反應(yīng)的進(jìn)行

以下是對(duì)0.2~1.0ugDNA進(jìn)行消化的典型反應(yīng)步驟，如要對(duì)更大量的DNA進(jìn)行消化，則反應(yīng)的各個(gè)成分須相應(yīng)放大。1)將DNA溶液加入一滅菌的微量離心管中并與適量水混勻，使總體積為18pl。2)加入2μl適當(dāng)?shù)?0×限制酶消化緩沖液。輕敲管外壁以混勻之。3)加入1~2單位限制酶，輕彈管外壁以混勻之。1單位酶通常定義為，在建議使用的緩沖液及溫度下，在20μ1反應(yīng)液中反應(yīng)1小時(shí)，使lμgDNA完全消化所需的酶量。除非在酶制劑中污染了DNA酶或外切核酸酶(這種污染情況在商品化的限制酶制品中極少出現(xiàn))。一般酶量過(guò)大或反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)不會(huì)發(fā)生什么問(wèn)題。4)將上述混合的反應(yīng)物置于適當(dāng)溫度并按所需的時(shí)間進(jìn)行溫育。5)加入0.5mol／LEDTA(pH8.0)使終濃度達(dá)10mmol／L，以終止反應(yīng)。6)如果消化后DNA直接進(jìn)行凝膠電泳分析，可加入6μl凝膠電泳加樣緩沖液，振蕩混合后，即可加樣進(jìn)行電泳。

如欲純化消化后的DNA，可用酚：氯仿和氯仿各抽提1次，再用乙醇沉淀DNA。8.使用限制酶的注意點(diǎn)1）限制酶十分昂貴!遵循以下建議可以最大限度地節(jié)省開(kāi)支。為能從貯存管內(nèi)取出小量的酶，只要用一次性使用的移液器吸頭在酶溶液表面輕沾一下即可。這樣，你可以取到少至0.1μl的酶。濃縮的限制酶也可在使用前用1×限制酶緩沖液稀釋。但切勿用水稀釋以免酶變性。2)

限制酶在50％甘油中保存于-20℃時(shí)是穩(wěn)定的。進(jìn)行酶切消化時(shí)，將除酶以外的所有反應(yīng)成分加入后即加以混勻，再?gòu)谋鋬?nèi)取出貯酶管，立即放置于冰上。每次取酶時(shí)都應(yīng)換一個(gè)無(wú)菌吸頭，一旦限制酶中污染了DNA或其他酶，將造成財(cái)力和時(shí)間上的浪費(fèi)。操作要盡可能快，用完后立即將酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的時(shí)間盡可能縮短。3)

盡量減少反應(yīng)中的加水量以使反應(yīng)體積減到最小。但要確保酶體積不超過(guò)反應(yīng)總體積的1/10，否則，限制酶活性將受到甘油的抑制。4)

通常延長(zhǎng)消化時(shí)間可使所需的酶量減少。這在切割大量DNA時(shí)不失為一大節(jié)約方法。在消化過(guò)程中，可取少量反應(yīng)液進(jìn)行微膠電泳以判斷消化進(jìn)程。二、DNA連接酶同核酸內(nèi)切限制酶一樣，DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，對(duì)于重組DNA技術(shù)學(xué)的創(chuàng)立與發(fā)展也具有頭等重要的意義。它們都是在體外構(gòu)建重組DNA分子所必不可少的基本工具酶。核酸內(nèi)切限制酶可以將DNA分子切割成不同大小的片段，然而要將不同來(lái)源的DNA片段組成新的雜種DNA分子，還必須將它們彼此連接并封閉起來(lái)。目前已知有三種方法可以在體外連接DNA片段：１）用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片段；２）用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來(lái)，或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片段加上poly(dA)—poly(dT)尾巴之后，再用DNA連接酶將它們連接起來(lái)；３）DNA片段末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來(lái)。這三種方法雖然互有差異，但共同的一點(diǎn)都是利用DNA連接酶所具有的連接和封閉單鏈DNA的功能。１．DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)

1967年，世界上有數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶(1igase)。這種酶需要在一條DNA鏈的3′–末端具有一個(gè)游離的羥基(–OH)，和在另一條DNA鏈的5′–末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)(–P)，只有在這種情況下，才能發(fā)揮其連接DNA分子的功能作用(圖)。同時(shí)，由于在羥基和磷酸基團(tuán)之間形成磷酸二酯鍵是一種吸能的反應(yīng)，因此還需要有一種能源分子的存在才能實(shí)現(xiàn)這種連接反應(yīng)。在大腸桿菌及其它細(xì)菌中，DNA連接酶催化的連接反應(yīng)，是利用ＮＡＤ＋[煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]作能源的；而在動(dòng)物細(xì)胞及噬菌體中，則是利用ATP[腺苷三磷酸]作能源。值得注意的一點(diǎn)是，DNA連接酶并不能夠連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的ＤＮＡ鏈必須是雙螺旋的一部分。實(shí)際上，DNA連接酶是封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口(nick)，即在雙鏈DNA的某一條鏈上兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂；而不能封閉裂口(gap)，即在雙鏈DNA的某一條鏈上失去一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸所形成的單鏈斷裂。２．ＤＮＡ連接酶的連接機(jī)理在反應(yīng)中，ATP(在有些連接酶是NAD)提供了激活的AMP，同DNA連接酶生成一種共價(jià)結(jié)合的酶-AMP復(fù)合物，同時(shí)伴隨著釋放出焦磷酸(PPi)或煙酰胺單核苷酸(NMN)。其中，AMP(腺苷一磷酸)是通過(guò)一種磷酸酰胺鍵同DNA連接酶的賴(lài)氨酸之c—氨基相連。激活的AMP隨后從賴(lài)氨酸殘基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5′–末端磷酸基團(tuán)上，形成DNA—腺苷酸復(fù)合物。最后一步是3′–OH對(duì)活躍的磷原于作親核攻擊，結(jié)果形成磷酸二酯鍵，同時(shí)釋放出AMP。這個(gè)反應(yīng)序列，是由在DNA連接酶—腺苷酸復(fù)合物形成過(guò)程中，釋放出來(lái)的焦磷酸的水解作用所激發(fā)的。因此，如果是以ATP作能源的話(huà)，在DNA骨架上形成一個(gè)磷酸二酯鍵就要花費(fèi)2個(gè)高能磷酸鍵。而如果是應(yīng)用NAD+作為腺苷酸的給體，那么每形成一個(gè)磷酸二酯鍵同樣也需要花費(fèi)2個(gè)高能磷酸鍵。

分類(lèi)：用于共價(jià)連接DNA限制片段的連接酶有兩種不同的來(lái)源：一種是由大腸桿菌染色體編碼的叫做DNA連接酶：另一種是由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的叫做T4DNA連接酶。這兩種DNA連接酶，除了前者用NAD+作能源輔助因子，后者用ATP作能源輔助因子外，其它的作用機(jī)理并沒(méi)有什么差別。T4DNA連接酶是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中純化的，比較容易制備，而且還能夠?qū)⒂上拗泼盖懈町a(chǎn)生的完全堿基配對(duì)的平末端DNA片段連接起來(lái)，因此在分子生物學(xué)研究及基因克隆中都有廣泛的用途。

連接酶連接缺口DNA的最佳反應(yīng)溫度是37℃。但是在這個(gè)溫度下，粘性末端之間的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此，連接粘性末端的最佳溫度，應(yīng)是界于酶作用速率和末端結(jié)合速率之間，一般認(rèn)為4~15℃比較合適．３．粘性末端DNA片段的連接3.1粘性末端的連接

DNA連接酶最突出的特點(diǎn)是，它能夠催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組的DNA分子。應(yīng)用DNA連接酶這種特性，可在體外將具有粘性末端的DNA限制片段，插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，從而可以按照人們的意圖構(gòu)建出新的DNA雜種分子。具粘性末端的DNA片段的連接比較容易，也比較常用。當(dāng)然，按上述這種方法構(gòu)建重組體DNA分子，也有一些不便之處需要克服。其中最主要的缺點(diǎn)是，由限制酶產(chǎn)生的具有粘性末端的載體DNA分子，在連接反應(yīng)混合物中會(huì)發(fā)生自我環(huán)化作用，并在連接酶的作用下重新變成穩(wěn)定的共價(jià)閉合的環(huán)形結(jié)構(gòu)。這樣就會(huì)使只含有載體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的“本底”比例大幅度地上升，最終給重組體DNA分子的篩選工作帶來(lái)了麻煩。為了克服這一缺點(diǎn)，現(xiàn)在的載體一般能提供多克隆位點(diǎn)，可采用雙酶切進(jìn)行酶切。3.2平末端DNA片段的連接不具有粘性末端的DNA分子也可以被連接起來(lái)。連接這種平末端DNA分子的方法有4種，（1）直接用T4DNA連接酶連接；（2）先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA連接酶進(jìn)行連接；（3）用銜接物連接平末端DNA分子；（4）DNA接頭連接法。（1）直接用T4DNA連接酶連接T4DNA連接酶同一般的大腸桿菌DNA連接酶不同。T4DNA連接酶除了能夠封閉具有3′–OH和5′–P末端的雙鏈DNA的缺口之外，在存在ATP和加入高濃度酶的條件下，它還能夠連接具有完全堿基配對(duì)的平末端的DNA分子。這種反應(yīng)的原因目前尚不清楚。但平末端連接效率不高，基因操作不經(jīng)常采用。（2）同聚物加尾連接平末端DNA片段

運(yùn)用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒑塑账?通過(guò)脫氧核苷三磷酸前體)，加到DNA分子單鏈延伸末端的3′–OH基團(tuán)上，它并不需要模板鏈的存在，它一個(gè)一個(gè)加上核苷酸，構(gòu)成由核苷酸組成的尾巴，長(zhǎng)度可達(dá)100個(gè)核苷酸。為了在平末端的DNA分子上產(chǎn)生帶有3′–OH的單鏈延伸，我們需要用5′–特異的核酸外切酶處理DNA分子，以便移去少數(shù)幾個(gè)末端核苷酸。在由核酸外切酶處理過(guò)的DNA，dATP和末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶組成的反應(yīng)混合物中，DNA分子的3′–OH末端將會(huì)出現(xiàn)單純由腺嘌吟核苷酸組成的DNA單鏈延伸。這樣的延伸片段稱(chēng)為poIy(dA)尾巴。反過(guò)來(lái)，如果在反應(yīng)混合物中加入的是dTTP而不是dATP，那么這種DNA分子的3′-OH末端將會(huì)形成poly(dT)尾巴。因此任何兩條DNA分子，只要分別獲得po1y(dA)和poly(dT)尾巴，就會(huì)彼此連接起來(lái)。所加的同聚物尾巴的長(zhǎng)度并沒(méi)有嚴(yán)格的限制。連接分子的裂口可以通過(guò)大腸桿菌DNA聚合酶I的作用于以填補(bǔ)上。留下的單鏈缺口則可由DNA連接酶封閉。上述這種連接DNA分子的方法叫作同聚物尾巴連接法，簡(jiǎn)稱(chēng)同聚物加尾法。按照同樣的道理，也可以用給一種DNA分子3′–末端加上poly(dG)尾巴，給另一種DNA分子3′–末端加上poly(dC)尾巴的辦法，使2個(gè)不同的DNA分子連接起來(lái)．同聚物尾巴連接法是一種十分有用的DNA分子連接法。不但由特定限制酶消化會(huì)形成具平末端的DNA片段，就是用機(jī)械切割法破裂大分子量DNA，也經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生出平末端的DNA片段。此外在重組DNA技術(shù)學(xué)中占重要位置的，由RNA模板制備的cDNA同樣也具有平末端的結(jié)構(gòu)。這些DNA分子的連接，都往往要采用同聚物尾巴連接法．(3)用銜接物連接平末端DNA分子如果重組體DNA是用T4DNA連接酶的平末端連接或是用同聚物加尾構(gòu)建的，那么就無(wú)法用原來(lái)的限制酶作特異的切割，因此也不能獲得插入DNA片段。為了解決這個(gè)問(wèn)題，可采用銜接物法提供必要的序列，進(jìn)行DNA分子的連接。所謂銜接物(1inker)，是指用化學(xué)方法合成的一段由10~12個(gè)核苷酸組成的、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段。銜接物的5′–末端和待克隆的DNA片段5，一末端，用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后再通過(guò)T4DNA連接酶的作用使兩者連接起來(lái)。接著用適當(dāng)?shù)南拗泼赶哂秀暯游锏腄NA分子和克隆載體分子，這樣的結(jié)果使二者都產(chǎn)生出了彼此互補(bǔ)的粘性末端。于是便可以按照常規(guī)的粘性末端連接法，將待克隆的DNA片段同載體分子連接起來(lái)。（4）DNA接頭連接法DNA銜接物連接法盡管有諸多方面的優(yōu)越性，但也有一個(gè)明顯的缺點(diǎn)，那就是如果待克隆的DNA片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的銜接物相同的限制位點(diǎn)，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也就會(huì)把克隆基因切成不同的片段，從而為后繼的亞克隆及其它操作造成麻煩。當(dāng)然，在遇到這種情況時(shí)，一個(gè)方法可改用其它類(lèi)型的銜接物，另一種公認(rèn)的較好的替代辦法是改用DNA接頭(adapter)連接法。DNA接頭(adapter)連接法于1978年由康乃爾大學(xué)吳瑞教授發(fā)明的。它是一類(lèi)由人工合成的一頭具有某種限制性?xún)?nèi)切酶粘末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸片段。當(dāng)它的平末端與平末端的外源DNA片段連接之后，便會(huì)使后者成為具粘性末端的新的DNA分子，而易于連接重組。這種連接法看起來(lái)的確是相當(dāng)簡(jiǎn)單的，但在實(shí)際使用時(shí)也遇到了一個(gè)新的麻煩。因?yàn)樘幵谕环磻?yīng)體系中的各個(gè)DNA接頭分子的粘性末端之間，會(huì)通過(guò)互補(bǔ)堿基間的配對(duì)作用，形成如同DNA銜接物一樣的二聚體分子，尤其是在高濃度DNA接頭的環(huán)境中情況更盛。目前用于克服這個(gè)問(wèn)題的辦法是，對(duì)DNA接頭末端的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行必要的修飾與改造，使之無(wú)法發(fā)生彼此間的配對(duì)連接。天然的雙鏈DNA分子的兩端都具有正常的5′–P和3′–OH末端結(jié)構(gòu)。修飾后的DNA接頭分子的平末端，仍與天然雙鏈DNA分子一樣，具有正常的末端結(jié)構(gòu)，而其粘性末端的5′–P則被修飾移走，結(jié)果為暴露出的5′–OH所取代。這樣，雖然兩個(gè)接頭分子粘性末端之間仍具互補(bǔ)堿基配對(duì)的能力，但終因DNA連接酶無(wú)法在5′–OH和3′–OH之間形成磷酸二酯鍵，而不會(huì)產(chǎn)生出穩(wěn)定的二聚體分子。合成的BamHI接頭分子同外源DNA片段連接。這個(gè)接頭的粘性末端具異常的5′–OH基團(tuán)，因此不會(huì)自我多聚化。用多核苷酸激酶及ATP等處理，使連接在外源DNA片段上的接頭分子的5′–末端磷酸化，然后插入到事先已用BamHI切割的載體分子上這種粘性末端被修飾的DNA接頭分子，雖然喪失了彼此連接的能力，但它們的平末端照樣可以與平末端的外源DNA片段正常連接。只是在連接之后，需用多核苷酸激酶處理，使異常的5′–OH末端恢復(fù)成正常的5′-P末端，讓其可以插入到適當(dāng)?shù)目寺≥d體分子上。三、DNA聚合酶分子克隆操作中，常使用的DNA聚合酶有大腸桿菌DNA聚合酶I，大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow大片段，T4DNA聚臺(tái)酶，T7DNA聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶等。這些DNA聚合酶的共同特點(diǎn)是，它們都能把脫氧核糖核苷酸連續(xù)加到雙鏈DNA分子引物鏈的3′–OH末端，催化核苷酸的聚合，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。其中，T7DNA聚合酶的聚合能力最強(qiáng)。1．大腸桿菌DNA聚合酶I

1956年A．Kornberg等首先從E．co1i細(xì)胞中分離出來(lái)。它是在DNA模板的方向上催化核苷酸聚合的酶，由單一多肽組成球蛋白。1.1功能：DNA聚合酶I是一個(gè)多功能酶，它包括三種不同的酶活力：

(1)5′→3′合酶活性：催化單核苷酸結(jié)合到DNA模板的3′–OH末端，以ssDNA作模板，沿引物的3′–OH方向按模板順序從5′→3′延伸。

(2)5′→3′外切酶活性：E．co1iDNA聚合酶1也能從游離的5′–末端降解dsDNA成為單核苷酸。

(3)3′→5′外切酶活性：DNA聚合酶I還能從游離的3′–OH末端降解dsDNA或ssDNA成為單核苷酸。1.2E．coliDNA聚合酶在基因工程中的重要用途：DNA聚合酶I在分子克隆中的主要用途是，通過(guò)DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針。缺口轉(zhuǎn)移(nicktranslation)指在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶I的5′→3′，核酸外切酶活性和聚合作用可以同時(shí)發(fā)生。這就是說(shuō)，當(dāng)外切酶活性從缺口的5′一側(cè)移去一個(gè)核苷酸之后，聚合作用就會(huì)在缺口的3′一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸。但由于PolI不能夠在3′–OH和5′–P之間形成一個(gè)鍵，因此隨著反應(yīng)的進(jìn)行，5′–側(cè)的核苷酸不斷地被移去，3′–側(cè)的核苷酸又按序地增補(bǔ)，于是缺口便沿著DNA分子按合成的方向移動(dòng)。這種移動(dòng)特稱(chēng)為缺口轉(zhuǎn)移(nicktranslation)。在迄今已發(fā)現(xiàn)的所有大腸桿菌聚合酶中，唯有Poll能夠進(jìn)行這種獨(dú)立的鏈的取代反應(yīng)。在下面我們就可以看到，這對(duì)于重組DNA技術(shù)學(xué)來(lái)說(shuō)的確是十分重要的。DNA雜交探針的制備帶放射性同位素標(biāo)記的DNA雜交探針，在基因分離和操作中都經(jīng)常要用到。應(yīng)用缺口轉(zhuǎn)移法制備DNA雜交探針。其典型的反應(yīng)體系是，在25μ1總體積中含有1μg純化的特定的DNA片段，并加入適量的DNaseI、PolI、a-32P-dNTPs和未標(biāo)記的dNTPs。其中，DNaseI的作用在于給DNA分子造成斷裂或缺口，隨后Poll則作用于這些單鏈缺口進(jìn)行缺口轉(zhuǎn)移，使反應(yīng)混合物中的32P標(biāo)記的核苷酸取代原有的未標(biāo)記的核苷酸，并最終形成從頭到尾都被標(biāo)記的DNA分子。2．K!enow片段大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，又叫做Klenow聚合酶。它是由大腸桿菌DNA聚合酶I全酶，經(jīng)枯草桿菌蛋白酶(一種蛋白質(zhì)分解酶)處理之后，產(chǎn)生出來(lái)的分子量為76×103dal的大片段分子。Klenow聚合酶仍具有的聚合活性和3′→5′的核酸外切酶活性，但失去了全酶的5′→3′的核酸外切酶活性。在DNA分子克隆中，Klenow聚合酶的主要用途：標(biāo)記DNA末端。１）

修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3′隱蔽末端；２）

標(biāo)記DNA片段的末端；選用具有3′隱蔽末端的DNA片段作放射性末端標(biāo)記最為有效。用Klenow聚合酶標(biāo)記DNA片段末端的原理可簡(jiǎn)單地概括成如下的流程；

樣品置25℃下一道溫育約1小時(shí)，即可完成DNA末端標(biāo)記。因?yàn)榇龢?biāo)記的DNA已經(jīng)用適當(dāng)?shù)南拗泼缸髁嗣盖邢?，所形成的大小不等的DNA片段群體，它們都只是在末端被標(biāo)記上，根據(jù)它們?cè)诜肿恿可系牟顒e，便可以將這些片段分離出來(lái)。用Klenow聚合酶標(biāo)記的DNA片段，可以作為用凝膠電泳法測(cè)定分子大小的標(biāo)記樣品。其根據(jù)在于被標(biāo)記的DNA片段是同它們的摩爾濃度成比例，而同它們的分子大小無(wú)關(guān)。所以在限制酶消化過(guò)程所產(chǎn)生的大小DNA片段都得到了同等程度的標(biāo)記。據(jù)此，我們便可以應(yīng)用放射自顯影法，來(lái)確定那些難以被溴化乙錠染色法顯現(xiàn)的微小DNA片段的位置。3．T4DNA聚合酶取代合成法標(biāo)記DNA片段T4DNA聚合酶，是從T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出來(lái)的一種特殊的DNA聚合酶。具有兩種酶催活性，即5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性。如同大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段一樣，T4DNA聚合酶也可以用來(lái)標(biāo)記DNA平末端或隱蔽的3′–末端。在沒(méi)有脫氧核苷三磷酸存在的條件下，3′外切酶活性便是T4DNA聚合酶的獨(dú)特功能。此時(shí)它作用于雙鏈DNA片段，并按3′→5′的方向從3′–OH末端開(kāi)始降解DNA。如果反應(yīng)混合物中只有一種dNTP，那么這種降解作用進(jìn)行到暴露出同反應(yīng)物中唯一的dNTP互補(bǔ)的核苷酸時(shí)就會(huì)停止。這種降解速率的限制，使得DNA核苷酸的刪除受到控制，從而產(chǎn)生出具有一定長(zhǎng)度的3′–隱蔽末端的DNA片段。于是，當(dāng)反應(yīng)物中加入標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸(a-32p-dNTPs)之后，這種局部消化的DNA片段便起到了一種引物——模板的作用。T4DNA聚合酶的聚合作用速率超過(guò)了外切作用的速率，因此出現(xiàn)了DNA凈合成反應(yīng)，重新合成了完整的具有標(biāo)記末端的DNA分子。由于在這種反應(yīng)中，通過(guò)T4DNA聚合作用，反應(yīng)物中的a-32P-dNTP逐漸地取代了被外切活性刪除掉的DNA片段上的原有的核苷酸，因此特稱(chēng)為取代合成。應(yīng)用取代合成法可以給平末端的DNA片段或具有3′–隱蔽末端的DNA片段作末端標(biāo)記。四、逆轉(zhuǎn)錄酶又稱(chēng)RNA依賴(lài)的DNA聚合酶(RNA-—dependentDNApolymerase)。這是一種有效的轉(zhuǎn)錄RNA成為DNA的酶。產(chǎn)物DNA又稱(chēng)cDNA，即互補(bǔ)DNA。它首先是由Baltimore從鼠白血病毒(MurineleukemiaVirus)以及Temin和Mizutan從勞氏肉瘤病毒(RousSarcomaVirus)中于1970年獨(dú)立發(fā)現(xiàn)的，這兩個(gè)小組的論文同時(shí)發(fā)表在同一期的英國(guó)自然雜志上。逆轉(zhuǎn)錄酶也是一個(gè)多功能性酶，主要有幾種不同的酶活性：(1)

RNA依賴(lài)的DNA聚合酶

以RNA鏈為模板，以帶3′–OH末端的DNA片段為引物，沿5′→3′方向合成DNA鏈。(2)

DNA依賴(lài)的DNA聚合酶

以ssDNA為模板，以帶有3′–OH末端的DNA片段為引物，從5′→3′方向合成DNA鏈。(3)

外切RNA酶活性

底物是RNA—DNA雜交分子中的RNA鏈，有兩種活性形式。從RNA鏈5′–末端外切的稱(chēng)5′→3′外切RNA酶，從RNA鏈3′末端外切的稱(chēng)3′→5′外切RNA酶H。在基因工程中，逆轉(zhuǎn)錄酶的主要用途是轉(zhuǎn)錄mRNA成為cDNA制備基因片段。另外，它也可用ssDNA或RNA做模板制作制備，雜交探針。PAGEPAGE81第三章基因的克隆載體

基因克隆的重要環(huán)節(jié)，是把一個(gè)外源基因?qū)肷锛?xì)胞，并使它得到擴(kuò)增。然而一個(gè)外源DNA片段是很難進(jìn)入受體細(xì)胞的，即使進(jìn)入細(xì)胞，一般也不能進(jìn)行復(fù)制和功能的表達(dá)。這是因?yàn)?，所得到的外源DNA片斷一般不帶有復(fù)制子系統(tǒng)及在新的受體細(xì)胞中進(jìn)行功能表達(dá)的調(diào)控系統(tǒng)。這樣，進(jìn)行基因克隆是極為困難的。在基因工程中，通常是把外源DNA片斷利用運(yùn)載工具送入生物細(xì)胞。攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的這種工具叫做載體(Vector)。載體的本質(zhì)是DNA。經(jīng)過(guò)人工構(gòu)建的載體，不但能與外源基因相連接，導(dǎo)入受體細(xì)胞，還能利用本身的調(diào)控系統(tǒng)，使外源基因在新細(xì)胞中復(fù)制以致功能的表達(dá)。目前，將外源基因運(yùn)送到原核生物細(xì)胞的載體研究的較多，運(yùn)送到植物和動(dòng)物細(xì)胞中去的載體還處于探索階段。本章以原核細(xì)胞載體為主，討論各類(lèi)載體的結(jié)構(gòu)、功能以及構(gòu)建過(guò)程。在基因工程中所用的載體，主要有5類(lèi)，(1)

質(zhì)粒(Plasmid)，主要指人工構(gòu)建的質(zhì)粒。(2)

噬菌體的衍生物。(3)

cosmid(柯斯質(zhì)粒)。(4)

單鏈DNA噬菌體M13。(5)

動(dòng)物病毒。

各類(lèi)載體的來(lái)源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制等方面的特性差別很大，但作為基因工程用的載體，以下三方面是它們共有的特性和基本要求：

(1)在宿主細(xì)胞中能獨(dú)立自主的復(fù)制，即本身是復(fù)制子。(2)容易從宿主細(xì)胞中分離純化。(3)載體DNA分子中有一段不影響它們擴(kuò)增的非必需區(qū)域，插在其中的外源基因可以象載體的正常組分一樣進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增。

各類(lèi)載體具有自己獨(dú)特的生物學(xué)特性，可以根據(jù)基因工程的需要，有目的的選擇合適的載體，為此，分別介紹各類(lèi)載體。一、質(zhì)粒載體

質(zhì)粒作為一種裸露的，比病毒更簡(jiǎn)單的，有自主復(fù)制能力的DNA分子，是處于生命與非生命的分界線上。(一)質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性

質(zhì)粒（plasmid)是染色體以外能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，它廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中。在霉菌、藍(lán)藻、酵母和不少動(dòng)植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒存在。目前對(duì)細(xì)菌質(zhì)粒研究的較為深入，在基因工程中，多使用大腸桿菌質(zhì)粒為載體。

質(zhì)粒分子的大小為1~200kb，質(zhì)粒和病毒不同，它是裸露的DNA分子，沒(méi)有外殼蛋白，在基因組中，也沒(méi)有溶菌酶基因。質(zhì)?？梢浴溆押谩钡摹敖杈印痹谒拗骷?xì)胞中，也只有在宿主細(xì)胞中，質(zhì)粒才能完成自己的復(fù)制。同時(shí)將其編碼的一些非染色體控制的遺傳性狀進(jìn)行表達(dá)，賦予宿主細(xì)胞各種有利的表型。1．質(zhì)粒的類(lèi)型

大腸桿菌中現(xiàn)已找到許多類(lèi)型的質(zhì)粒，其中對(duì)F質(zhì)粒，R質(zhì)粒和Col質(zhì)粒研究的較為清楚。由于這些質(zhì)粒的存在，寄主細(xì)胞獲得了各自不同的性狀特征。簡(jiǎn)介如下：

F質(zhì)粒：又叫F因子或性質(zhì)粒(sexplasmid)。F因子是雄性決定因子，所以F+細(xì)胞又叫雄性細(xì)胞，與此相應(yīng)的F—細(xì)胞則叫做雌性細(xì)胞。F+細(xì)胞的表面可以形成一種叫做性須(pilus)的結(jié)構(gòu)，它促進(jìn)雄性細(xì)胞同雌性細(xì)胞進(jìn)行配對(duì)。在合適的條件下，將雄性細(xì)胞和雌性細(xì)胞混合培養(yǎng)，由于性須的作用，就會(huì)形成雌—雄細(xì)胞配對(duì)。我們稱(chēng)這種過(guò)程為細(xì)菌的接合作用(conjugation)。在雌雄細(xì)胞配對(duì)期間，雄性細(xì)胞中的F因子按滾環(huán)復(fù)制模式，經(jīng)性須作用進(jìn)入到雌性細(xì)胞。配對(duì)之后F—受體細(xì)胞獲得了F因子，也變成為F+細(xì)胞。F因子不但能夠通過(guò)接合作用實(shí)現(xiàn)自我轉(zhuǎn)移，而且還能夠帶動(dòng)寄主染色體一道轉(zhuǎn)移。由F因子整合到染色體而成的Hfr細(xì)胞（高頻重組細(xì)胞），就有可能引發(fā)寄主染色體發(fā)生高頻轉(zhuǎn)移。但F因子的這種整合作用是一種可逆的過(guò)程，因此在一定的條件下，Hfr細(xì)胞又可重新變成F+或F′細(xì)胞。

R質(zhì)粒：也稱(chēng)抗藥性因子。R質(zhì)粒編碼一種或數(shù)種抗菌素抗性基因，此種抗性通常能轉(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的受體細(xì)胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力Col質(zhì)粒：此類(lèi)質(zhì)粒編碼有控制大腸桿菌素合成的基因，即所謂產(chǎn)生大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是一種毒性蛋白，它可以使不帶Col質(zhì)粒的親緣關(guān)系密切的細(xì)菌菌株致死。根據(jù)質(zhì)粒DNA中是否含有接合轉(zhuǎn)移基因，可以分成兩大類(lèi)群。即接合型質(zhì)粒和非接合型質(zhì)粒。接合型質(zhì)粒亦稱(chēng)自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒，這類(lèi)質(zhì)粒除含有自我復(fù)制基因外，還帶有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，如F質(zhì)粒，部分R質(zhì)粒和部分Col質(zhì)粒。非接合型質(zhì)粒亦稱(chēng)不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒，此類(lèi)質(zhì)粒能夠自我復(fù)制，但不含轉(zhuǎn)移基因組，因此這類(lèi)質(zhì)粒不能從一個(gè)細(xì)胞自我轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。從基因工程的安全角度講，非接合型質(zhì)粒用作克隆載體更為合適。2．質(zhì)粒的復(fù)制類(lèi)型

一種質(zhì)粒在一個(gè)細(xì)胞中存在的數(shù)目，稱(chēng)為質(zhì)粒的拷貝數(shù)。根據(jù)宿主細(xì)胞所含拷貝數(shù)的多少，可把質(zhì)粒分成兩種不同的復(fù)制型。一種是低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，稱(chēng)“嚴(yán)緊型”復(fù)制控制的質(zhì)粒(stringentplasmid)，此類(lèi)質(zhì)粒每個(gè)宿主細(xì)胞僅含1~3份的拷貝。另一類(lèi)是高拷貝數(shù)的“松弛型”復(fù)制控制的質(zhì)粒(relaxedplasmid)，這類(lèi)質(zhì)粒每個(gè)宿主細(xì)胞可達(dá)到10~60份拷貝。

一種質(zhì)粒究竟是屬于嚴(yán)緊型還是松弛型并不是絕對(duì)的，這往往同宿主的狀況有關(guān)。同一質(zhì)粒在不同的宿主細(xì)胞中可能具有不同的復(fù)制型，這說(shuō)明質(zhì)粒的復(fù)制不僅受自身的制約，同時(shí)還受到宿主的控制。

在一般情況下，質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力與復(fù)制型及分子大小間有一定的相關(guān)性?，F(xiàn)歸納如下：

分子量大

分子量小

接合型質(zhì)粒

拷貝數(shù)少

非接合型質(zhì)粒

拷貝數(shù)多

嚴(yán)緊型復(fù)制

松弛型復(fù)制3．質(zhì)粒的不親和性

在沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存，這一現(xiàn)象稱(chēng)為質(zhì)粒的不親和性(plasmidincompatibility)，也稱(chēng)不相容性。例如colEI派生質(zhì)粒，它們之間是互不相容的，也就是說(shuō)，這些親緣關(guān)系較近的不同質(zhì)粒，當(dāng)兩種進(jìn)入同一細(xì)胞后，必定有一種在細(xì)胞的增殖過(guò)程中，被逐漸排斥(稀釋)掉。稱(chēng)這些質(zhì)粒間是不相容的。

彼此不相容的質(zhì)粒屬于同一個(gè)不親和群Gneompatiblitygroup)。而彼此能夠共存的親和質(zhì)粒，則屬于不同的不親和群。大腸桿菌質(zhì)?，F(xiàn)已鑒別出25個(gè)以上的不親和群。它們之間是相容的，而同一個(gè)不親和群內(nèi)的質(zhì)粒是不相容的。(二)質(zhì)粒載體的基本條件以上討論的都是天然質(zhì)粒，天然質(zhì)粒的研究在理論上和遺傳學(xué)等方面作出了貢獻(xiàn)，但它很難直接作為基因工程的運(yùn)載體應(yīng)用。質(zhì)粒載體絕大多